專利名稱：一種利用est微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別西花薊馬的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別西花薊馬的引物及方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
西花薊馬(Frankliniella occidentalis)是一種世界性入侵害蟲。除對植物造成危害外，還傳播多種植物病毒，給花卉、農(nóng)作物造成嚴(yán)重?fù)p失。西花薊馬已廣泛分布于美國、荷蘭、日本等60多個(gè)國家和地區(qū)。在我國于2000年首次在云南省昆明國際花卉節(jié)參展的緬甸盆景上截獲該蟲，2003年在北京溫室的辣椒上首次發(fā)現(xiàn)其危害，隨后在云南、山東、江蘇等地陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。西花薊馬與其他薊馬混合發(fā)生，若蟲期形態(tài)相似，不易區(qū)分。有效區(qū)分西花薊馬是防治該蟲的前期和基礎(chǔ)，其對于西花薊馬的綜合防控具有重要的理論意義和指導(dǎo)價(jià)值。EST來自轉(zhuǎn)錄區(qū)，其保守性較高，在家族和種屬間的通用性比來源于非表達(dá)序列的標(biāo)記更高，另外還具有開發(fā)簡單、快捷、費(fèi)用低等特點(diǎn)。EST微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物、動物、微生物以及昆蟲的物種檢測與鑒定、遺傳分化鑒定等方面。但利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建區(qū)分西花薊馬的方法目前還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別西花薊馬的引物及方法?！N利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別西花薊馬的引物,所述引物為一對,分別為SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。正義引物EST-F:5，-CTGCCTTTTCCCTTGAT-3，；SEQ ID N0.1反義引物EST-R:5’ -TGGATTTTCTTTACTTTGGT’ ；SEQ ID N0.2一種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別西花薊馬的方法，步驟如下:(I)提取待鑒定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液；(2)以步驟(I)制得的基因組DNA為模板，利用上述引物對基因組DNA中的線粒體COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)對步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有234bp的一條條帶時(shí)，則該被檢測樣品為西花薊馬；iPCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示無234bp的條帶時(shí)，則該被檢測樣品不是西花薊馬。所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為:基因組DNA 溶液 2.5μ 1，20μΜ 引物 0.5μ l，5U/y I Taq 酶 0.25 μ 1，IOXTaqBuffer (緩沖液)2.5 μ 1，IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 補(bǔ)至 25 μ I ；所述步驟( 2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下:94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7分鐘。上述步驟(I)中提取薊馬基因組DNA和步驟(3)中瓊脂糖凝膠電泳分析均按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作。上述實(shí)驗(yàn)步驟如無特別說明均可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(北京:科學(xué)出版社，2002)。有益效果1、本發(fā)明所述鑒別西花薊馬的引物能夠擴(kuò)增薊馬基因組DNA中的核基因，為鑒定西花薊馬與其他薊馬提供了簡便穩(wěn)定的分子標(biāo)記，解決了區(qū)分西花薊馬的難題。2、本發(fā)明從分子水平探索了西花薊馬與其他薊馬EST序列的不同，探索建立了西花薊馬的鑒別技術(shù)，為今后西花薊馬的種群動態(tài)鑒定、生物學(xué)以及入侵機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。



圖1是實(shí)施例1中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中A、花薊馬，B、黃胸薊馬，C、棕櫚薊馬，D、西花薊馬，M:DL2000DNA Marker。圖2是實(shí)施例2中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中A、西花薊馬，B、花薊馬C、黃胸薊馬，D、棕櫚薊馬，M:DL2000DNA Marker。圖3是實(shí)施例3中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中A、花薊馬，B、黃胸薊馬，C、掠桐薊馬，D、西花薊馬，M:DL2000DNA Marker。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例1、2中所述薊馬于2011年采集于山東省濟(jì)南市；按照(PC Brunner etal.,2002.A molecular identification key for economically important thripsspecies (Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong and a PCR-RFLP-basedapproach.Agricultural and Forest Entomology, 4 (2): 127-136.)中記載的方法對上述薊馬進(jìn)行檢測，采集于山東省濟(jì)南市的薊馬分別為花薊馬、黃胸薊馬、棕櫚薊馬、西花薊馬。實(shí)施例3中所述薊馬于2011年采集于山東省青島市；按照(PC Brunner etal.,2002.A molecular identification key for economically important thripsspecies (Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong and a PCR-RFLP-basedapproach.Agricultural and Forest Entomology, 4 (2): 127-136.)中記載的方法對上述薊馬進(jìn)行檢測，采集于山東省青島市的薊馬分別為花薊馬、黃胸薊馬、棕櫚薊馬、西花薊馬。實(shí)施例所述TriS-HCl、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉均購自上海生物工程公司，其它試劑均為普通市售產(chǎn)品。實(shí)施例1(I)薊馬基因組DNA的提取將單頭待鑒定樣品置于含60 μ I堿裂解液的0.2ml的離心管中，堿裂解液為:50mmol.L^1Tris-HCl (ρΗ8.0)、20mmol.L-1NaCUlmmol.L-1EDTA (乙二胺四乙酸)、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)，用封口槍頭充分研磨勻漿后，置于水浴鍋65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，制得基因組DNA溶液。(2)薊馬COI基因的PCR擴(kuò)增以步驟(I)制得的基因組DNA溶液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增體系為:基因組DNA 溶液:3μ I ;20μΜ 引物:0.5μ I ;5υ/μ I Taq 酶:0.5μ I ;10XTaqBuffer:5 μ I ；10mM dNTP:1 μ I ；ddH20 補(bǔ)至 50 μ I ;引物序列如下:正義引物EST-F:5，-CTGCCTTTTCCCTTGAT-3，；SEQ ID N0.1反義引物EST-R:5，-TGGATTTTCTTTACTTTGGT，；SEQ ID N0.2PCR擴(kuò)增條件如下:94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7分鐘。(3)用2被％瓊脂糖凝膠電泳對步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。經(jīng)多個(gè)待鑒定樣品檢測，只有西花薊馬檢測出一長度在234bp的條帶(如圖1所示)，花薊馬、黃胸薊馬、棕櫚薊馬中均未檢測出長度在234bp條帶，經(jīng)檢測，序列如SEQ ID N0.3所示。實(shí)施例2一種鑒別西花薊馬的方法，步驟如下:(I)將采集于山東省濟(jì)南市的`單頭薊馬個(gè)體置于含60μ I堿裂解液的0.2ml的離心管中，喊裂解液為:50mmol.L 1Tris-HCl (pH8.0)、20mmol.L 1NaCl、lmmol.L 1EDTA'1%SDS，用封口槍頭充分研磨勻漿后，置于水浴鍋65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，得基因組DNA溶液；(2)以步驟(I)制得的基因組DNA為模板，對基因組DNA中的EST序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增體系為:基因組DNA 溶液 2μ 1，20μΜ 弓 I 物 0.5 μ l,5U/y ITaq 酶 0.25 μ 1，IOXTaqBuffer2.5 μ 1，IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 補(bǔ)至 25 μ I ；引物序列如下:正義引物EST-F:5，-CTGCCTTTTCCCTTGAT-3，；SEQ ID N0.1反義引物EST-R:5’ -TGGATTTTCTTTACTTTGGT’ ；SEQ ID N0.2PCR擴(kuò)增條件如下:94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7分鐘。(3)用2wt%的瓊脂糖凝膠電泳分離步驟(2)制得的酶切產(chǎn)物，EB染色后在紫外凝膠成像儀上成像，觀察其多態(tài)性。結(jié)果顯示，成像膠片上有一條片段長度234bp的條帶，該薊馬為西花薊馬；其他3種薊馬在成像膠片上均無234bp的條帶，結(jié)果如圖2所示。與按照(PC Brunner et al., 2002.A molecular identification key for economicallyimportant thrips species (Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong anda PCR-RFLP-based approach.Agricultural and Forest Entomology,4(2):127-136.)中記載的方法進(jìn)行檢測的結(jié)果一致。實(shí)施例3如實(shí)施例2所述的鑒別西花薊馬的方法，不同之處在于，所述薊馬于2011年采集于山東省青島市。 結(jié)果顯示，成像膠片上有一條片段長度234bp的條帶，該薊馬為西花薊馬；其他3種薊馬在成像膠片上均無234bp的條帶，結(jié)果如圖3所示。與按照(PC Brunner etal.,2002.A molecular identification key for economically important thripsspecies (Thysanoptera:Thripidae)usiong direct sequenciong and a PCR-RFLP-basedapproach.Agricultural and Forest Entomology, 4 (2): 127-136.)中記載的方法進(jìn)行檢測的結(jié)果一致。·
權(quán)利要求
1.一種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別西花薊馬的引物，所述引物為一對，分別為SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
2.一種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別西花薊馬的方法，其特征在于，步驟如下 (1)提取待鑒定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液； (2)以步驟(I)制得的基因組DNA為模板，利用上述引物對基因組DNA中的線粒體COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)對步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有234bp的一條條帶時(shí)，則該被檢測樣品為西花薊馬；iPCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示無234bp的條帶時(shí)，則該被檢測樣品不是西花薊馬。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為 基因組 DNA 溶液 2. 5 μ 1，20 μ M 引物 O. 5 μ l,5U/y I Taq 酶 O. 25 μ 1，IOXTaq 緩沖液2· 5 μ 1，IOmM dNTPO. 5 μ 1，ddH20 補(bǔ)至 25 μ I ；
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下 ·94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；·72 °C延伸7分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別西花薊馬的引物及方法，步驟如下(1)提取薊馬基因組DNA；(2)以薊馬基因組DNA為模板對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)對步驟(2)制得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。本發(fā)明所述的鑒別方法，為篩選西花薊馬與其他3種薊馬提供了簡便穩(wěn)定的分子標(biāo)記，為今后的西花薊馬的種群動態(tài)鑒定、生物學(xué)以及入侵機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/11GK103255223SQ201310192769
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月22日
發(fā)明者褚棟, 陶云荔, 國棟 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)