本發(fā)明涉及化合物提取分離領(lǐng)域，特別涉及一種野八角新苯甲酸衍生物及其制備方法、應(yīng)用和藥物組合物。

背景技術(shù)：

野八角（Iliicium simonsii Maxim）為八角屬（Illicium L.）植物，產(chǎn)于我國貴州西北部至西南部、四川和云南以及印度、緬甸。葉、果實(shí)入藥，味辛，性熱；有鎮(zhèn)嘔、行氣止痛、生肌接骨、滅虱殺蟲之效，可治胃寒作嘔、膀胱疝氣、胸前脹痛、疥瘡等功效。

腦卒中（cerebral apoplexy）是導(dǎo)致全球人類致殘的首要病因，全球第二大死因。在一些國家和城市，卒中甚至已經(jīng)超過心血管病，成為第一位死因。根據(jù)中國生物技術(shù)發(fā)展中心抽樣調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示，中國城鄉(xiāng)腦血管病的年發(fā)病率平均為200/10萬，患病率為400~700/10萬，全國每年新發(fā)腦血管病病例250 萬，死亡率為130/10萬，是我國人口總死亡第二位原因，在北京已經(jīng)超過心血管疾病和腫瘤，成為第一位死亡原因。全國每年用于治療腦血管病的費(fèi)用達(dá)100億元以上，加上間接經(jīng)濟(jì)損失超過200億元。由此可見，腦血管病已經(jīng)成為嚴(yán)重影響我國民生的重要公共衛(wèi)生問題。2010年世界卒中日發(fā)布的主題是“六分之一”， 即全世界每6個(gè)人中有1人可能在一生中罹患卒中；每6s就有1人死于卒中；而每6min就有1人因卒中而永久致殘。腦卒中是當(dāng)今世界重大疾病之一。來源于中草藥的有效成分是抗腦卒中新藥的研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

野八角乙醇提取物具有神經(jīng)保護(hù)作用，從有效部位中分離得到1個(gè)新苯甲酸衍生物，藥效學(xué)評(píng)價(jià)顯示其具有很好的神經(jīng)保護(hù)的作用。

本發(fā)明目的之一在于提供了一個(gè)新苯甲酸衍生物。

本發(fā)明目的之二在于提供了新苯甲酸衍生物的制備方法。

本發(fā)明目的之三在于提供了一種新苯甲酸衍生物在制備預(yù)防或治療腦血管疾病的藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明目的之四在于提供一種藥物組合物，其含有新苯甲酸衍生物。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：野八角新苯甲酸衍生物具有化合物1所示結(jié)構(gòu)

1。

野八角新苯甲酸衍生物制備方法，每制備化合物1，5 mg包括以下步驟：

a.干燥的野八角果實(shí)10.50 kg，粉碎，用95% EtOH 80 L浸泡2 h后，加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，提取液減壓濃縮，得到261.2 g浸膏；

b.將浸膏溶解于甲醇中，吸附于500 g硅藻土，干燥，裝入索氏提取器，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇索氏回流提??；

c.各提取液分別減壓濃縮得石油醚部位44.2 g，乙酸乙酯部位75.0 g和甲醇部位133.6 g；

d.對(duì)乙酸乙酯部位用二氯甲烷-甲醇（二氯甲烷:甲醇= 50:1；25:1；10:1；5:1；2:1；1:1；0:100）梯度洗脫分離得到流份Fr1-Fr7；

e.對(duì)Fr4(8g)通過中壓柱色譜法（10 – 90 %的甲醇梯度洗脫10小時(shí)）分為50個(gè)流份（500 ml為1份），通過制備液相從Fr.10得到一個(gè)新苯甲酸衍生物類化合物1（5mg）。

化合物1在制備預(yù)防或治療腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。所述腦血管疾病藥物為神經(jīng)保護(hù)藥物。所述腦血管疾病為腦卒中、癡呆、神經(jīng)炎癥、重金屬中毒、神經(jīng)毒劑中毒。所述腦卒中為缺血性腦卒中或出血性腦卒中。

一種藥物組合物，其中，含有權(quán)利要求1中所示的化合物以及藥效學(xué)上可接受的載體。

根據(jù)本發(fā)明的思路，對(duì)野八角新苯甲酸衍生物進(jìn)行了神經(jīng)保護(hù)相關(guān)的藥理實(shí)驗(yàn)。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡丟失的重要原因，是缺血性腦卒中的特征。引起氧化應(yīng)激的原因有很多種，如腦缺血，神經(jīng)炎癥，興奮性遞質(zhì)釋放重?cái)z取機(jī)制障礙，重金屬暴露，神經(jīng)毒性劑暴露等，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)自由基增加，引起脂質(zhì)過氧化，線粒體功能障礙繼而激活凋亡通路等。谷氨酸，H₂O₂雖然引發(fā)神經(jīng)元凋亡丟失的機(jī)制不一，但都是近年來許多國內(nèi)外學(xué)者倡導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型的誘發(fā)劑。研究認(rèn)為，腦內(nèi)興奮性遞質(zhì)谷氨酸過量通常引起神經(jīng)元膜上NMDA受體過度激活，從而導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激并丟失，而H₂O₂是一種過氧化物，以其誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型為基礎(chǔ)，揭示了臨床有效的藥物作用機(jī)制，可作為體外篩選抗氧化藥物的一種可靠的藥理細(xì)胞模型，其發(fā)生機(jī)制，病理生理改變與腦卒中患者腦內(nèi)表現(xiàn)具有相似性。應(yīng)用谷氨酸，H₂O₂制作神經(jīng)元損傷模型條件要求低，技術(shù)易于掌握，可靠性強(qiáng)，重復(fù)性好，因此在本研究中，H₂O₂損傷原代神經(jīng)元模型、谷氨酸誘導(dǎo)原代神經(jīng)元凋亡模型2個(gè)體外模型作為評(píng)價(jià)手段。

新苯甲酸衍生物在體外谷氨酸，H₂O₂誘發(fā)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元死亡的試驗(yàn)中均顯示出優(yōu)良的神經(jīng)保護(hù)作用。

陽性對(duì)照藥物為依達(dá)拉奉（edaravone），依達(dá)拉奉是以自由基清除為主要作用機(jī)制的神經(jīng)保護(hù)藥物，能有效抑制因腦缺血導(dǎo)致的腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

對(duì)H₂O₂誘發(fā)大鼠大腦皮層神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用體外研究中，將本發(fā)明化合物與依達(dá)拉奉（300μM）用神經(jīng)元培養(yǎng)基稀釋，和大鼠大腦皮層神經(jīng)元溫孵24小時(shí)后，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，同時(shí)進(jìn)行正常對(duì)照組和陽性對(duì)照組試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對(duì)照組加入H₂O₂后570 nm處吸光度值（OD₅₇₀）明顯降低，陽性對(duì)照組和本發(fā)明化合物OD₅₇₀明顯回升，與依達(dá)拉奉（edaravone）的細(xì)胞存活率相當(dāng)，新化合物組的細(xì)胞存活率與依達(dá)拉奉組相當(dāng)。

對(duì)谷氨酸誘發(fā)大鼠大腦皮層神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用體外研究中，將本發(fā)明化合物與谷氨酸（20 mM）用完全培養(yǎng)基稀釋，和大鼠大腦皮層神經(jīng)元溫孵24小時(shí)后，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，同時(shí)進(jìn)行正常對(duì)照組和陽性對(duì)照組試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對(duì)照組加入谷氨酸后570 nm處吸光度值（OD₅₇₀）明顯降低，陽性對(duì)照組和本發(fā)明化合物OD₅₇₀明顯回升，與依達(dá)拉奉（edaravone）的細(xì)胞存活率相當(dāng)，新化合物組的細(xì)胞存活率與依達(dá)拉奉組相當(dāng)。

本發(fā)明的有益效果：化合物1體現(xiàn)了神經(jīng)保護(hù)活性，即在H₂O₂ 損傷原代神經(jīng)元模型中均具有良好的神經(jīng)保護(hù)活性，其活性優(yōu)于依達(dá)拉奉。因此本發(fā)明的化合物在可用于制備預(yù)防或治療腦血管疾病的藥物。優(yōu)選的神經(jīng)退行性疾病選自腦卒中、癡呆、神經(jīng)炎癥、重金屬中毒、神經(jīng)毒劑中毒。優(yōu)選的腦卒中選缺血性腦卒中和出血性腦卒中。

附圖說明

圖1 野八角果實(shí)的提取流程圖。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例及藥理活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。

實(shí)施例1：野八角新苯甲酸衍生物制備方法，每制備化合物1，5 mg包括以下步驟：提取分離實(shí)驗(yàn)（見附圖1）干燥的野八角果實(shí)10.50 kg，粉碎，用95% EtOH 80 L浸泡2 h后，加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，提取液減壓濃縮，得到261.2 g浸膏。將浸膏溶解于甲醇中，吸附于500 g硅藻土，干燥，裝入索氏提取器，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇索氏回流提取。各提取液分別減壓濃縮得石油醚部位44.2 g，乙酸乙酯部位75.0 g和甲醇部位133.6 g。對(duì)乙酸乙酯部位用二氯甲烷-甲醇（二氯甲烷:甲醇= 50:1；25:1；10:1；5:1；2:1；1:1；0:100）梯度洗脫分離得到流份Fr1-Fr7。對(duì)Fr4(8g)通過中壓柱色譜法（10 – 90 %的甲醇梯度洗脫10小時(shí)）分為50個(gè)流份（500 ml為1份），通過制備液相從Fr. 10得到一個(gè)新苯甲酸衍生物（5mg）。

實(shí)施例2：化合物1在制備預(yù)防或治療腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。所述腦血管疾病藥物為神經(jīng)保護(hù)藥物。所述腦血管疾病為腦卒中、癡呆、神經(jīng)炎癥、重金屬中毒、神經(jīng)毒劑中毒。所述腦卒中為缺血性腦卒中或出血性腦卒中。

新苯甲酸衍生物的理化、波譜數(shù)據(jù)如下:為無色油狀物; [α]²⁰_D +50.6(c 0.50 MeOH); UV (MeOH) λ_max (logε): 254 (3.24); IR光譜給出羥基 (3383 cm^-1) 和羧基(1693 cm^-1) 等官能團(tuán)的振動(dòng)吸收; ESIMS m/z 289 [M + Na]⁺; HRESIMS m/z 289.1412 [M + Na]⁺ (calcd for C₁₅H₂₂NaO₄, 289.1410)。¹H-NMR (CD₃OD, 500 MHz) 和¹³C-NMR (CD₃OD，125 MHz）見下表

表 1¹H and ¹³C NMR data of compound 1 in CD₃OD

藥理實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)材料 1、受試藥：本發(fā)明單體化合物。2、陽性對(duì)照藥：依達(dá)拉奉，由中國食品藥品檢定研究院提供。HPLC檢測(cè)純度 >98%。3、細(xì)胞：出生當(dāng)天大鼠大腦皮層神經(jīng)元。4、培養(yǎng)基：DMEM，F(xiàn)BS，美國Gibco公司生產(chǎn)；ES，美國Hyclone公司生產(chǎn)。5、H₂O₂由和谷氨酸由北京化工廠提供。

本發(fā)明化合物對(duì)大鼠大腦皮層神經(jīng)元存活狀態(tài)的影響以及在H₂O₂誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡模型中的保護(hù)作用。

化合物對(duì)神經(jīng)元存活狀態(tài)的影響研究中，將原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元 (DIV-9)分為對(duì)照組和給藥組 (10 μM)，n=6；在化合物對(duì)H₂O₂誘發(fā)神經(jīng)元凋亡模型的保護(hù)作用研究中，將原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元 (DIV-7)分為對(duì)照組，H₂O₂ (300μM)造模組，H₂O₂ (300μM)+依達(dá)拉奉 (100 μM)給藥組，H₂O₂ (300μM)+化合物 (10μM)給藥組，n=6。給藥后，細(xì)胞置于細(xì)胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，MTT法 (570nm)測(cè)定細(xì)胞存活率。以對(duì)照組吸光度為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組吸光度與對(duì)照組的比值。

化合物在谷氨酸誘發(fā)的大鼠皮層神經(jīng)元凋亡模型中的保護(hù)作用

將原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元 (DIV-9)分為對(duì)照組，谷氨酸 (20 mM)造模組，谷氨酸 (20 mM)+依達(dá)拉奉 (100 μM)給藥組，谷氨酸 (20 mM)+化合物 (10 μM)給藥組，n=6，于細(xì)胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。以對(duì)照組吸光度為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組吸光度與對(duì)照組的比值。

表2化合物對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元存活狀態(tài)的影響

表3 新化合物在H₂O₂和谷氨酸誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型中的神經(jīng)保護(hù)作用

注：* p<0.05 vs mod，** p<0.01 vs mod，*** p<0.001vs mod，## P ＜ 0.01vs control.

實(shí)施例3：一種藥物組合物，其中，含有權(quán)利要求1中所示的化合物以及藥效學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明還涉及以本發(fā)明化合物作為活性成分的藥物組合物。該藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備?？赏ㄟ^將本發(fā)明化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成適于人或動(dòng)物使用的任何劑型。本發(fā)明化合物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95重量%。

本發(fā)明的化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜、直腸等。

給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w 型、w/o 型和復(fù)乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑( 包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉) 霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。

本發(fā)明的化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。

為了將本發(fā)明化合物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。

還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。

為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發(fā)明化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆?；蛭⑼?，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明化合物的膠囊劑。

為將本發(fā)明化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、pH 調(diào)劑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環(huán)糊精等；pH 調(diào)劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。

此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。

為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。

本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量依照所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的個(gè)體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍為0.001-150mg/Kg 體重，優(yōu)選為0.1-100mg/Kg 體重，更優(yōu)選為1-60mg/Kg 體重，最優(yōu)選為2-30mg/Kg 體重。上述劑量可以一個(gè)劑量單位或分成幾個(gè)劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。

本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。當(dāng)本發(fā)明的化合物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整它的劑量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)已經(jīng)鑒定的化合物進(jìn)了初步的細(xì)胞模型篩選，化合物1體現(xiàn)了神經(jīng)保護(hù)活性，即在H₂O₂ 損傷原代神經(jīng)元模型中均具有良好的神經(jīng)保護(hù)活性，其活性優(yōu)于依達(dá)拉奉。

以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。