載脂蛋白II/I及其制備方法、生物學功能及應用與流程
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術領域，涉及載脂蛋白II/I的結(jié)構及其獲得方法、新生物學功能以及在生物醫(yī)藥領域中的應用。具體地說，本發(fā)明涉及載脂蛋白II/I及其活性片段的結(jié)構及其制備生產(chǎn)方法與功能，以及其在微生物及其相關分子模式檢測診斷、促進昆蟲血淋巴黑色素產(chǎn)生、誘導昆蟲合成抗菌肽等生物醫(yī)藥領域中的應用，制備載脂蛋白II/I與活性片段抗體及其在生物醫(yī)藥領域的應用。
背景技術：
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載脂蛋白是血漿脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分，其基本功能是轉(zhuǎn)運脂類物質(zhì)、穩(wěn)定脂蛋白結(jié)構等。載脂蛋白在人類等哺乳動物中被稱為apolipoprotein(apo)，分為A、B、C、D、E五類。這些載脂蛋白亞型的異常，已經(jīng)被證實與阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化等疾病相關。而在昆蟲中，載脂蛋白被稱為apolipophorin(apoLp)，它們構成了昆蟲脂蛋白的蛋白部分。
昆蟲apoLp-I及apoLp-II來源于同一個mRNA前體apoLp-II/I，并在蛋白的翻譯后修飾及分泌過程中被弗林蛋白酶(Furin)切割形成。而apoLp-II/I的載脂功能并不依賴于這種切割作用。apoLp-II為N端部分、apoLp-I為C端部分，二者參與形成高密度脂蛋白(high-density lipophorin,HDLp)。昆蟲載脂蛋白前體apoLp-II/I與哺乳動物apoB-48同源，兩者均是脂蛋白顆粒中的重要組成部分，在脂類運輸及代謝上起到不可或缺的作用。
ApoLp-II/I與其他家族成員一樣，其N端包含一個較大的LLT結(jié)構域，該結(jié)構域形成一個“l(fā)ipid pocket”樣的結(jié)構，主要參與與脂類的結(jié)合，起到貯存或運輸?shù)淖饔?。除了N端結(jié)構域之外，apoLp-II/I還包含一個DUF1081結(jié)構域，以及靠近C端的von Willebrand factor module D(VWD)結(jié)構域。但這些結(jié)構域的功能目前尚無定論。
對昆蟲apoLp-II/I的研究主要集中在其結(jié)構、生物合成與分泌，以及脂類轉(zhuǎn)運作用等方面。但最新的研究發(fā)現(xiàn)，apoLp-II/I還參與了昆蟲的先天性免疫反應。有報道指出，家蠶apoLp-II/I能夠抑制金黃色葡萄球菌的溶血毒性。純化后的apoLp-II/I能夠降低S.aurues中與溶血素(hemolysin)相關的基因，包括hla，hlb，saeRS以及RNAIII的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，apoLp-II/I是通過與S.aurues細胞表面的LTA結(jié)合，進而通過后者的雙組份系統(tǒng)影響S.aurues的saePQRS操縱子，最終抑制了溶血素的表達及分泌。在岡比亞按蚊中，apoLp-II/I是全身性免疫反應的負向調(diào)控因子。RNA干擾apoLp-II/I后，按蚊的免疫應答程度顯著性提高了。而這種提高作用是補體樣蛋白TEP1(thioester-containing protein 1，硫酯蛋白)依賴性的，干擾apoLp-II/I能夠使TEP1的表達量增高，而后者經(jīng)由JNK通路產(chǎn)生免疫反應。上述例子表明，昆蟲apoLp-II/I不僅參與了脂類的轉(zhuǎn)運和代謝，同時也是一種先天性免疫相關蛋白。
目前尚未見對鱗翅目(Lepidoptera)的天(大)蠶蛾科昆蟲載脂蛋白II/I的結(jié)構、制備、生物學功能及其應用的相關研究。
技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明所解決的技術問題是提供一系列載脂蛋白II/I及其制備方法。
所述的載脂蛋白II/I的氨基酸序列如SEQ ID：2所示；
編碼所述載脂蛋白II/I的氨基酸序列的基因序列如SEQ ID：1所示。
本發(fā)明還提供了所述天然載脂蛋白II/I、重組載脂蛋白II/I活性片段。
所述的載脂蛋白II/I活性片段包括SEQ ID：1或SEQ ID：2所述的序列。
所述的載脂蛋白II/I活性片段的序列如SEQ ID：3-6所示。
本發(fā)明進一步提供了所述天然載脂蛋白II/I，重組載脂蛋白II/I活性片段，以天然載脂蛋白II/I、重組載脂蛋白II/I活性片段作為抗原的抗體在生物領域中的應用，包括1.針對微生物的預防、檢測診斷、治療等生物醫(yī)藥領域應用；2.針對微生物相關分子模式的預防、檢測診斷、治療等生物醫(yī)藥領域應用；3.針對天然載脂蛋白II/I、重組載脂蛋白II/I活性片段的檢測與追蹤等生物醫(yī)藥領域應用；4.通通過其抑制鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲的酚氧化酶原激活系統(tǒng)的激活情況，從而抑制鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲的免疫防御系統(tǒng)，提高鱗翅目的天(大)蠶蛾科昆蟲的抗微生物能力。
本發(fā)明是針對鱗翅目的天(大)蠶蛾科昆蟲體內(nèi)的apoLp-II/I，研究天然apoLp-II/I的制備方法、一級結(jié)構(基因和蛋白質(zhì))、生物學功能以及其應用，利用基因工程技術獲得重組apoLp-II/I活性片段以及其生物學功能和應用。此外，利用天然、重組apoLp-II/I活性片段作為抗原，刺激機體產(chǎn)生抗體，同時研究了該抗體的應用。
本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的：
首先利用蛋白提取、分離、純化技術，從鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲中分離、純化獲得天然apoLp-II/I。其次，利用蛋白質(zhì)化學技術以及分子生物學技術，解析apoLp-II/I的一級結(jié)構(基因和蛋白質(zhì))并獲得其基因。再次，利用基因工程技術，實現(xiàn)apoLp-II/I基因片段在宿主細胞的表達，結(jié)合蛋白提取、分離、純化技術獲得重組apoLp-II/I。同時，利用基因重組技術，獲得apoLp-II/I部分片段。天然、重組apoLp-II/I部分片段，能特異性識別Lys-肽聚糖、DAP-肽聚糖以及脂磷壁酸等多種微生物相關分子模式以及革蘭陽性菌和部分真菌、革蘭陰性菌等微生物。上述結(jié)合，能夠抑制昆蟲體液免疫中的酚氧化酶原激活系統(tǒng)。本發(fā)明的天然、重組apoLp-II/I及其部分片段以及其抗體的生物學功能，可廣泛應用于針對微生物的預防、檢測診斷、治療等生物醫(yī)藥領域。
本發(fā)明的apoLp-II/I，其核苷酸序列如SEQ ID：1，其氨基酸序列如SEQ ID：2所示。
其制備方法如下：
一、天然apoLp-II/I的制備
本發(fā)明所獲得天然apoLp-II/I是通過如下技術方案實現(xiàn)的，包括：
以昆蟲血淋巴作為原料，分別通過親和層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、鹽析、超濾或上述方法的不同組合，分離純化得到不同純度乃至電泳純或HPLC純的apoLp-II/I。
其中，昆蟲血淋巴(簡稱血淋巴)，是昆蟲血液(或血細胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆蟲壓榨或勻漿的體液，用緩沖溶液或酸性溶液或堿性溶液溶解提取，離心除去不溶雜質(zhì)得到的抽提液。
apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件的特征：(1)溶液的酸堿度在pH2～pH10，優(yōu)選pH4-pH9；(2)調(diào)節(jié)溶液酸堿度的化學試劑是常規(guī)、通用的酸或堿及其溶液。酸及其溶液優(yōu)選HCl、HAc、磷酸、檸檬酸、硫酸、硼酸。堿及其溶液優(yōu)選NaOH、KOH、Tris、檸檬酸鈉或鉀鹽、磷酸鈉或鉀鹽、硼砂；(3)緩沖液是常規(guī)、通用緩沖離子對緩沖液，優(yōu)選檸檬酸根緩沖離子對、HCl-Tris緩沖離子對、檸檬酸根-磷酸根緩沖離子對、磷酸根緩沖離子對、醋酸根緩沖離子對、硼酸根緩沖離子對、硼酸-Tris緩沖離子對、上述各緩沖離子的組合；(4)溶液或緩沖液的離子強度在0.001mol/L～0.8mol/L，優(yōu)選0.01mol/L～0.3mol/L。上述條件既不破壞提取、分離、純化所采用介質(zhì)的理化性質(zhì)，又不影響apoLp-II/I的生物活性。
昆蟲血淋巴的收集：將昆蟲用蒸餾水或去離子水反復清洗，采用常規(guī)方法，如蠟盤法、離心法、背血管取血法、灌注法、壓榨、勻漿法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪開法、穿刺法等，在10℃至～5℃條件下收集昆蟲血淋巴。
本發(fā)明的分離分析方法包含如下中的兩種或兩種以上的組合：
1.離子交換層析分離純化apoLp-II/I
取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至要求條件范圍下。將處理好的樣品上樣于預先用緩沖液平衡好的離子交換層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用鹽濃度階段方式，分別用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L鹽溶液進行階段洗脫；也可以采用鹽濃度梯度方式，梯度為0.00mol/L～3mol/L。利用抗apoLp-II/I抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有apoLp-II/I的洗脫液合并儲存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽，或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。
離子交換層析分離純化的特征：(1)層析介質(zhì)選擇陽離子交換層析填料，如CM-離子交換層析填料或SP-離子交換層析填料或S-離子交換層析填料等陽離子交換層析填料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH2-pH7；(2)層析介質(zhì)選擇陰離子交換層析填料，如Q-離子交換層析填料或DEAE-離子交換層析填料或QAE-離子交換層析填料等離子交換層析填料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12；(3)緩沖液及其濃度選擇，按上述APOLP-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(4)洗脫的鹽溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加中性鹽到需要的濃度；(5)中性鹽選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，優(yōu)選NaCl；(6)分離純化操作溫度按上述APOLP-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。上述條件既不影響apoLp-II/I的生物活性，又不影響活性成分的分離純化。
2.親和層析分離純化apoLp-II/I
取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。將處理好的樣品液上樣于預先用緩沖液平衡好的親和層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用鹽(或化學試劑)濃度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽(或化學試劑)階段濃度洗脫方式，分別采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L鹽溶液進行階段方式洗脫。利用抗APOLP-II/I抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有APOLP-II/I的洗脫液合并儲存?zhèn)溆茫灰部梢圆捎贸Ｒ?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽(或化學試劑)或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。
親和層析分離純化的特征：(1)親和填料的配基選擇apoLp-II/I抗體、肝素、刀豆素、甲醛固定后的細菌或真菌、sepharose CL-4B、N-乙酰氨基葡萄糖胺、肽聚糖、脂磷壁酸、葡聚糖等；(2)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按APOLP-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(3)洗脫的鹽(或化學試劑)溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加鹽(或化學試劑)到需要的濃度；(4)洗脫用鹽(或化學試劑)可以選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl或尿素或鹽酸胍；(5)洗脫用鹽(或化學試劑)選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl的最高濃度為3.0mol/L，選擇尿素的最高濃度為8.0mol/L，選擇鹽酸胍的最高濃度為6.0mol/L；(6)如果洗脫用鹽(或化學試劑)選擇了尿素或鹽酸胍而使apoLp-II/I發(fā)生變性作用，可以通過常規(guī)、通用的蛋白質(zhì)復性方法進行復性而獲得apoLp-II/I。
3.疏水層析分離純化apoLp-II/I
取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。加中性鹽至2mol/L濃度，上樣于預先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液平衡的疏水層析柱，先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用中性鹽濃度梯度(2.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽濃度階段洗脫方式，分別采用1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性鹽溶液進行階段方式洗脫。利用抗apoLp-II/I抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有apoLp-II/I的洗脫液合并儲存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。
疏水層析分離純化的特征：(1)疏水層析介質(zhì)選擇苯基-疏水層析填料或正辛烷-疏水層析填料-或己烷-疏水層析填料-或丁烷-疏水層析填料；(2)中性鹽選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl；(3)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。
4.凝膠層析分離純化apoLp-II/I
取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。樣品液上樣于預先用緩沖液平衡好的凝膠過濾層析柱并進行分離純化洗脫，利用抗apoLp-II/I抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有APOLP-II/I的洗脫液合并儲存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。
凝膠層析分離純化的特征：(1)層析介質(zhì)可以選擇Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex 75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR或Superdex Peptide PE等凝膠層析填料；(2)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征，此外洗脫液的濃度，優(yōu)選在離子濃度大于0.15M及以上。
5.鹽析分離純化apoLp-II/I
取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。在樣品溶液中加入蛋白質(zhì)鹽析常規(guī)、通用的中性鹽，至濃度達到apoLp-II/I仍處于溶解狀態(tài)，而一些雜蛋白處于沉淀。離心取其上清溶液繼續(xù)加入鹽析常規(guī)、通用的中性鹽至濃度達到apoLp-II/I沉淀狀態(tài)。離心棄上清，沉淀溶于apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件特征的溶液或緩沖液儲存?zhèn)溆?；沉淀的溶解液，也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去其中的鹽或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。
鹽析分離純化的特征：(1)分離純化的緩沖液、酸堿度選擇，是按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(2)鹽析使用的中性鹽，選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl，優(yōu)選(NH4)2SO4或Na2SO4；(3)在使apoLp-II/I處于溶解狀態(tài)時，選擇中性鹽在5％—45％，優(yōu)選10％—40％；(4)在使apoLp-II/I處于沉淀狀態(tài)時，選擇中性鹽在40％—90％，優(yōu)選45％—75％。
6.超濾分離純化apoLp-II/I以及處理apoLp-II/I溶液
取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)pH至apoLp-II/I的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。利用常規(guī)、通用超濾方法，分離純化apoLp-II/I。一種方案，選擇一定規(guī)格的超濾膜，使apoLp-II/I透過超濾膜，而一些雜蛋白則被超濾膜截留，從而使apoLp-II/I得以分離純化；透過超濾膜的apoLp-II/I溶液，再選擇一定規(guī)格的超濾膜，使apoLp-II/I被截留，而一些雜蛋白則透過超濾膜，從而使apoLp-II/I得以分離純化。另一種方案，是選擇一定規(guī)格的超濾膜，使apoLp-II/I先被超濾膜截留，隨后再選擇一定規(guī)格的超濾膜，使apoLp-II/I透過超濾膜，從而使apoLp-II/I得以分離純化。
超濾處理apoLp-II/I溶液的目的，是除去apoLp-II/I溶液中的鹽或小分子雜質(zhì)或更換緩沖液。此外，對apoLp-II/I溶液進行濃縮。處理方法同上所述，選擇一定規(guī)格的超濾膜，使apoLp-II/I被超濾膜截留，而鹽或小分子雜質(zhì)或緩沖液的緩沖離子對則透過超濾膜，從而實現(xiàn)去除鹽、小分子雜質(zhì)或更換緩沖液或濃縮的目的。
超濾分離純化和處理的特征：透過apoLp-II/I的超濾膜選擇分子量為20kDa或30kDa或40kDa或50kDa或60kDa規(guī)格的超濾膜，優(yōu)選20kDa～50kDa的超濾膜，大于或小于優(yōu)選規(guī)格的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；(2)超濾分離純化或處理的操作溫度、緩沖液及其酸堿度或濃度選擇，是按apoLp-II/I提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。
通過上述任何一種方法所獲得的apoLp-II/I純度，有時無法滿足相應需要。
本發(fā)明是從昆蟲血淋巴中分離純化高純度apoLp-II/I，并可以達到電泳純乃至HPLC純度。其特征在于，將上述六種分離純化方法(離子交換柱層析、親和柱層析、疏水柱層析、凝膠過濾柱層析、鹽析、超濾)，進行兩種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或三種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或四種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或五種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，純化方法自由組合及其順序重排組合，直至樣品純度得到預期要求。
本發(fā)明所指昆蟲是鱗翅目昆蟲，鱗翅目昆蟲優(yōu)選天(大)蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲，選自柞蠶、蓖麻蠶、天蠶、印度柞蠶、琥珀蠶、美國柞蠶、樗蠶、大山蠶、美洲天蠶、樟蠶、楓蠶，昆蟲為任何地域的天然或人工放養(yǎng)或人工飼養(yǎng)的昆蟲。為使本專業(yè)技術人員更全面、清晰理解本發(fā)明，以柞蠶作為代表來描述下面的內(nèi)容，而選擇柞蠶作為代表來描述并不是以任何方式限制本發(fā)明權利要求的范圍。
本發(fā)明所述的載脂蛋白II/I、載脂蛋白II/I活性片段是利用基因工程表達獲得，包括(1)原核生物系統(tǒng)的表達載體，表達宿主細胞為大腸桿菌細胞或枯草桿菌細胞，(2)酵母細胞系統(tǒng)的表達載體，表達宿主細胞為酵母細胞，(3)昆蟲細胞系統(tǒng)的表達載體，表達宿主細胞為昆蟲細胞，(4)哺乳動物細胞系統(tǒng)的表達載體，表達宿主細胞為哺乳動物細胞。上述表達形式為細胞內(nèi)表達或分泌形式表達，上述表達體系中的表達產(chǎn)物作為制備載脂蛋白II/I、載脂蛋白II/I類似物或活性片段的來源。
所述“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞，常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等。
本發(fā)明所指微生物以及其相關分子模式是真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌以及其相關分子模式。為使本專業(yè)技術人員更全面、清晰理解本發(fā)明，以畢赤酵母、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌等作為微生物(真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌)代表來描述下面的內(nèi)容，以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作為微生物相關分子模式代表來描述下面的內(nèi)容，而選擇上述具體的微生物或具體的微生物相關分子模式作為代表來描述并不是以任何方式限制本發(fā)明權利要求的范圍。
二apoLp-II/I結(jié)構解析以及其基因序列解析
按照常規(guī)蛋白質(zhì)化學與分子生物學的技術、方法、手段，對apoLp-II/I進行結(jié)構解析。包括：(1)利用生物質(zhì)譜測定天然apoLp-II/I的分子量；(2)采用常規(guī)蛋白水解酶及其水解條件，針對發(fā)明內(nèi)容所獲得apoLp-II/I進行降解，通過HPLC分離降解片段，利用生物質(zhì)譜或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，從而獲得apoLp-II/I分子內(nèi)許多片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物學技術、方法，從昆蟲脂肪體提取總RNA，利用RACE技術構建昆蟲cDNA pool。根據(jù)目的蛋白降解片段的氨基酸序列，設計引物，PCR擴增片段基因。隨后結(jié)合RACE技術獲得apoLp-II/I基因—cDNA，通過基因序列測定分析獲得其堿基序列并由其開放閱讀框堿基序列推導獲得apoLp-II/I全長一級結(jié)構；(4)利用分子生物學技術、方法等，從昆蟲脂肪體提取其染色體基因。設計PCR擴增上下游引物，以昆蟲染色體基因為模板，PCR擴增apoLp-II/I染色體基因，通過基因序列測定分析獲得apoLp-II/I染色體基因中的內(nèi)含子、外顯子序列；(5)通過上述所獲得apoLp-II/I的分子量、分子內(nèi)部分氨基酸序列、cDNA開放閱讀框序列、染色體基因中的外顯子序列，彼此相互驗證上述結(jié)構信息，獲得apoLp-II/I全長一級結(jié)構序列、天然apoLp-II/I一級結(jié)構序列(參見SEQ ID:1和ID:2)。
三、重組apoLp-II/I活性片段的制備
本發(fā)明還包含具有apoLp-II/I序列的重組apoLp-II/I活性片段。
所述的重組apoLp-II/I活性片段含有apoLp-II序列，包括Met-apoLp-II成熟肽氨基酸序列、Met-組氨酸標簽-apoLp-II成熟肽氨基酸序列、Met-apoLp-II成熟肽-His6標簽氨基酸序列、Met-His6標簽-凝血酶酶切位點-apoLp-II成熟肽氨基酸序列(參見SEQ ID：3-6)。
本發(fā)明的重組apoLp-II/I部分片段通過基因工程表達制備獲得，通過如下技術方案實現(xiàn)，包括：(1)將apoLp-II/I部分片段編碼DNA重組至表達載體；(2)用步驟⑴的重組表達載體轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?原核或真核細胞)；(3)在適合的誘導表達條件下，培養(yǎng)步驟⑵的被轉(zhuǎn)化的宿主細胞；(4)收獲并純化所得到的目的蛋白。
本發(fā)明同時提供上述重組apoLp-II/I部分片段的表達產(chǎn)物分離純化方法?？墒褂名}析沉淀、超濾、親和層析、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾等方法以及上述方法的多種組合，從基因工程細胞的溶胞產(chǎn)物或培養(yǎng)液中分離并純化所需的表達產(chǎn)物。在表達產(chǎn)物的分離和純化過程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法(Western)檢測表達產(chǎn)物的存在及相應分子大小。
四、apoLp-II/I及其部分片段的生物學功能及其應用
本發(fā)明再一個目的是針對天然、重組apoLp-II/I部分片段的體外結(jié)合特異性、對微生物的結(jié)合與凝集作用以及對激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)的激活情況、對抗菌肽合成的激活作用的對比，確定了天然、重組apoLp-II/I部分片段的生物活性。同時，考察apoLp-II/I在機體免疫應答過程的表達，也研究了天然、重組APOLP-II/I部分片段的應用。
此外，本發(fā)明也研究了天然、重組apoLp-II/I及其部分片段作為抗原刺激機體產(chǎn)生抗體、抗體的制備以及其應用。
本發(fā)明所述的天然、重組apoLp-II/I及其部分片段獲得方法常規(guī)、簡單、產(chǎn)量高。
附圖說明：
圖1為分離純化天然apoLp-II/I電泳圖譜
A：實施例1中方法-1分離獲得天然apoLp-II/I的電泳圖譜；
B：實施例1中方法-2分離獲得天然apoLp-II/I的電泳圖譜；
C：實施例1中方法-3分離獲得天然apoLp-II/I的電泳圖譜。
圖2為分離純化重組apoLp-II/I部分片段(原核表達體系)電泳圖譜
泳道1：實施例3中方法-(1)所獲得重組apoLp-II/I部分片段的電泳圖譜；
泳道2：實施例3中方法-(2)所獲重組apoLp-II/I部分片段的電泳圖譜；
泳道3：實施例3中方法-(3)所獲重組apoLp-II/I部分片段的電泳圖譜。
圖3為分離純化重組apoLp-II/I部分片段(真核表達體系)電泳圖譜
泳道1：實施例4中方法-(1)所獲重組apoLp-II/I部分片段的電泳圖譜；
泳道2：實施例4中方法-(2)所獲重組apoLp-II/I部分片段的電泳圖譜。
圖4為天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段的生物學活性
4-A：實施例6中天然apoLp-II/I與微生物的結(jié)合特異性；
4-B：實施例6中天然apoLp-II/I與微生物相關分子模式的結(jié)合特異性；
4-C：實施例6中重組apoLp-II/I部分片段與微生物的結(jié)合特異性；
4-D：實施例6中apoLp-II/I的表達量與先天性免疫的相關性；
4-E：實施例6中體外抑制天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段活性對酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響；
4-F：實施例6中體內(nèi)干擾apoLp-II/I表達對酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響。
具體實施方式：
下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明權利要求的范圍。
實施例1
天然apoLp-II/I的分離純化
1.方法1
收取血淋巴，12000×g離心后取上清。進行40％硫酸銨沉淀；離心取沉淀用50mM檸檬酸緩沖溶液pH5.2，100mM NaCl,5％甘油進行復溶；離心后取上清，過Sephacryl S-200柱，收集含有目的蛋白的流出組分；該組分用50mM PB pH8.0透析后，經(jīng)HiTrapTM SP柱以0-1M NaCl梯度洗脫，收集含目的蛋白的流出組分。
試驗結(jié)果如圖1-A泳道7，其中箭頭1所指為載脂蛋白I、箭頭2所指為載脂蛋白II，天然apoLp-II/I的純度達到電泳純。
2.方法2
柞蠶血淋巴使用70％硫酸銨沉淀，然后于4℃，8000×g離心15min。棄上清沉淀用50mM MES，200mM NaCl，2mM DTT，5％甘油，pH6.2復溶并透析。透析后樣品過磷酸纖維素柱，用200mM-600mM NaCl梯度洗脫，收集含目的蛋白的組分。上述組分用50mM MES，100mM NaCl，2mM DTT，5％甘油，pH6.2透析，透析后樣品于4℃，8000×g離心15min。除去沉淀。上清組分過Mono S柱，用150mM-600mM NaCl梯度洗脫，收集含目的蛋白組分上述組分過SuperdexTM 200柱(50mM MES，200mM NaCl，2mM DTT，5％甘油，pH6.2)，收集含目的蛋白組分。
試驗結(jié)果如圖1-B泳道4，其中箭頭1所指為載脂蛋白I、箭頭2所指為載脂蛋白II，天然apoLp-II/I的純度達到電泳純。
3.方法3
柞蠶血淋巴使用70％硫酸銨沉淀，然后于4℃，8000×g離心15min。棄上清沉淀用磷酸鹽緩沖溶液復溶，上羥基磷灰石柱，用磷酸根離子梯度洗脫，收集含目的蛋白組分；上述組分用磷酸鹽緩沖溶液透析，上陰離子交換柱HiTrapTM Q，使用NaCl濃度梯度進行洗脫，收集含目的蛋白組分；上述組分添加(NH4)2SO4至濃度為2M，上苯基疏水柱，使用(NH4)2SO4濃度降低梯度進行洗脫，收集含目的蛋白組分；上述組分上凝膠過濾柱Sephacryl S-100，收集含目的蛋白組分。
試驗結(jié)果如圖1-C泳道5，其中箭頭1所指為載脂蛋白I、箭頭2所指為載脂蛋白II，天然apoLp-II/I的純度達到電泳純。
實施例2：
apoLp-II/I結(jié)構解析以及其基因序列解析
按照常規(guī)蛋白質(zhì)化學與分子生物學的技術、方法、手段，對apoLp-II/I進行結(jié)構解析。具體方法、手段按照發(fā)明內(nèi)容二中所列內(nèi)容實施。
獲得apoLp-II/I完整核苷酸序列及其氨基酸序列(如SEQ ID:1和ID:2所示)。
實施例3：
利用原核生物表達系統(tǒng)獲得重組apoLp-II/I活性片段
本實施例列舉描述原核生物表達系統(tǒng)表達本發(fā)明apoLp-II/I活性片段基因的構建策略和基本方法。
原核生物表達系統(tǒng)的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略，均為基因工程表達的常規(guī)、通用的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略。
本實施是為使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權利要求的范圍。
對于表達產(chǎn)物的分離純化方法，是采用實施例1的方法、原理、策略等。
1.apoLp-II/I活性片段的表達載體構建
根據(jù)天然apoLp-II/I中N末端apoLp-II的氨基酸序列，分別設計相應寡核苷酸引物，同時在上述兩個寡核苷酸引物的5′端，分別加上限制性核酸內(nèi)切酶水解位點序列；以昆蟲脂肪體cDNA pool為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并進行核酸片段的凝膠回收；經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶酶切后與同樣進行雙酶切表達質(zhì)粒，在DNA連接酶的作用下進行重組連接，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞；經(jīng)過菌落PCR和限制性核酸內(nèi)切酶酶切驗證篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子后提交生物技術服務公司進行DNA序列測定。通過上述基因工程的方法，構建apoLp-II基因的表達載體。
本實施例表達載體構建的特征：1。以大腸桿菌為宿主，表達載體可選擇pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在apoLp-II的N端前融合一段肽段作為親和層析的標簽(Tag)；3.可以在apoLp-II的C段后融合一段肽段作為親和層析的標簽(Tag)；4.標簽可以選擇His-Tag(連續(xù)六個及以上組氨酸)、GST-Tag、Flag-Tag等；5.可以在親和層析標簽與apoLp-II之間，添加蛋白水解酶水解位點的氨基酸序列，如凝血酶、腸激酶、凝血X因子等，以獲得與天然apoLp-II蛋白結(jié)構一致的重組apoLp-II蛋白。
2.重組apoLp-II/I活性片段的獲得
利用基因工程技術，將含有apoLp-II/I基因中apoLp-II核苷酸序列的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落后接種至含抗生素的LB，誘導apoLp-II基因的表達，從而獲得含有apoLp-II的培養(yǎng)液或菌體。含有apoLp-II的菌體首先經(jīng)裂解液裂解、超聲破碎，釋放目的蛋白后利用離心方法收集上清液作為重組APOLP-II/I的原料液備用。
重組目的基因表達的特征：1.表達載體轉(zhuǎn)化進入宿主的方式可以選擇熱轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化方法；2.誘導表達的方式包括化學誘導—異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導和加溫誘導；3.apoLp-II基因可表達于細胞內(nèi)或細胞外；3.存在于細胞內(nèi)的apoLp-II需通過裂解液裂解、超速破碎等方式，將目的蛋白釋放至溶液中。
按照實施例1的方法、原理、策略等，從上述含apoLp-II的原料液中分離純化重組apoLp-II至需要的純度，直至達到電泳純或HPLC純。
例如：
(1)采用pTYB11構建無標簽apoLp-II表達載體，采用電轉(zhuǎn)化方法將表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，經(jīng)IPTG誘導，apoLp-II表達于細胞內(nèi)。采用裂解緩沖液重懸菌體，進行超聲破碎，離心獲得上清液作為進一步分離純化apoLp-II的原料液。按照實施例1的方法、原理、策略等，分離純化apoLp-II至電泳純(圖2-泳道1)。
(2)采用pET-28a構建N端前融合組氨酸標簽的apoLp-II基因，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導，His-apoLp-II表達于細胞內(nèi)。采用裂解緩沖液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重懸菌體，進行超聲破碎，離心獲得上清液作為進一步分離純化apoLp-II的原料液。按照實施例1的方法、原理、策略等，分離純化apoLp-II至電泳純(圖2-泳道2)。
(3)采用pET20b構建C端后融合組氨酸標簽的apoLp-II基因，采用電轉(zhuǎn)化方法將表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，經(jīng)加溫誘導表達，apoLp-II-His表達于胞外。按照實施例1的方法、原理、策略等，分離純化apoLp-II至電泳純(圖2-泳道4)。
上述表達重組的apoLp-II結(jié)構如SEQ ID：3-5所示，分離純化獲得的重組表達產(chǎn)物，經(jīng)過SDS-PAGE驗證其純度如圖2所示。
上述含標簽的純化后表達產(chǎn)物經(jīng)過上述常規(guī)、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、腸激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表達產(chǎn)物中的融合肽段，再經(jīng)分離純化從而獲得apoLp-II，該重組apoLp-II的結(jié)構與天然apoLp-II的結(jié)構相同。
實施例4：
利用昆蟲細胞表達系統(tǒng)獲得重組apoLp-II/I活性片段
本實施例列舉描述昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達本發(fā)明apoLp-II/I活性片段基因的構建策略和基本方法。
昆蟲細胞表達系統(tǒng)的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略，均為基因工程表達的常規(guī)、通用的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略。
本實施例是使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權利要求的范圍。
對于表達產(chǎn)物的分離純化方法，采用實施例1的方法、原理、策略等。
1.利用pMIB/V5-His-Sf21昆蟲表達體系獲得重組apoLp-II/I活性片段
將apoLp-II/I活性片段基因(apoLp-II基因)連接到pMIB/V5-His質(zhì)粒中，構建pMIB/V5-His-凝血酶酶切位點-apoLp-II重組表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座大腸桿菌DH5，Blue-gal和IPTG誘導后，藍白篩選獲得轉(zhuǎn)座重組bacmid。轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf21，Western blot驗證重組apoLp-II在細胞內(nèi)表達。
收集細胞，用裂解緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重懸，超聲破碎后離心得到含有目的蛋白的原料液。直接上樣于預先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗滌去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)進行洗脫，重組蛋白質(zhì)獲得高效表達，達到電泳純度。表達產(chǎn)物的結(jié)構如SEQ ID：6所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖3-泳道1。
2.利用pFastBac1-sf9昆蟲表達體系獲得重組apoLp-II/I活性片段
將apoLp-II/I活性片段基因(apoLp-II基因)連接到pFastBac1質(zhì)粒中，構建pFastBac1-apoLp-II重組表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座大腸桿菌DH10，Blu-gal和IPTG誘導后，藍白篩選獲得轉(zhuǎn)座重組bacmid。轉(zhuǎn)染昆蟲細胞sf9，Western blot驗證重組apoLp-II在細胞內(nèi)表達。
收集細胞，用裂解緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重懸，超聲破碎后離心得到含有目的蛋白的原料液。直接上樣于抗apoLp-II抗體—sepharose CL-6B為配基的親和層析柱，采用0mol/L-3mol/L NaCl的裂解緩沖液進行梯度洗脫，重組蛋白質(zhì)獲得高效表達，達到電泳純度。表達產(chǎn)物的結(jié)構如SEQ ID：3所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖3-泳道2。
實施例5：
apoLp-II/I及其活性片段抗體的獲得
按照常規(guī)、通用的抗體產(chǎn)生的技術，利用實施例1、3、4獲得的各種apoLp-II/I及其活性片段作為抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應抗體。
利用常規(guī)、通用的抗體檢測方法，檢測被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的血清中apoLp-II/I抗體產(chǎn)生情況。
當被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛產(chǎn)生apoLp-II/I抗體體后，采用常規(guī)、通用的動物血清采集與存儲方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的血清并存儲，該血清可以直接應用。
利用常規(guī)、通用的抗體分離純化技術，如鹽析、各種類型層析介質(zhì)、抗體親和層析介質(zhì)等，從存儲的含有apoLp-II/I抗體的血清中分離純化不同純度的apoLp-II/I抗體，直至獲得電泳純或HPLC純的apoLp-II/I抗體，以適于不同要求的應用。
實施例6：
天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段的生物學活性
為使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權利要求的范圍。本實施例中天然apoLp-II/I、重組apoLp-II/I活性片段具有相同的生物活性。以柞蠶作為鱗翅目昆蟲的生物活性實驗昆蟲為代表進行描述。本專業(yè)技術人員可以以天然apoLp-II/I、重組apoLp-II/I活性片段的生物活性為核心與基礎，進一步拓展天然apoLp-II/I、重組apoLp-II/I活性片段的應用范圍。
1.天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段與微生物及其相關分子模式的結(jié)合特異性
(1)天然apoLp-II/I與微生物的結(jié)合特異性
采用western blotting方法考察天然apoLp-II/I與革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌和綠膿假單胞桿菌)和真菌(白色念珠菌和釀酒酵母)的結(jié)合特性。利用天然apoLp-II/I分別與等量的微生物孵育，采用1MNaCl洗脫后，在高溫條件下2％SDS再次洗脫組分，利用apoLp-II/I多克隆抗體間接檢測天然apoLp-II/I與不同種類微生物的結(jié)合情況。結(jié)果如圖4-A所示，天然apoLp-II/I與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌、釀酒酵母結(jié)合，而與綠膿假單胞桿菌、白色念珠菌不結(jié)合。
(2)天然apoLp-II/I與微生物相關分子模式的結(jié)合特異性
采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測天然apoLp-II/I對6種可溶性的，分別來自不同種微生物的典型分子模式(PAMP)的識別能力。Lys-PGN和LTA屬于革蘭陽性菌的特異PAMPs，DAP-PGN和LPS屬于革蘭陰性菌的特異PAMPs，laminarin(可溶性β-1,3葡聚糖)和Mannan屬于真菌的特異PAMP。不同濃度的PAMPs被包被在96孔板上，依次將天然apoLp-II/I，兔源抗apoLp-II/I多克隆抗血清(一抗)以及偶聯(lián)有辣根過氧化酶的山羊抗兔IgG(二抗)加入96孔板孵育并徹底洗滌未結(jié)合組分，最后加入辣根過氧化酶底物，檢測在450nm下底物顯色的光吸收情況。如圖4-B所示，天然apoLp-II/I對Lys-PGN、LTA和DAP-PGN的結(jié)合具有濃度依賴性和飽和性，屬于特異性結(jié)合。天然apoLp-II/I對LPS、可溶性β-1,3葡聚糖和Mannan不具有結(jié)合能力。
(3)重組apoLp-II/I部分片段與微生物的結(jié)合特異性
按照實施例6中1-(1)中所述western blotting方法考察重組apoLp-II/I部分片段(包含apoLp-II基因)與革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌)和真菌(釀酒酵母)的結(jié)合特性。以重組apoLp-II-His為例，結(jié)果如圖4-C所示，重組apoLp-II-His與上述三種微生物均具有結(jié)合作用，該實驗結(jié)果與天然apoLp-II/I的實驗結(jié)果一致。
上述實驗說明，天然apoLp-II/I可能通過特異性識別典型分子模式而與革蘭陽性菌、部分革蘭陰性菌、部分真菌發(fā)生特異性結(jié)合。采用實施例3、4中所述重組apoLp-II/I部分片段可獲得相同的實驗結(jié)果。
2.apoLp-II/I的表達量與先天性免疫的相關性
取五齡期柞蠶幼蟲，一組未處理，一組為注射20μl金黃色葡萄球菌(OD600＝0.8)12小時后，解剖后分別取表皮、脂肪體、馬氏管、中腸，于液氮中研磨，然后取約100μl樣品，加入1ml Trizol溶液充分混勻。另取血細胞約100μl直接加入1ml Trizol溶液充分混勻。上述組分提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后進行Real-time PCR檢測apoLp-II/I的表達量。如圖4-D所示，apoLp-II/I在脂肪體和表皮中表達，其中脂肪體的表達量最大；apoLp-II/I的表達量因金黃色葡萄球菌的作用而顯著增加。上述結(jié)果說明，apoLp-II/I與昆蟲先天性免疫具有相關性。
3.天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段對酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響
(1)體外抑制天然apoLp-II/I及重組apoLp-II/I部分片段活性對酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響
將血淋巴首先與apoLp-II/I抗體共孵育，以封閉血淋巴中apoLp-II/I的生物學功能，利用6種微生物相關分子模式—Lys-PGN、LTA、DAP-PGN、LPS、laminarin、和Mannan分別激活血淋巴，比較apoLp-II/I抗體封閉前后，血淋巴中酚氧化酶原激活系統(tǒng)受6種微生物相關分子模式的激活情況。結(jié)果如圖4-E所示，apoLp-II/I抗體封閉后，6種微生物相關分子模式對血淋巴中酚氧化酶原激活系統(tǒng)的激活作用均有不同程度的提高。采用實施例3、4中所述重組apoLp-II/I部分片段可獲得相同的實驗結(jié)果。
(2)體內(nèi)干擾apoLp-II/I表達對酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響
以dsEGFP為陰性對照，采用顯微注射法將apoLp-II/I特異性dsRNA導入柞蠶幼蟲體內(nèi)，經(jīng)24h誘導后，收集血淋巴后分別加入微生物相關分子模式-可溶性β-1,3葡聚糖、Lys-PGN和DAP-PGN，通過測定PO的活力以判斷apoLp-II/I對酚氧化酶原激活系統(tǒng)的影響。如圖4-F所示，apoLp-II/I表達量的降低能夠體外顯著增強三種微生物相關分子模式對血淋巴酚氧化酶原的激活情況。
實施例7：
天然apoLp-II/I、重組apoLp-II/I活性片段及其抗體的應用
為使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權利要求的范圍，本實施例以apoLp-II/I的生物活性為代表進行描述，apoLp-II/I活性片段也具有相同的生物活性。同時也以柞蠶作為鱗翅目昆蟲的生物活性實驗昆蟲為代表進行描述。本專業(yè)技術人員可以以apoLp-II/I及重組apoLp-II/I活性片段及其抗體的生物活性為核心與基礎，進一步拓展apoLp-II/I及重組apoLp-II/I活性片段及其抗體的應用范圍。
1.apoLp-II/I及其活性片段抑制酚氧化酶原激活系統(tǒng)
如實施例6中所描述，apoLp-II/I及其活性片段可以抑制酚氧化酶原的激活，基于此，可應用于利用酚氧化酶及酚氧化酶原激活系統(tǒng)的相關領域。
2.apoLp-II/I及其活性片段用于微生物的檢測
如實施例6中所描述，apoLp-II/I及其活性片段能夠與部分微生物及相關分子模式結(jié)合，基于此，通過檢測微生物與apoLp-II/I及其活性片段是否結(jié)合，檢測樣品中是否含有微生物或其相關分子模式。
3.apoLp-II/I及其活性片段抗體的應用
針對實施例5獲得的apoLp-II/I及其活性片段作的抗體，利用免疫學以及分子生物學等常規(guī)、通用技術、方法等，通過apoLp-II/I及其活性片段的抗體，用于鱗翅目昆蟲樣品的apoLp-II/I免疫檢測。同樣，也適用于從鱗翅目昆蟲分離純化制備apoLp-II/I過程中的免疫檢測跟蹤分析以及樣品的定性、定量檢測分析。此方面的實驗已經(jīng)在上述的天然、重組apoLp-II/I活性片段分離純化制備過程中的實施例應用。
在任何待檢測微生物的樣品中，加入足夠劑量的apoLp-II/I及其活性片段抗體。按照本實施例中的apoLp-II/I及其活性片段用于微生物的檢測所述方法，進行待檢測樣品的微生物檢測。同上結(jié)果，即便是樣品中有能夠被檢測出微生物的量也不能檢測出(陰性結(jié)果)，此實驗的設計作為樣品微生物檢測的陰性對照組加以應用。
如實施例6中所描述，apoLp-II/I及其活性片段可以抑制酚氧化酶原的激活，而利用apoLp-II/I及其活性片段的抗體封閉apoLp-II/I，能夠顯著提高酚氧化酶的活性。基于此，可通過利用apoLp-II/I及其活性片段抗體調(diào)整酚氧化酶的活性，進而可應用于利用酚氧化酶及酚氧化酶原激活系統(tǒng)的相關領域。
上述結(jié)果表明：apoLp-II/I及其活性片段的抗體，通過與apoLp-II/I及其活性片段的結(jié)合而屏蔽了與微生物及其相關分子模式的結(jié)合生物活性，從而使apoLp-II/I及其活性片段失去了原有的生物活性?；谶@種結(jié)合屏蔽作用原理可以廣泛應用。
SEQUENCE LISTING
<110> 沈陽藥科大學
<120> 載脂蛋白-II/I及其功能、制備方法和應用
<160> 10
<210> 1
<211> 10278
<212> DNA
<213> 柞蠶（Antheraea pernyi）
<220>
<221> mRNA
<222> (1)...(10278)
<220>
<221> CDS
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<400> 1
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tgttcctgga tgcccttctt cgagccggta ccggcgatag cattgaagca tctattaaca 1200
tcttgaagag tcgtgagttg ggtcaactgg agcagcaact ggtctacttg tctcttggaa 1260
acgcgagaca tgtcaataat gccgccctga aagccgctgc ctctttgctc gaccaaccaa 1320
acctgcctaa agaagtttat ctcggagttg gagcattggc cggtgcatac tgccgagaac 1380
acgagtgcca tactacaaag cctgtaggta tcgttgctct gagccaaaaa cttggagcca 1440
aactgcagaa ctgcagaccg agatccaaaa ctgaggaaga cactattgtt gccatcctca 1500
agggtatccg tagcatccgc catctggaag actcgcttat caataaaata gtacactgtg 1560
ccgcggataa taacgtgaag gctagtgtta aggcggcagc cttggaagct ttccacgccg 1620
acccttgcag cgctgcgata aagaaaactg caattgagat catgaagaat cgtcaattag 1680
actctgaaat ccgtatcaag gcttaccttg cagttatcca atgcccatgt ggtcaatcag 1740
ctaacgagat taagaacttg ttggatacag aacccgtaca tcaagttggt aattttatct 1800
caacatctct tcgttatatc cgaacgtcag caaatcccga caagcagctc gcgcgtcaac 1860
actacggcct cattaggaca cctaacaaat tcaattccga cgatcgaaaa tattcgttct 1920
accgcgagac atcattcaat atagatgctc ttggagctgg tggtagtgtt gatcaaaccg 1980
tcatttactc ccaagattcg tatctacctc gagaggctag cgttaactta actgttgaac 2040
tatttggaca tagctacaac gtgctagagt tgggaggacg ccaaggtaat ctagaccgtg 2100
taatcgaaca cttcttggga cctaaaggat atttccgtac cagtgaccct caggcactat 2160
acgacgatct ggtaaagaga tacgaggagt caaagaataa agtccaacgt ggtttcggtc 2220
gtggacgcag gtccatcaaa aacgaaatcg ataatttcga caaaaatctg aaagccgaat 2280
ctaattcata ccacaacgag ctcgatctgg atatctatgt gaagtttttc ggaactgatg 2340
ctgtcttcct gtcctttgga gatgacaaag gttttgactt taacaagatt ctcgatgaaa 2400
tccttggtac ttgcaacagt ggcattaata agctgaagca tttccagcaa gaactgcgca 2460
ctcatcttct atttatggac gccgaactaa gttatcctac atctgtgggt ctccccctgc 2520
gcttgaatct cgtaggatcc cttactgctc gtcttgatgt tgccactaat gtggatatcc 2580
aagaaatcat gaaatcacct caaagcgcaa aggtcgatgt caaattcgta ccaagcacag 2640
acgtcgaaat tgctggggct ctactcattg atgctgactc tgttaccacg ggtcttaaag 2700
ttatcaccaa cttacgctct tcaactggtc tccacgttat cgcgaaagtc atcgagaatg 2760
gtcgcggttt cgacctacaa cttggcctcc cagtagacaa acaagagatt ctggtagcct 2820
ctaatgaact ggtatacgtg acagctgaaa agggtcaaag ggagaaacaa acgaaaatta 2880
aaactggaca gagtatgcac gattattcgc cgtgtttcga ccagttgtct ggtgttcttg 2940
gtttgacact ctgcggacat ttctctttac ctttcagtat atctaatcgt gaaaaaccca 3000
gcgaccaaat aatctctcaa tttttcaatc ggttcccact atccggaaca gcttcagcga 3060
aaattgtcct tgaaaaaaac gacttaagtg gttatcatat taaaggtgtt gtccgtgagg 3120
atgccgctgc tggtaaaaag agcttcgaat ttttattcga cgcagaaggc tctcagaacc 3180
gtcacaccaa attaacaggt caatacgtct acaactcaaa tgaaatcggt gttaagcttg 3240
aacttcagtc tcctattaaa aatctttatg gagaaatatc agcctgtaat aatcccagag 3300
aactgatggc taaatacgta ggtagagtgg actccatgga atacaaaggt cggattggtt 3360
ttactgtcca gggcaatgag caacggtcag tttacagacc ggtatttgag tacagtatcc 3420
cagatggcag tgggcaaact cattcggctg aaattgttgg cgaagttatc aaagagacaa 3480
gtggcagaaa gtccaaatat acagccaggg gtttacagat cccaatggcg aaaggacaac 3540
agccagtgga agtaaatgga tacgtgtctc tgcaagatca gcccagagat gttgaggttg 3600
acctggcagt gaaaggatac gctagcctca agggttcttt gaaaggatct gacgttatga 3660
tagactttga gaacaattta aatcccaacg ttaatttcaa tatgaagggt aaattcgatt 3720
acaataatat gattcacaac gaattcgagc ttcaatacgg ccctaagaaa aatgatccac 3780
tatcaaaagt gagcttcttt cagcacctga aatatcacat tcaatctagc gaagattaca 3840
acatcatcac caaaaacagc tttgaaatcc gtgcggttcc actgaaggtg gtagcaaatg 3900
ctgacattga ccctaagaag gtcgtcattg atatcggagg acaatacgtt gacagaagcg 3960
ctaagcttga agtggaagct agaacaaaga tcaagaggcc aggagattac agcgtaaaag 4020
tcaaagctaa cctcaacgat gcctgtattg aagtcttatc gaaaagagat gttgtttccg 4080
ctgataaatc caacttcgag aattacctcg acatcacagg cgtagggcga tatgaactct 4140
caggagttgt gcttcataag accaaaccaa atgatatgaa cgttggtgct atcggtcatt 4200
ttaagattaa ggctggttcc aataatgaag atattaaatt cgatatcgga ttaattgaaa 4260
cttccaacat atactcttca cacgcccaag tctctaacag caaaggcgaa gtgcttgact 4320
ttttgttaaa agtaactcgc actgggaatc ccactggtca gctgaagttc aacttaaaag 4380
atatcatcgt aactcatgga gaattcaagg tcactgataa tgacggcaag ggtaatggaa 4440
tgatcatagt ggagttcaaa aaactacaac gtaaaataaa aggtgacgtc aaattcgtct 4500
ctaaggaccc ggtcttcatt accgacattg agttatacct cgattttgaa aagaataaca 4560
acaacaaatt ccacttcgta acgaataatc ggaagactca gaagctcgtt tcttccaaga 4620
acaaggttga gtacgatggt aaagttaccg aagtgaacta cgtacaagaa ggagttttct 4680
ctataactgg aaaaaccaat ctcaactttg acgtagtact cccaacagaa agatgtatta 4740
gcttgaagat agaccgcgat gtagccttga aagatggtaa atatagtgga catgcagagt 4800
tacttctctc tgattccgtg aagcgtggct cggcgtcgtc tgttatcagc tacaaaggaa 4860
aaattgttga caccgatatt gaaaaagaaa taattaatta tgagggccag cttgaattcc 4920
gtcttaagga tggtaaacaa ctgctgaaca cgttctacct gaagaacatt cctgagggca 4980
ataaattcaa gtttgacttt aagtctgacg tgaccggcaa cctgcttccc aaaccggcat 5040
ctcttagcgc tactggttct tacctcgact ccgagacaat cataaatcag aattatcgag 5100
tgaagggcaa ttatggggac gacattagct ttgaatatgt cgatcagtgg acgtgcaatt 5160
attcgagaag gacaaaaaaa tacttgagtg actacacagt aaccgtgcac cttccgttcg 5220
agaaggctca cgatatcaaa tgggcatcga cagttcagta cctacagcct gacggcaagg 5280
atatcgctga gtacacaata gttgaatctg tccaagttaa tgctgacgtc ttcaaggtgg 5340
acgctaatgg aaaagtcggt atcaagaacg gctccggagc tattaaagta ctcattccac 5400
ataacgatcc atttatagta gatttcaatt acaagagaga cagccaaggt gacaaaaata 5460
acaactttgt ggaagttaaa gcaaaatacg gcaagggcaa gactacttcg ctttcaattg 5520
actcttcgtt cgctcctcac gacagcactc tccaagtgaa agcttattct ccgaatgctg 5580
aaaaactcaa gaaactcgaa ctcaatattc actcaaagaa cccatctcct gatacataca 5640
gtaattctat aataatggac gctgatggac gtatctacaa atctgaatct accatcgtat 5700
tatcaaaggc tcacccagta ttggacattc aatacgttaa ccccgaaact aataaaccta 5760
gcagaatcta cgtgaaaggc agctcgctca gctcaactca aggcaagatc gaagtcaaag 5820
tagacaatat ttacaaaatc tgcttcgacg ttgtggccga gggtagtgtg cagaaagaca 5880
atgtcgcttt caaggccgtc gccaactcca aggaactcgg ctggaataac tacaacgtag 5940
atatcagcag caaggactcc ggaaacggca aacgattgga tttccacgcc attaacgaca 6000
acaagaacgt aattagtgga agcacgtcgt ttataagcaa gcaggaaggt cagaagacga 6060
tcattgaagg ttccggctcc gttaaagtaa aggaggagca gaagtgggct aatttcaagt 6120
tcatccgcac agtactgacg gagagtagtg aacagggtgt tgagacattc ttcaatgttg 6180
ctatcggcga acgaagctac gtggctgaat cacgtgtaac caattacgaa tacaaaaact 6240
cttatgtcta ctgtgaagag aagaagcaat gcgctcatgc tgaaatacaa tcaaagatcg 6300
atatgtcaac tcccggtgta atcgttaatc tcgtgaacat cggcttcgac cttcgcaaac 6360
tgggtgttgc ccctgaactc gggcttcaaa tgcgtgacga ggtctccact tccaaaccac 6420
cgcggttcac cctcgacctg cacgtcaata gccaggagag aaagtatcac ctccacgcgt 6480
acaacacgcc cgaacatggc cactttgcat ccggagttac cgttcgtcta ccatctagat 6540
tattggctct tgaatacact ctcgactatc ctaccgacaa gcttatgccg ttccccgtta 6600
ggggagaggt ttgtctggat cttgataaga ataagccggg acataagaca tctgctagat 6660
tcctcgtcga cttcactaac gctggaggaa gtcaagacac tgccattgct gaaattggat 6720
tcttccatcc taaaattgaa aaggaggccg tgttcagaat caatggagta gttaagcgac 6780
ctggtgatgg tactttcaag tttgaaactt cagccacgtt atcatgccac tctgcatttg 6840
gcagggaccg cgtctctaaa ctcttactgg aagtctcccc acgcaagttc gagttcttga 6900
ctgaaacacc attcgtaaag gtattgcaca tcgacgctgg cttcacatca accccggagc 6960
agagaactta ccagtcacta ttcagcgttt gcctactgga aggcaatgtg gttcaaataa 7020
aaacactgct caaggacttc caatatttcg aattcacaac agaggaatcc ggctgcaaat 7080
tctcgatcgt tgcacatctg gtaccggaga aacgtgctga tatcagtgcg gacctcatcc 7140
tatctggagg caagaagaac atcgctcacg gtgctttgtt ccttaaagac aacacgattc 7200
aatccgagta cggtgcctct aaggacaact tcaaccattt aatggctact gttaagaagg 7260
acgctgagag cctgaacgat cgtatcaaag atctcggtga aaaatccagt caagacttcc 7320
aacagcttct gcagcgcgct acaccatact tcaagcgcat tgacgatgac ttcagagccg 7380
agtgggaaag attctacaat gagatcgctg tcgacaaggt cttcaaagag ttgtcacaca 7440
ccctgaatga ggtcattcac tatttggcta agatattcga tgaaattctc caaggaacca 7500
aacccttggt agaccagatc accaagacct tcactgagac ttctgagaag atatcaggaa 7560
tgtacaagaa gacgcttgaa cctcaactga aacagctgta tgagactctt ggcaaaattc 7620
taaaagaata cttggatgct gccatcgaag ttgttgcaca tttaggcgca cttgtcagtg 7680
acttcttcga gaaacataag caagaacttc agcaactgac caacgtcatg actgaaatat 7740
ttaaagacct gacccgcatt atcgtagcgc aactgaagga gatgcctgga aagttcaacc 7800
aggtgtatgg ggaactcgtc caactaataa acaacatgcc gatcattgag gctattaaag 7860
aggagtggaa ggatggttta ccaaaggacc aaatactcgg aatgtgcaac caaggttacg 7920
ccgctatata ccaagtgctt ccaaataagg aattcaaaga ttttgctgaa gctttgaaca 7980
attacgtgat caagaaactc cgttcggaac aaatcgatga cgcaaaatcg ctgcaggtca 8040
tttaccaaaa gctgattgca gcgttcagtt cgctgtcaca attcatccca tcacagatta 8100
ccagttacac tgcttctgga cctacctctt ggagtagcta cttcttctct cctgcgagca 8160
cccctgtgtg gtctggcgat gcgtcatgga gtttgctcaa acagctgatc tctggcgatt 8220
tacctgacat gtttgacatg attcgtgcct atagaccacg gtcactcgac ccattcgacg 8280
aaatgcctgc taaacttcgc gccgtagtca tcaatggtca acacatcttc acgttcgacg 8340
gcaaacatct gaccttcccc gggcagtgcc gctacgtgct gattcacaac tatgtcgaca 8400
ggaacttcac tgtacttctg cagttgcaga acggacagcc caaagcctta gttctggagg 8460
acaagagtgg aactatcatt gagctcaagg acaatggaca ggtgacacta aacggagctg 8520
ttcacgggtt cccagtcatc gaaaaggatg tgtttgcatt caaacagact aacggacgca 8580
tcggcctcgg ctctcagtac ggattcaagg cattctgtac ttctaaactt gaggtttgct 8640
acttcgaagt ggacggtttc tacctgggca aattacgtgg tctccttgga gatggtaaca 8700
atgagcccta tgatgacttc agactaccga acggaaagat ttgcacatcg gaaagtgaat 8760
tcggcaacgg gtacggtcta gtacacagct gtccgaaagt ccaggctccg gagcactccc 8820
accaccagat gcacgccgcc cttccaccag catgtgaaca ggtgttcgga ggaatctccc 8880
cgctgcggcc cgtcagccta ctacttgacg tatcgccatt cagacaagcg tgcatccacg 8940
cagtgacggg tgcagacgcg gccaaggact tgcaccaggc gtgtgacctc gcgcgcgggt 9000
acgcggcgct cgcgctcacg ggcatgctgc ccgcggtgtt gccggacgtg tgcgtgcgtt 9060
gcactgacgc ggacaaaccg cgcgctatcg gagacatgta cgaagtcaaa atgcccaaca 9120
aacaagccga tatcgttgtc tccttcgaaa ctactcagaa taatgagcag acttacaagg 9180
aattggtaat gccacttgta acacaactag tcgataatct gaagaagaag cagattacag 9240
atattaaact gtacctcgtc ggacacacgt ccaaacatcc gtacgccatt ttatacgaca 9300
ctgacttgaa actgaagagc tccaagcttc atttcgatga cacggaccgg tacgaccgca 9360
cgccttacgt caaaactgga tttgagactt tcgacaaata cgagaagaac cttgtcgaat 9420
tcattgatgc ggtcaaaatt aaacttggca taaccaacat tgcatttagt gaatattcac 9480
tcatggatct acctttccgt gctggtgctg tgaaacacgt tttcttgaca gtgtctgaac 9540
cttgcatcga agaattcttc ttggtgaaag tggttggcga tttgatgttc aaagtattgt 9600
tggagaacat gggcatgtcc atgtcattag ttacggcgac accggagatg aaatgcggcg 9660
gaaacctcgc tcatgtcgtc ggtttcgacg aatcctcggt actaatgctg ggtaacatga 9720
agagaacgaa agagtctgaa gcactcagag cgacgcttga actaccatct agctcttgca 9780
tcgatttcac tcaagcggtt gatggcctcg tgttctcttc aacgaactac ttgaaactag 9840
aaggcgggca gaggaagcag ttcttgcaga cagccgccaa cgcgatcaca cagaagatga 9900
cgaaggcgca tctcgtgcaa gaatgcacgt gtacatacgt tgatccgttc cgcgtgcgct 9960
ctgcttgctt caccagagaa aagaaagaag ttgctcgcag gcgaaagtaa gcgcgtaaga 10020
agaatgaaga gaccatcgta tctgtgatga cctgtaacct ataacgtgtg agcgagacgc 10080
tacctgtgtc ttgctctttc attcattaaa caatgccatc aagtgaattc ttagttattt 10140
atgatgccgt ctctctcaga aggtattatt taatcatgtc atttgtatta caattaataa 10200
taaaaaatta tatattattc aaaaaaaaaa aaaaaaagat atcggatccg aattccgaat 10260
ctctagagga tccccggg 10278
<210> 2
<211> 3305
<212> PRT
<213> 柞蠶（Antheraea pernyi）
<400> 2
Met Gly Lys Ser Arg Leu Ser Leu Phe Ser Val Ile Leu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Val Leu Trp Lys Pro Val Tyr Ser Lys Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys
20 25 30
Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser
35 40 45
Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp
50 55 60
Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu
65 70 75 80
Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly
85 90 95
Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val
100 105 110
Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His
115 120 125
Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly
145 150 155 160
Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu
165 170 175
Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly
180 185 190
Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys
195 200 205
Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn
210 215 220
Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys
225 230 235 240
Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys
245 250 255
Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys
260 265 270
Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro
275 280 285
Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala
290 295 300
Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala
305 310 315 320
Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys
325 330 335
Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu
340 345 350
Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile
355 360 365
Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val
370 375 380
Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr
405 410 415
Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys
420 425 430
His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly
435 440 445
Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr
450 455 460
Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp
465 470 475 480
Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys
485 490 495
Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys
500 505 510
Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln
515 520 525
Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys
530 535 540
Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu
545 550 555 560
Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile
565 570 575
Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly
580 585 590
Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser
595 600 605
Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly
610 615 620
Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg
625 630 635 640
Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn
645 650 655
Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu
660 665 670
His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala
675 680 685
Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val
690 695 700
Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg Arg Ser Ile Lys Asn Glu Ile Asp
705 710 715 720
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Lys Ala Glu Ser Asn Ser Tyr His Asn Glu
725 730 735
Leu Asp Leu Asp Ile Tyr Val Lys Phe Phe Gly Thr Asp Ala Val Phe
740 745 750
Leu Ser Phe Gly Asp Asp Lys Gly Phe Asp Phe Asn Lys Ile Leu Asp
755 760 765
Glu Ile Leu Gly Thr Cys Asn Ser Gly Ile Asn Lys Leu Lys His Phe
770 775 780
Gln Gln Glu Leu Arg Thr His Leu Leu Phe Met Asp Ala Glu Leu Ser
785 790 795 800
Tyr Pro Thr Ser Val Gly Leu Pro Leu Arg Leu Asn Leu Val Gly Ser
805 810 815
Leu Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Thr Asn Val Asp Ile Gln Glu Ile
820 825 830
Met Lys Ser Pro Gln Ser Ala Lys Val Asp Val Lys Phe Val Pro Ser
835 840 845
Thr Asp Val Glu Ile Ala Gly Ala Leu Leu Ile Asp Ala Asp Ser Val
850 855 860
Thr Thr Gly Leu Lys Val Ile Thr Asn Leu Arg Ser Ser Thr Gly Leu
865 870 875 880
His Val Ile Ala Lys Val Ile Glu Asn Gly Arg Gly Phe Asp Leu Gln
885 890 895
Leu Gly Leu Pro Val Asp Lys Gln Glu Ile Leu Val Ala Ser Asn Glu
900 905 910
Leu Val Tyr Val Thr Ala Glu Lys Gly Gln Arg Glu Lys Gln Thr Lys
915 920 925
Ile Lys Thr Gly Gln Ser Met His Asp Tyr Ser Pro Cys Phe Asp Gln
930 935 940
Leu Ser Gly Val Leu Gly Leu Thr Leu Cys Gly His Phe Ser Leu Pro
945 950 955 960
Phe Ser Ile Ser Asn Arg Glu Lys Pro Ser Asp Gln Ile Ile Ser Gln
965 970 975
Phe Phe Asn Arg Phe Pro Leu Ser Gly Thr Ala Ser Ala Lys Ile Val
980 985 990
Leu Glu Lys Asn Asp Leu Ser Gly Tyr His Ile Lys Gly Val Val Arg
995 1000 1005
Glu Asp Ala Ala Ala Gly Lys Lys Ser Phe Glu Phe Leu Phe Asp
1010 1015 1020
Ala Glu Gly Ser Gln Asn Arg His Thr Lys Leu Thr Gly Gln Tyr
1025 1030 1035
Val Tyr Asn Ser Asn Glu Ile Gly Val Lys Leu Glu Leu Gln Ser
1040 1045 1050
Pro Ile Lys Asn Leu Tyr Gly Glu Ile Ser Ala Cys Asn Asn Pro
1055 1060 1065
Arg Glu Leu Met Ala Lys Tyr Val Gly Arg Val Asp Ser Met Glu
1070 1075 1080
Tyr Lys Gly Arg Ile Gly Phe Thr Val Gln Gly Asn Glu Gln Arg
1085 1090 1095
Ser Val Tyr Arg Pro Val Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Asp Gly Ser
1100 1105 1110
Gly Gln Thr His Ser Ala Glu Ile Val Gly Glu Val Ile Lys Glu
1115 1120 1125
Thr Ser Gly Arg Lys Ser Lys Tyr Thr Ala Arg Gly Leu Gln Ile
1130 1135 1140
Pro Met Ala Lys Gly Gln Gln Pro Val Glu Val Asn Gly Tyr Val
1145 1150 1155
Ser Leu Gln Asp Gln Pro Arg Asp Val Glu Val Asp Leu Ala Val
1160 1165 1170
Lys Gly Tyr Ala Ser Leu Lys Gly Ser Leu Lys Gly Ser Asp Val
1175 1180 1185
Met Ile Asp Phe Glu Asn Asn Leu Asn Pro Asn Val Asn Phe Asn
1190 1195 1200
Met Lys Gly Lys Phe Asp Tyr Asn Asn Met Ile His Asn Glu Phe
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Tyr Gly Pro Lys Lys Asn Asp Pro Leu Ser Lys Val
1220 1225 1230
Ser Phe Phe Gln His Leu Lys Tyr His Ile Gln Ser Ser Glu Asp
1235 1240 1245
Tyr Asn Ile Ile Thr Lys Asn Ser Phe Glu Ile Arg Ala Val Pro
1250 1255 1260
Leu Lys Val Val Ala Asn Ala Asp Ile Asp Pro Lys Lys Val Val
1265 1270 1275
Ile Asp Ile Gly Gly Gln Tyr Val Asp Arg Ser Ala Lys Leu Glu
1280 1285 1290
Val Glu Ala Arg Thr Lys Ile Lys Arg Pro Gly Asp Tyr Ser Val
1295 1300 1305
Lys Val Lys Ala Asn Leu Asn Asp Ala Cys Ile Glu Val Leu Ser
1310 1315 1320
Lys Arg Asp Val Val Ser Ala Asp Lys Ser Asn Phe Glu Asn Tyr
1325 1330 1335
Leu Asp Ile Thr Gly Val Gly Arg Tyr Glu Leu Ser Gly Val Val
1340 1345 1350
Leu His Lys Thr Lys Pro Asn Asp Met Asn Val Gly Ala Ile Gly
1355 1360 1365
His Phe Lys Ile Lys Ala Gly Ser Asn Asn Glu Asp Ile Lys Phe
1370 1375 1380
Asp Ile Gly Leu Ile Glu Thr Ser Asn Ile Tyr Ser Ser His Ala
1385 1390 1395
Gln Val Ser Asn Ser Lys Gly Glu Val Leu Asp Phe Leu Leu Lys
1400 1405 1410
Val Thr Arg Thr Gly Asn Pro Thr Gly Gln Leu Lys Phe Asn Leu
1415 1420 1425
Lys Asp Ile Ile Val Thr His Gly Glu Phe Lys Val Thr Asp Asn
1430 1435 1440
Asp Gly Lys Gly Asn Gly Met Ile Ile Val Glu Phe Lys Lys Leu
1445 1450 1455
Gln Arg Lys Ile Lys Gly Asp Val Lys Phe Val Ser Lys Asp Pro
1460 1465 1470
Val Phe Ile Thr Asp Ile Glu Leu Tyr Leu Asp Phe Glu Lys Asn
1475 1480 1485
Asn Asn Asn Lys Phe His Phe Val Thr Asn Asn Arg Lys Thr Gln
1490 1495 1500
Lys Leu Val Ser Ser Lys Asn Lys Val Glu Tyr Asp Gly Lys Val
1505 1510 1515
Thr Glu Val Asn Tyr Val Gln Glu Gly Val Phe Ser Ile Thr Gly
1520 1525 1530
Lys Thr Asn Leu Asn Phe Asp Val Val Leu Pro Thr Glu Arg Cys
1535 1540 1545
Ile Ser Leu Lys Ile Asp Arg Asp Val Ala Leu Lys Asp Gly Lys
1550 1555 1560
Tyr Ser Gly His Ala Glu Leu Leu Leu Ser Asp Ser Val Lys Arg
1565 1570 1575
Gly Ser Ala Ser Ser Val Ile Ser Tyr Lys Gly Lys Ile Val Asp
1580 1585 1590
Thr Asp Ile Glu Lys Glu Ile Ile Asn Tyr Glu Gly Gln Leu Glu
1595 1600 1605
Phe Arg Leu Lys Asp Gly Lys Gln Leu Leu Asn Thr Phe Tyr Leu
1610 1615 1620
Lys Asn Ile Pro Glu Gly Asn Lys Phe Lys Phe Asp Phe Lys Ser
1625 1630 1635
Asp Val Thr Gly Asn Leu Leu Pro Lys Pro Ala Ser Leu Ser Ala
1640 1645 1650
Thr Gly Ser Tyr Leu Asp Ser Glu Thr Ile Ile Asn Gln Asn Tyr
1655 1660 1665
Arg Val Lys Gly Asn Tyr Gly Asp Asp Ile Ser Phe Glu Tyr Val
1670 1675 1680
Asp Gln Trp Thr Cys Asn Tyr Ser Arg Arg Thr Lys Lys Tyr Leu
1685 1690 1695
Ser Asp Tyr Thr Val Thr Val His Leu Pro Phe Glu Lys Ala His
1700 1705 1710
Asp Ile Lys Trp Ala Ser Thr Val Gln Tyr Leu Gln Pro Asp Gly
1715 1720 1725
Lys Asp Ile Ala Glu Tyr Thr Ile Val Glu Ser Val Gln Val Asn
1730 1735 1740
Ala Asp Val Phe Lys Val Asp Ala Asn Gly Lys Val Gly Ile Lys
1745 1750 1755
Asn Gly Ser Gly Ala Ile Lys Val Leu Ile Pro His Asn Asp Pro
1760 1765 1770
Phe Ile Val Asp Phe Asn Tyr Lys Arg Asp Ser Gln Gly Asp Lys
1775 1780 1785
Asn Asn Asn Phe Val Glu Val Lys Ala Lys Tyr Gly Lys Gly Lys
1790 1795 1800
Thr Thr Ser Leu Ser Ile Asp Ser Ser Phe Ala Pro His Asp Ser
1805 1810 1815
Thr Leu Gln Val Lys Ala Tyr Ser Pro Asn Ala Glu Lys Leu Lys
1820 1825 1830
Lys Leu Glu Leu Asn Ile His Ser Lys Asn Pro Ser Pro Asp Thr
1835 1840 1845
Tyr Ser Asn Ser Ile Ile Met Asp Ala Asp Gly Arg Ile Tyr Lys
1850 1855 1860
Ser Glu Ser Thr Ile Val Leu Ser Lys Ala His Pro Val Leu Asp
1865 1870 1875
Ile Gln Tyr Val Asn Pro Glu Thr Asn Lys Pro Ser Arg Ile Tyr
1880 1885 1890
Val Lys Gly Ser Ser Leu Ser Ser Thr Gln Gly Lys Ile Glu Val
1895 1900 1905
Lys Val Asp Asn Ile Tyr Lys Ile Cys Phe Asp Val Val Ala Glu
1910 1915 1920
Gly Ser Val Gln Lys Asp Asn Val Ala Phe Lys Ala Val Ala Asn
1925 1930 1935
Ser Lys Glu Leu Gly Trp Asn Asn Tyr Asn Val Asp Ile Ser Ser
1940 1945 1950
Lys Asp Ser Gly Asn Gly Lys Arg Leu Asp Phe His Ala Ile Asn
1955 1960 1965
Asp Asn Lys Asn Val Ile Ser Gly Ser Thr Ser Phe Ile Ser Lys
1970 1975 1980
Gln Glu Gly Gln Lys Thr Ile Ile Glu Gly Ser Gly Ser Val Lys
1985 1990 1995
Val Lys Glu Glu Gln Lys Trp Ala Asn Phe Lys Phe Ile Arg Thr
2000 2005 2010
Val Leu Thr Glu Ser Ser Glu Gln Gly Val Glu Thr Phe Phe Asn
2015 2020 2025
Val Ala Ile Gly Glu Arg Ser Tyr Val Ala Glu Ser Arg Val Thr
2030 2035 2040
Asn Tyr Glu Tyr Lys Asn Ser Tyr Val Tyr Cys Glu Glu Lys Lys
2045 2050 2055
Gln Cys Ala His Ala Glu Ile Gln Ser Lys Ile Asp Met Ser Thr
2060 2065 2070
Pro Gly Val Ile Val Asn Leu Val Asn Ile Gly Phe Asp Leu Arg
2075 2080 2085
Lys Leu Gly Val Ala Pro Glu Leu Gly Leu Gln Met Arg Asp Glu
2090 2095 2100
Val Ser Thr Ser Lys Pro Pro Arg Phe Thr Leu Asp Leu His Val
2105 2110 2115
Asn Ser Gln Glu Arg Lys Tyr His Leu His Ala Tyr Asn Thr Pro
2120 2125 2130
Glu His Gly His Phe Ala Ser Gly Val Thr Val Arg Leu Pro Ser
2135 2140 2145
Arg Leu Leu Ala Leu Glu Tyr Thr Leu Asp Tyr Pro Thr Asp Lys
2150 2155 2160
Leu Met Pro Phe Pro Val Arg Gly Glu Val Cys Leu Asp Leu Asp
2165 2170 2175
Lys Asn Lys Pro Gly His Lys Thr Ser Ala Arg Phe Leu Val Asp
2180 2185 2190
Phe Thr Asn Ala Gly Gly Ser Gln Asp Thr Ala Ile Ala Glu Ile
2195 2200 2205
Gly Phe Phe His Pro Lys Ile Glu Lys Glu Ala Val Phe Arg Ile
2210 2215 2220
Asn Gly Val Val Lys Arg Pro Gly Asp Gly Thr Phe Lys Phe Glu
2225 2230 2235
Thr Ser Ala Thr Leu Ser Cys His Ser Ala Phe Gly Arg Asp Arg
2240 2245 2250
Val Ser Lys Leu Leu Leu Glu Val Ser Pro Arg Lys Phe Glu Phe
2255 2260 2265
Leu Thr Glu Thr Pro Phe Val Lys Val Leu His Ile Asp Ala Gly
2270 2275 2280
Phe Thr Ser Thr Pro Glu Gln Arg Thr Tyr Gln Ser Leu Phe Ser
2285 2290 2295
Val Cys Leu Leu Glu Gly Asn Val Val Gln Ile Lys Thr Leu Leu
2300 2305 2310
Lys Asp Phe Gln Tyr Phe Glu Phe Thr Thr Glu Glu Ser Gly Cys
2315 2320 2325
Lys Phe Ser Ile Val Ala His Leu Val Pro Glu Lys Arg Ala Asp
2330 2335 2340
Ile Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Gly Gly Lys Lys Asn Ile Ala
2345 2350 2355
His Gly Ala Leu Phe Leu Lys Asp Asn Thr Ile Gln Ser Glu Tyr
2360 2365 2370
Gly Ala Ser Lys Asp Asn Phe Asn His Leu Met Ala Thr Val Lys
2375 2380 2385
Lys Asp Ala Glu Ser Leu Asn Asp Arg Ile Lys Asp Leu Gly Glu
2390 2395 2400
Lys Ser Ser Gln Asp Phe Gln Gln Leu Leu Gln Arg Ala Thr Pro
2405 2410 2415
Tyr Phe Lys Arg Ile Asp Asp Asp Phe Arg Ala Glu Trp Glu Arg
2420 2425 2430
Phe Tyr Asn Glu Ile Ala Val Asp Lys Val Phe Lys Glu Leu Ser
2435 2440 2445
His Thr Leu Asn Glu Val Ile His Tyr Leu Ala Lys Ile Phe Asp
2450 2455 2460
Glu Ile Leu Gln Gly Thr Lys Pro Leu Val Asp Gln Ile Thr Lys
2465 2470 2475
Thr Phe Thr Glu Thr Ser Glu Lys Ile Ser Gly Met Tyr Lys Lys
2480 2485 2490
Thr Leu Glu Pro Gln Leu Lys Gln Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Lys
2495 2500 2505
Ile Leu Lys Glu Tyr Leu Asp Ala Ala Ile Glu Val Val Ala His
2510 2515 2520
Leu Gly Ala Leu Val Ser Asp Phe Phe Glu Lys His Lys Gln Glu
2525 2530 2535
Leu Gln Gln Leu Thr Asn Val Met Thr Glu Ile Phe Lys Asp Leu
2540 2545 2550
Thr Arg Ile Ile Val Ala Gln Leu Lys Glu Met Pro Gly Lys Phe
2555 2560 2565
Asn Gln Val Tyr Gly Glu Leu Val Gln Leu Ile Asn Asn Met Pro
2570 2575 2580
Ile Ile Glu Ala Ile Lys Glu Glu Trp Lys Asp Gly Leu Pro Lys
2585 2590 2595
Asp Gln Ile Leu Gly Met Cys Asn Gln Gly Tyr Ala Ala Ile Tyr
2600 2605 2610
Gln Val Leu Pro Asn Lys Glu Phe Lys Asp Phe Ala Glu Ala Leu
2615 2620 2625
Asn Asn Tyr Val Ile Lys Lys Leu Arg Ser Glu Gln Ile Asp Asp
2630 2635 2640
Ala Lys Ser Leu Gln Val Ile Tyr Gln Lys Leu Ile Ala Ala Phe
2645 2650 2655
Ser Ser Leu Ser Gln Phe Ile Pro Ser Gln Ile Thr Ser Tyr Thr
2660 2665 2670
Ala Ser Gly Pro Thr Ser Trp Ser Ser Tyr Phe Phe Ser Pro Ala
2675 2680 2685
Ser Thr Pro Val Trp Ser Gly Asp Ala Ser Trp Ser Leu Leu Lys
2690 2695 2700
Gln Leu Ile Ser Gly Asp Leu Pro Asp Met Phe Asp Met Ile Arg
2705 2710 2715
Ala Tyr Arg Pro Arg Ser Leu Asp Pro Phe Asp Glu Met Pro Ala
2720 2725 2730
Lys Leu Arg Ala Val Val Ile Asn Gly Gln His Ile Phe Thr Phe
2735 2740 2745
Asp Gly Lys His Leu Thr Phe Pro Gly Gln Cys Arg Tyr Val Leu
2750 2755 2760
Ile His Asn Tyr Val Asp Arg Asn Phe Thr Val Leu Leu Gln Leu
2765 2770 2775
Gln Asn Gly Gln Pro Lys Ala Leu Val Leu Glu Asp Lys Ser Gly
2780 2785 2790
Thr Ile Ile Glu Leu Lys Asp Asn Gly Gln Val Thr Leu Asn Gly
2795 2800 2805
Ala Val His Gly Phe Pro Val Ile Glu Lys Asp Val Phe Ala Phe
2810 2815 2820
Lys Gln Thr Asn Gly Arg Ile Gly Leu Gly Ser Gln Tyr Gly Phe
2825 2830 2835
Lys Ala Phe Cys Thr Ser Lys Leu Glu Val Cys Tyr Phe Glu Val
2840 2845 2850
Asp Gly Phe Tyr Leu Gly Lys Leu Arg Gly Leu Leu Gly Asp Gly
2855 2860 2865
Asn Asn Glu Pro Tyr Asp Asp Phe Arg Leu Pro Asn Gly Lys Ile
2870 2875 2880
Cys Thr Ser Glu Ser Glu Phe Gly Asn Gly Tyr Gly Leu Val His
2885 2890 2895
Ser Cys Pro Lys Val Gln Ala Pro Glu His Ser His His Gln Met
2900 2905 2910
His Ala Ala Leu Pro Pro Ala Cys Glu Gln Val Phe Gly Gly Ile
2915 2920 2925
Ser Pro Leu Arg Pro Val Ser Leu Leu Leu Asp Val Ser Pro Phe
2930 2935 2940
Arg Gln Ala Cys Ile His Ala Val Thr Gly Ala Asp Ala Ala Lys
2945 2950 2955
Asp Leu His Gln Ala Cys Asp Leu Ala Arg Gly Tyr Ala Ala Leu
2960 2965 2970
Ala Leu Thr Gly Met Leu Pro Ala Val Leu Pro Asp Val Cys Val
2975 2980 2985
Arg Cys Thr Asp Ala Asp Lys Pro Arg Ala Ile Gly Asp Met Tyr
2990 2995 3000
Glu Val Lys Met Pro Asn Lys Gln Ala Asp Ile Val Val Ser Phe
3005 3010 3015
Glu Thr Thr Gln Asn Asn Glu Gln Thr Tyr Lys Glu Leu Val Met
3020 3025 3030
Pro Leu Val Thr Gln Leu Val Asp Asn Leu Lys Lys Lys Gln Ile
3035 3040 3045
Thr Asp Ile Lys Leu Tyr Leu Val Gly His Thr Ser Lys His Pro
3050 3055 3060
Tyr Ala Ile Leu Tyr Asp Thr Asp Leu Lys Leu Lys Ser Ser Lys
3065 3070 3075
Leu His Phe Asp Asp Thr Asp Arg Tyr Asp Arg Thr Pro Tyr Val
3080 3085 3090
Lys Thr Gly Phe Glu Thr Phe Asp Lys Tyr Glu Lys Asn Leu Val
3095 3100 3105
Glu Phe Ile Asp Ala Val Lys Ile Lys Leu Gly Ile Thr Asn Ile
3110 3115 3120
Ala Phe Ser Glu Tyr Ser Leu Met Asp Leu Pro Phe Arg Ala Gly
3125 3130 3135
Ala Val Lys His Val Phe Leu Thr Val Ser Glu Pro Cys Ile Glu
3140 3145 3150
Glu Phe Phe Leu Val Lys Val Val Gly Asp Leu Met Phe Lys Val
3155 3160 3165
Leu Leu Glu Asn Met Gly Met Ser Met Ser Leu Val Thr Ala Thr
3170 3175 3180
Pro Glu Met Lys Cys Gly Gly Asn Leu Ala His Val Val Gly Phe
3185 3190 3195
Asp Glu Ser Ser Val Leu Met Leu Gly Asn Met Lys Arg Thr Lys
3200 3205 3210
Glu Ser Glu Ala Leu Arg Ala Thr Leu Glu Leu Pro Ser Ser Ser
3215 3220 3225
Cys Ile Asp Phe Thr Gln Ala Val Asp Gly Leu Val Phe Ser Ser
3230 3235 3240
Thr Asn Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gln Arg Lys Gln Phe Leu
3245 3250 3255
Gln Thr Ala Ala Asn Ala Ile Thr Gln Lys Met Thr Lys Ala His
3260 3265 3270
Leu Val Gln Glu Cys Thr Cys Thr Tyr Val Asp Pro Phe Arg Val
3275 3280 3285
Arg Ser Ala Cys Phe Thr Arg Glu Lys Lys Glu Val Ala Arg Arg
3290 3295 3300
Arg Lys
3305
<210> 3
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始
<400> 3
Met Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala
1 5 10 15
Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr
20 25 30
Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile
35 40 45
Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser
50 55 60
Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro
65 70 75 80
Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg
85 90 95
Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu
100 105 110
Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro
115 120 125
Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser
130 135 140
Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser
145 150 155 160
Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile
165 170 175
Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile
180 185 190
Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser
195 200 205
Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly
210 215 220
Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser
225 230 235 240
Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe
245 250 255
Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala
260 265 270
Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu
275 280 285
Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile
290 295 300
Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr
325 330 335
Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu
340 345 350
Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg
355 360 365
His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln
370 375 380
Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly
385 390 395 400
Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile
405 410 415
Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro
420 425 430
Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile
435 440 445
Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His
450 455 460
Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu
465 470 475 480
Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala
485 490 495
Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys
500 505 510
Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu
515 520 525
Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe
530 535 540
Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys
545 550 555 560
Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe
565 570 575
Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn
580 585 590
Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr
595 600 605
Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val
610 615 620
Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln
625 630 635 640
Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr
645 650 655
Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg
660 665 670
Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg
675 680 685
Arg
<210> 4
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)...(7)
<223> 人工增添組氨酸標簽
<400> 4
Met His His His His His His Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser
20 25 30
Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val
35 40 45
Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn
50 55 60
Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp
65 70 75 80
Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe
85 90 95
Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp
100 105 110
Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu
115 120 125
Gln Thr Glu Gln Lys Pro Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys
130 135 140
Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His
145 150 155 160
Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn
165 170 175
Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met
180 185 190
Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly
195 200 205
Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe
210 215 220
Ser Val Gly Glu Asn Gly Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr
225 230 235 240
Leu Thr Gly Lys Ser Ser Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu
245 250 255
Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro
260 265 270
Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser
275 280 285
Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu
290 295 300
Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr
305 310 315 320
Ser Gln Val Lys Gly Ser Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala
325 330 335
Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile
340 345 350
Leu Lys Ser Arg Glu Leu Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu
355 360 365
Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala
370 375 380
Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly
385 390 395 400
Val Gly Ala Leu Ala Gly Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr
405 410 415
Thr Lys Pro Val Gly Ile Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys
420 425 430
Leu Gln Asn Cys Arg Pro Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val
435 440 445
Ala Ile Leu Lys Gly Ile Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu
450 455 460
Ile Asn Lys Ile Val His Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser
465 470 475 480
Val Lys Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala
485 490 495
Ala Ile Lys Lys Thr Ala Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp
500 505 510
Ser Glu Ile Arg Ile Lys Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys
515 520 525
Gly Gln Ser Ala Asn Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val
530 535 540
His Gln Val Gly Asn Phe Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr
545 550 555 560
Ser Ala Asn Pro Asp Lys Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile
565 570 575
Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr
580 585 590
Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val
595 600 605
Asp Gln Thr Val Ile Tyr Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala
610 615 620
Ser Val Asn Leu Thr Val Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn Val Leu
625 630 635 640
Glu Leu Gly Gly Arg Gln Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe
645 650 655
Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr
660 665 670
Asp Asp Leu Val Lys Arg Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg
675 680 685
Gly Phe Gly Arg Gly Arg Arg
690 695
<210> 5
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (690)...(695)
<223> 人工增添組氨酸標簽
<400> 5
Met Asp Lys Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala
1 5 10 15
Phe Val Gln Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr
20 25 30
Ile Phe Leu Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile
35 40 45
Gly Gln Val Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser
50 55 60
Val Gln Asn Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro
65 70 75 80
Pro Pro Gly Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg
85 90 95
Val Gly Pro Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu
100 105 110
Asn Ile Lys Arg Ala Ile Ile Ser Leu Leu Gln Thr Glu Gln Lys Pro
115 120 125
Ser Thr Gln Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser
130 135 140
Ser Gln Glu Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser
145 150 155 160
Arg Cys Ser His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile
165 170 175
Thr Asn Pro Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile
180 185 190
Leu Asn Val Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser
195 200 205
Ala Thr Glu Glu Tyr Leu Tyr Lys Pro Phe Ser Val Gly Glu Asn Gly
210 215 220
Ala Arg Ala Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser
225 230 235 240
Cys Gly Gln Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe
245 250 255
Asp Asn Pro His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala
260 265 270
Leu Ala Ala Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu
275 280 285
Ser Lys Ser Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile
290 295 300
Thr Ser Lys Asp Asp Leu Met Lys Val Tyr Ser Gln Val Lys Gly Ser
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr
325 330 335
Gly Asp Ser Ile Glu Ala Ser Ile Asn Ile Leu Lys Ser Arg Glu Leu
340 345 350
Gly Gln Leu Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg
355 360 365
His Val Asn Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln
370 375 380
Pro Asn Leu Pro Lys Glu Val Tyr Leu Gly Val Gly Ala Leu Ala Gly
385 390 395 400
Ala Tyr Cys Arg Glu His Glu Cys His Thr Thr Lys Pro Val Gly Ile
405 410 415
Val Ala Leu Ser Gln Lys Leu Gly Ala Lys Leu Gln Asn Cys Arg Pro
420 425 430
Arg Ser Lys Thr Glu Glu Asp Thr Ile Val Ala Ile Leu Lys Gly Ile
435 440 445
Arg Ser Ile Arg His Leu Glu Asp Ser Leu Ile Asn Lys Ile Val His
450 455 460
Cys Ala Ala Asp Asn Asn Val Lys Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala Leu
465 470 475 480
Glu Ala Phe His Ala Asp Pro Cys Ser Ala Ala Ile Lys Lys Thr Ala
485 490 495
Ile Glu Ile Met Lys Asn Arg Gln Leu Asp Ser Glu Ile Arg Ile Lys
500 505 510
Ala Tyr Leu Ala Val Ile Gln Cys Pro Cys Gly Gln Ser Ala Asn Glu
515 520 525
Ile Lys Asn Leu Leu Asp Thr Glu Pro Val His Gln Val Gly Asn Phe
530 535 540
Ile Ser Thr Ser Leu Arg Tyr Ile Arg Thr Ser Ala Asn Pro Asp Lys
545 550 555 560
Gln Leu Ala Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe
565 570 575
Asn Ser Asp Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn
580 585 590
Ile Asp Ala Leu Gly Ala Gly Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Ile Tyr
595 600 605
Ser Gln Asp Ser Tyr Leu Pro Arg Glu Ala Ser Val Asn Leu Thr Val
610 615 620
Glu Leu Phe Gly His Ser Tyr Asn Val Leu Glu Leu Gly Gly Arg Gln
625 630 635 640
Gly Asn Leu Asp Arg Val Ile Glu His Phe Leu Gly Pro Lys Gly Tyr
645 650 655
Phe Arg Thr Ser Asp Pro Gln Ala Leu Tyr Asp Asp Leu Val Lys Arg
660 665 670
Tyr Glu Glu Ser Lys Asn Lys Val Gln Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg
675 680 685
Arg His His His His His His
690 695
<210> 6
<211> 702
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> INIT_MET
<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)...(7)
<223> 人工增添組氨酸標簽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)...(13)
<223> 人工增添凝血酶酶切位點
<400> 6
Met His His His His His His Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys Asp Lys
1 5 10 15
Cys Ser Ile Glu Cys Gln Gly Ser Pro Ser Asn Pro Ala Phe Val Gln
20 25 30
Gly Asn Lys Tyr Ser Tyr Ser Val Glu Gly Thr Val Thr Ile Phe Leu
35 40 45
Ser Pro Ala Asp Asp Gln Val Thr Ser Val Lys Leu Ile Gly Gln Val
50 55 60
Ser Val Asp Ala Leu Ala Asn Cys Val His Glu Leu Ser Val Gln Asn
65 70 75 80
Leu Val Ile Ser Gly Pro Asp Gly Lys Lys Tyr Gln Pro Pro Pro Gly
85 90 95
Ile Asp Lys Val Val Arg Phe Gly Phe Gln Asp Gly Arg Val Gly Pro
100 105 110
Glu Ile Cys Ala His Gly Asp Asp Thr Arg Arg Ser Leu Asn Ile Lys
115 120 125
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130 135 140
Val Asp Val Phe Gly Val Cys Pro Thr Glu Val Ser Ser Ser Gln Glu
145 150 155 160
Gly Ser Ala Val Leu Val His Arg Thr Arg Asp Leu Ser Arg Cys Ser
165 170 175
His Arg Glu Gln Gly Lys Asn Asp Ile Ile Thr Ser Ile Thr Asn Pro
180 185 190
Asp Ala Gly Ile Lys Asp Met Gln Val Leu Gln Ser Ile Leu Asn Val
195 200 205
Glu Ser Lys Val Asn Ser Gly Val Pro Glu Lys Val Ser Ala Thr Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Lys Val His Thr Lys Leu Thr Leu Thr Gly Lys Ser Ser Cys Gly Gln
245 250 255
Gly Val Ala Tyr Cys Thr Glu Ser Arg Ser Ile Ile Phe Asp Asn Pro
260 265 270
His Gly Val Lys Pro Val Pro Gly Asn Ala Asn Ser Ala Leu Ala Ala
275 280 285
Val Lys Asp Val Ala Lys Ser Val Ser Ser Ile Val Glu Ser Lys Ser
290 295 300
Ala Gly Ala Phe Ala Gln Leu Ile Arg Ile Leu Arg Ile Thr Ser Lys
305 310 315 320
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325 330 335
Lys Arg Val Phe Leu Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ser
340 345 350
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355 360 365
Glu Gln Gln Leu Val Tyr Leu Ser Leu Gly Asn Ala Arg His Val Asn
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Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ser Leu Leu Asp Gln Pro Asn Leu
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450 455 460
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Arg Gln His Tyr Gly Leu Ile Arg Thr Pro Asn Lys Phe Asn Ser Asp
580 585 590
Asp Arg Lys Tyr Ser Phe Tyr Arg Glu Thr Ser Phe Asn Ile Asp Ala
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2016-10-01
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