本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒，及其檢測方法。

背景技術(shù)：

遺傳性果糖不耐受癥(Hereditary Fructose Intolerance，簡稱HFI)是為果糖代謝病的一種，為常染色體隱性遺傳病，是由于醛縮酶B基因(ALDOB基因)突變致B型醛縮酶缺乏或活性降低，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)果糖代謝的異常。

目前檢測人果糖二磷酸醛縮酶B基因的主要技術(shù)為基因測序，存在低通量、操作復(fù)雜、耗時長等缺點。

熒光定量PCR技術(shù)是一項發(fā)展較為成熟的核酸檢測方法。其優(yōu)勢在于：操作簡便，因閉管操作可以減少污染，結(jié)果分析快捷。其中Taqman探針技術(shù)是一種通過檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，以下簡稱PCR)過程中產(chǎn)生的熒光信號來區(qū)分等位基因類型的基因檢測技術(shù)。針對待檢測的基因位點，設(shè)計一對Taqman探針及其對應(yīng)上下游引物，所述探針對分別檢測目標(biāo)位點的兩種等位基因。每條探針的5'端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。在PCR擴(kuò)增過程中，利用Taq酶5’端核酸酶活性降解因與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)而結(jié)合在單鏈上的探針，令熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離從而產(chǎn)生熒光。若探針與目標(biāo)序列存在錯配，則不能與單鏈結(jié)合，亦不會產(chǎn)生熒光。因此通過熒光定量PCR儀收集PCR擴(kuò)增期間熒光信號的變化，可以判別檢測樣本的基因型。Taqman探針技術(shù)最突出的優(yōu)點是不需要分離或洗脫等PCR后處理過程，簡化操作流程并提高了檢測速度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種高準(zhǔn)確性、低成本、高通量、快速的檢測試劑盒，可用于檢測人果糖二磷酸醛縮酶B基因是否存在突變。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括特異識別人果糖二磷酸醛縮酶B基因上多態(tài)性位點A150P、A175D和N335K的野生型探針和突變型探針，對應(yīng)3個多態(tài)性位點的野生型探針和突變型探針如下表所示：

表1、各個多態(tài)性位點的探針序列

W代表野生型特異探針，M代表突變型特異探針。

優(yōu)選地，每條探針的5’和3’端都分別標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。所述熒光報告基團(tuán)可以是FAM、TET、HEX、NED、TAMRA或ROX中的一種，所述淬滅基團(tuán)可以是BHQ-1或BHQ-2。

進(jìn)一步，所述試劑盒還包括用于擴(kuò)增人果糖二磷酸醛縮酶B基因上3個多態(tài)性位點所對應(yīng)的引物對，所述引物對包括上游引物和下游引物，對應(yīng)3個多態(tài)性位點的上游引物和下游引物如下表所示：

表2、各個多態(tài)性位點的引物序列

F代表上游引物，R代表下游引物。

本發(fā)明所述人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒還包括純合子標(biāo)準(zhǔn)品和雜合子標(biāo)準(zhǔn)品。單個多態(tài)性位點具有3種分型，兩種純合子型以及一種雜合子型。針對一組體系，應(yīng)用到兩種純合子標(biāo)準(zhǔn)品及一種雜合子標(biāo)準(zhǔn)品。所述純合子標(biāo)準(zhǔn)品同時對應(yīng)于3個多態(tài)性位點的純合子型，雜合子標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)于3個多態(tài)性位點的雜合子型。標(biāo)準(zhǔn)品均由含多態(tài)性位點擴(kuò)增片段的質(zhì)粒組成。

一組體系的純合子標(biāo)準(zhǔn)品由1種質(zhì)粒構(gòu)成，雜合子標(biāo)準(zhǔn)品由2種質(zhì)粒構(gòu)成。體系的野生型純合子標(biāo)準(zhǔn)品1由含有A150P-G型、A175D-C型和N335K-C型的質(zhì)粒組成，其對應(yīng)的檢測熒光報告基團(tuán)分別為FAM、HEX及TAMRA，突變型純合子標(biāo)準(zhǔn)品2由含有A150P-C型、A175D-A型和N335K-G型的質(zhì)粒組成，其對應(yīng)的檢測熒光報告基團(tuán)分別為NED、ROX及TET，雜合子標(biāo)準(zhǔn)品3由野生型純合子標(biāo)準(zhǔn)品1和突變型純合子標(biāo)準(zhǔn)品2的質(zhì)?；旌辖M成，其檢測熒光報告基團(tuán)分別為FAM、NED、HEX、ROX、TAMRA及TET。所述野生型純合子標(biāo)準(zhǔn)品1的質(zhì)粒包含如下序列：

TCAGTGTTGTGATTAATGCTGATATGCTTGGCTGTTTTCAATCCTCAAGCACAGTGGATTGAAAGCTAAGCAAAGGGAGAACTCCTTCCCTTTATTAGAAGCCCCATGGATCAGGTACAAAGGTACAAAGAAGCCTTTCTCTCTTTTGTGACTTGCAGGGCTTGATGGCCTCTCAGAGCGCTGTGCTCAGTACAAGAAAGATGGTGTTGACTTTGGGAAGTGGCGTGCTGTGCTGAGGATTGCCGACCAGTGTCCATCCAGCCTCGCTATCCAGGAAAACGCCAACGCCCTGGCTCGCTACGCCAGCATCTGTCAGCAGGTGCTCTGCCTTCCCCTTGGGCTGAAAAAGAGTAGGCTAGAGTTTTCTTCAGAGCTTTTCTTTTCAATTATACTATAACTACAAATGGACCTCCTTTTCCCTCACCAGTATATCCTAGTGGCATTTTTCACAACTTTTGCTATAGCCAACTGTGGTAGGGAAAGATTTGGTAGAAGGGGATGGTATCCCCAGCAATATTCAGCAACATTGCTGTAAAAAGAAGAAAATCTGAGTGAAGGTTTGACTGGTTTCCCATGAGAGGCAGACAGGGTCAAGGTGGGGTCACATTTACTCTAACCAGTCTCCTCTCTCATATTTGTCTTCTAGGCTAACTGCCAGGCGGCCAAAGGACAGTATGTTCACACGGGTTCTTCTGGGGCTGCTTCCACCCAGTCGCTCTTCACAGCCTGCTATACCTACTAGGGTCCAATGCCCGCCAGCCTAGCTCCAGTGCTTCTAGTAGGAGGGCTGAAAGGGAGCAACTTTTCCTCCAATCCTGGAAATTCGACACAATTAGATTT(SEQ ID NO.13)。

所述突變型純合子標(biāo)準(zhǔn)品序列：

TCAGTGTTGTGATTAATGCTGATATGCTTGGCTGTTTTCAATCCTCAAGCACAGTGGATTGAAAGCTAAGCAAAGGGAGAACTCCTTCCCTTTATTAGAAGCCCCATGGATCAGGTACAAAGGTACAAAGAAGCCTTTCTCTCTTTTGTGACTTGCAGGGCTTGATGGCCTCTCAGAGCGCTGTGCTCAGTACAAGAAAGATGGTGTTGACTTTGGGAAGTGGCGTCCTGTGCTGAGGATTGCCGACCAGTGTCCATCCAGCCTCGCTATCCAGGAAAACGCCAACGCCCTGGCTCGCTACGACAGCATCTGTCAGCAGGTGCTCTGCCTTCCCCTTGGGCTGAAAAAGAGTAGGCTAGAGTTTTCTTCAGAGCTTTTCTTTTCAATTATACTATAACTACAAATGGACCTCCTTTTCCCTCACCAGTATATCCTAGTGGCATTTTTCACAACTTTTGCTATAGCCAACTGTGGTAGGGAAAGATTTGGTAGAAGGGGATGGTATCCCCAGCAATATTCAGCAACATTGCTGTAAAAAGAAGAAAATCTGAGTGAAGGTTTGACTGGTTTCCCATGAGAGGCAGACAGGGTCAAGGTGGGGTCACATTTACTCTAACCAGTCTCCTCTCTCATATTTGTCTTCTAGGCTAAGTGCCAGGCGGCCAAAGGACAGTATGTTCACACGGGTTCTTCTGGGGCTGCTTCCACCCAGTCGCTCTTCACAGCCTGCTATACCTACTAGGGTCCAATGCCCGCCAGCCTAGCTCCAGTGCTTCTAGTAGGAGGGCTGAAAGGGAGCAACTTTTCCTCCAATCCTGGAAATTCGACACAATTAGATTT(SEQ ID NO.14)。

標(biāo)準(zhǔn)品中同種質(zhì)粒的拷貝數(shù)一致。標(biāo)準(zhǔn)品的制備可以根據(jù)NCBI上公開的人果糖二磷酸醛縮酶B基因序列采用常規(guī)的T-A克隆方法制備得到。

進(jìn)一步，樣品的檢測通過六重?zé)晒舛縋CR實現(xiàn)，同一組中的6個探針用不同熒光色進(jìn)行標(biāo)記。所述探針的熒光基團(tuán)選自FAM、TET、HEX、NED、TAMRA及ROX。FAM、NED探針用于檢測多態(tài)性位點A150P，HEX、ROX探針用于檢測多態(tài)性位點A175D,TAMRA、TET探針用于檢測多態(tài)性位點N335K。

所述的人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒還包括PCR緩沖液、熱啟動HS-Taq酶、超純水，純合子標(biāo)準(zhǔn)品和雜合子標(biāo)準(zhǔn)品。

本發(fā)明還提供了使用上述人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒的檢測方法，包括對樣本中人果糖二磷酸醛縮酶B基因的3個多態(tài)性位點的擴(kuò)增采用六重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)，采用熒光定量PCR儀對反應(yīng)過程中的熒光信號進(jìn)行收集，使用SDS軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，與標(biāo)準(zhǔn)品對比獲得基因分型結(jié)果。

其中，六重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)的擴(kuò)增程序為：初始變性，95℃保持10分鐘；熱循環(huán)40次，每次先95℃保持15秒，隨后60℃保持1分鐘；循環(huán)完畢后16℃保溫。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，提高了多態(tài)性位點檢測的模板量，大大降低假陽性；

(2)Taqman探針通過配備不同的熒光報告基團(tuán)，在一次六重?zé)晒舛縋CR下最多可以檢測3個位點的基因分型，具有高效節(jié)約的特點；

(3)六重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)在2個小時內(nèi)完成，Taqman探針特異性高，此檢測方法具有用時少，快速和準(zhǔn)確度高的特點；

(4)閉管檢測，減少人為及環(huán)境污染，提高準(zhǔn)確性。

(5)操作及結(jié)果判定簡單：整個PCR擴(kuò)增過程可以通過電腦軟件進(jìn)行實時檢測,能夠隨時掌握PCR擴(kuò)增情況；PCR擴(kuò)增結(jié)果在電腦上直接顯示,無需電泳、染色等步驟,避免了使用有毒試劑和肉眼判斷結(jié)果的主觀性。

附圖說明

圖1是試劑盒中純合子標(biāo)準(zhǔn)品1的檢測圖譜，十字(FAM)代表A150P野生型、正方形(HEX)代表A175D野生型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型；

圖2是試劑盒中純合子標(biāo)準(zhǔn)品2的檢測圖譜，菱形(NED)代表A150P突變型、叉號(ROX)代表A175D突變型、圓形(TET)代表N335K突變型；

圖3是試劑盒中雜合子標(biāo)準(zhǔn)品3的檢測圖譜,十字(FAM)代表A150P野生型、菱形(NED)代表A150P突變型、正方形(HEX)代表A175D野生型、叉號(ROX)代表A175D突變型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型、圓形(TET)代表N335K突變型；

圖4是實施例1的檢測圖譜，十字(FAM)代表A150P野生型、正方形(HEX)代表A175D野生型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型，說明檢測樣本為野生型純合子；

圖5是實施例2的檢測圖譜，十字(FAM)代表A150P野生型、菱形(NED)代表A150P突變型、正方形(HEX)代表A175D野生型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型；

圖6是實施例3的檢測圖譜，十字(FAM)代表A150P野生型、正方形(HEX)代表A175D野生型、叉號(ROX)代表A175D突變型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型；

圖7是實施例4的檢測圖譜，不同形狀標(biāo)記的曲線代表不同熒光基團(tuán)及對應(yīng)基因位點的多態(tài)性：菱形(NED)代表A150P突變型、正方形(HEX)代表A175D野生型、三角形(TAMRA)代表N335K野生型。

具體實施方式

下面通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1：人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒的組成和使用方法

所述檢測試劑盒包括的用于特異性識別人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢上3個多態(tài)性位點的Taqman探針及用于擴(kuò)增多態(tài)性位點所在基因片段所對應(yīng)的引物對，具體為如下表所示：

表3、檢測試劑盒的組成

所述人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒的使用方法：

1、樣本DNA的提取

根據(jù)樣本的實際情況，選擇合適的方法提取樣本DNA，常見的方法有磁珠法、陰離子交換樹脂法和堿裂解法等等；

2、熒光定量PCR反應(yīng)

熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系如下：

表4、熒光定量PCR反應(yīng)體系

熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序如下：

表5、熒光定量PCR擴(kuò)增程序

3、軟件分析獲得結(jié)果

使用軟件SDS2.4對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

實施例2：標(biāo)準(zhǔn)圖譜的建立：

按實施例1的使用方法，對人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒內(nèi)的純合子標(biāo)準(zhǔn)品和雜合子標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，獲得如圖1和2所示的純合子標(biāo)準(zhǔn)品的檢測圖譜以及如圖3所示的雜合子標(biāo)準(zhǔn)品的檢測圖譜。

實施例3：一號樣品檢測

按實施例1的使用方法，對一號樣本進(jìn)行檢測，獲得如圖4所示的圖譜，可知一號樣本為純合野生型。

實施例4：二號樣品檢測

按實施例1的使用方法，對二號樣本的檢測結(jié)果如圖5所示，可知二號樣本在目的基因位點A150P存在突變。

實施例5：三號樣本檢測

按實施例1的使用方法，對三號樣本的檢測結(jié)果如圖6所示，可知三號樣本在目的基因位點A175D存在突變。

實施例6：四號樣本檢測

按實施例1的使用方法，對四號樣本的檢測結(jié)果如圖7所示，可知四號樣本在目的基因位點A150P存在突變。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東華美眾源生物科技有限公司

<120> 一種人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒及其檢測方法

<130> 2016

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

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ctttgggaag tggcgtgctg tgct 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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ctttgggaag tggcgtcctg tgct 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gtgctcagta caagaaagat ggtgtt 26

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acagatgctg gcgtagcgag ccag 24

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<212> DNA

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<400> 6

acagatgctg tcgtagcgag ccagg 25

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<212> DNA

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<400> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<211> 24

<212> DNA

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<400> 10

ttggccgcct ggcacttagc ctag 24

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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tcagtgttgt gattaatgct gatatgcttg gctgttttca atcctcaagc acagtggatt 60

gaaagctaag caaagggaga actccttccc tttattagaa gccccatgga tcaggtacaa 120

aggtacaaag aagcctttct ctcttttgtg acttgcaggg cttgatggcc tctcagagcg 180

ctgtgctcag tacaagaaag atggtgttga ctttgggaag tggcgtgctg tgctgaggat 240

tgccgaccag tgtccatcca gcctcgctat ccaggaaaac gccaacgccc tggctcgcta 300

cgccagcatc tgtcagcagg tgctctgcct tccccttggg ctgaaaaaga gtaggctaga 360

gttttcttca gagcttttct tttcaattat actataacta caaatggacc tccttttccc 420

tcaccagtat atcctagtgg catttttcac aacttttgct atagccaact gtggtaggga 480

aagatttggt agaaggggat ggtatcccca gcaatattca gcaacattgc tgtaaaaaga 540

agaaaatctg agtgaaggtt tgactggttt cccatgagag gcagacaggg tcaaggtggg 600

gtcacattta ctctaaccag tctcctctct catatttgtc ttctaggcta actgccaggc 660

ggccaaagga cagtatgttc acacgggttc ttctggggct gcttccaccc agtcgctctt 720

cacagcctgc tatacctact agggtccaat gcccgccagc ctagctccag tgcttctagt 780

aggagggctg aaagggagca acttttcctc caatcctgga aattcgacac aattagattt 840

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aggtacaaag aagcctttct ctcttttgtg acttgcaggg cttgatggcc tctcagagcg 180

ctgtgctcag tacaagaaag atggtgttga ctttgggaag tggcgtcctg tgctgaggat 240

tgccgaccag tgtccatcca gcctcgctat ccaggaaaac gccaacgccc tggctcgcta 300

cgacagcatc tgtcagcagg tgctctgcct tccccttggg ctgaaaaaga gtaggctaga 360

gttttcttca gagcttttct tttcaattat actataacta caaatggacc tccttttccc 420

tcaccagtat atcctagtgg catttttcac aacttttgct atagccaact gtggtaggga 480

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cacagcctgc tatacctact agggtccaat gcccgccagc ctagctccag tgcttctagt 780

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