本發(fā)明涉及一種浙江省地方豬種tagSNP鑒定方法。(二)
背景技術(shù)：
：浙江省擁有豐富多樣的地方豬資源，根據(jù)最新《豬志》統(tǒng)計，浙江省擁有7個地方豬品種分別為嘉興黑豬，淳安花豬，金華兩頭烏，嵊縣花豬，蘭溪花豬，碧湖豬以及岔路黑豬。目前為止對于這些品種的鑒定主要依據(jù)體型外貌，在活體時，對于金華兩頭烏、嵊縣花豬等外貌差異較大的豬是可行的，而幾個黑色外貌的豬往往難以區(qū)分，但在屠宰后，從胴體上一般無法區(qū)分。而采用分子標(biāo)記就可以解決這一問題。(三)技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種浙江省地方豬種tagSNP鑒定方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種浙江省地方豬種tagSNP鑒定方法，所述方法包括：(1)提取樣品基因組DNA：由樣品豬采集肉樣、耳樣等組織樣或者血樣，用試劑盒提取基因組DNA即可；(2)根據(jù)特異性SNP座位所在染色體和位置信息設(shè)計擴(kuò)增引物，依次分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳：各豬種特異性SNP座位如下：碧湖豬特異性SNP座位：淳安花豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr113969970CT2chr1468345209AG3chr14135018196AT4chr82228395CT岔路黑豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr1850634190CG2chr1857736749CT3chr374403769GA4chr476217102GA5chr637444222CT金華兩頭烏特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr1257635960GA2chr1394944468GA3chr1734662047CT4chr1853715725GA5chr713107153CT嘉興黑豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr115214978CT2chr1122873017TA3chr136763069GC4chr24585814GA5chr231124306AG蘭溪花豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr1388462451CA2chr13201999446CT3chr1656032490CT4chr1761813810CT5chr621197790TC嵊縣花豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr1061186504CT2chr1261412548TC3chr13213292913CA4chr1423522515CG5chr14130678090TG(3)結(jié)果判斷：根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，參照上述各豬種特異性SNP座位進(jìn)行判定：若檢測到有一個以上座位與上述特異性SNP座位相符，則判定為具有該特異性座位的品種。可按照順序從上往下依次進(jìn)行PCR檢驗，只要有1個座位檢測到SNP座位就鑒定為具有該SNP特異座位的豬品種，即可終止檢測。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明通過2代測序測得高密度SNP座位，通過兩兩比對找到這些地方豬種特有的SNP分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記在基因組水平上提供了品種鑒定的依據(jù)，通過對tagSNP的分型即可鑒定地方豬品種，方法簡單快捷，可操作性強(qiáng)。(四)附圖說明圖1為樣品豬基因組DNA(A)和酶切產(chǎn)物-PCR(B)電泳結(jié)果。(五)具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：實施例1：1.材料與方法1.1試驗材料采用10個豬種共491頭豬作為試驗動物，其中杜洛克(DD)49頭，長白(LL)37頭，大白(YY)37頭，嘉興黑豬(JX)89頭，岔路黑豬(CL)44頭，金華豬(JH)57頭，嵊縣花豬(SX)67頭，淳安花豬(CA)59頭，碧湖豬(BH)28頭，蘭溪花豬(LX)24頭。每頭豬采耳樣0.5g，裝入盛有乙醇的1.5ml離心管中凍存。1.2試驗方法1.2.1基因組DNA提取采用杭州開泰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA。DNA濃度測定儀測定濃度大于50ng/μl，OD值在1.8-2.0之間，電泳條帶完整為合格DNA，存于-70℃冰箱保存。1.2.2基因組文庫建立選擇限制性內(nèi)切酶AvaII進(jìn)行酶切，設(shè)計barcoding-adapter，PCR擴(kuò)增后選擇片段范圍為300～400bp進(jìn)行割膠回收。回收的PCR產(chǎn)物由上海晶能公司進(jìn)行高通量測序，測序平臺為Hisq2000。1.2.3SNP篩選應(yīng)用BWA和SamTools軟件對高通量結(jié)果進(jìn)行匹配和SNP篩選，參考基因組SSC10.2從GenBank上下載。利用iBLUP軟件對基因型進(jìn)行填補(bǔ)，最后用Plink1.07軟件對SNP進(jìn)行過濾，過濾條件為：Callrate>0.35,MAF>0.05，HWE>10-6。1.2.4數(shù)據(jù)處理應(yīng)用Mage6.0軟件對篩選得到的SNP座位用最大似然法計算10個豬種各個個體之間的遺傳距離，并利用Neighbor-tree法構(gòu)建10個品種的聚類分析圖。2.結(jié)果與分析2.1基因組DNA以及酶切產(chǎn)物-PCR凝膠電泳圖譜基因組DNA電泳結(jié)果如圖1A所示，基因組DNA條帶清晰可見且沒有拖尾，說明基因組DNA提取質(zhì)量良好，無降解也無RNA污染。酶切產(chǎn)物-PCR結(jié)果如圖1B所示，300-400處條帶鮮明光亮，說明此片段范圍內(nèi)DNA濃度充足，對300-400片段處進(jìn)行割膠回收。3.SNP分子標(biāo)記通過2代測序測得高密度SNP座位，通過兩兩比對找到這些地方豬種特有的SNP分子標(biāo)記如下：碧湖豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr1162145327GT2chr15151642291TC3chr57987665GA4chr57987678GA5chr511991156GA淳安花豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr113969970CT2chr1468345209AG3chr14135018196AT4chr82228395CT岔路黑豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr1850634190CG2chr1857736749CT3chr374403769GA4chr476217102GA5chr637444222CT金華兩頭烏特異性SNP座位：嘉興黑豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr115214978CT2chr1122873017TA3chr136763069GC4chr24585814GA5chr231124306AG蘭溪花豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr1388462451CA2chr13201999446CT3chr1656032490CT4chr1761813810CT5chr621197790TC嵊縣花豬特異性SNP座位：序號所在染色體所在位置參考基因組突變位點1chr1061186504CT2chr1261412548TC3chr13213292913CA4chr1423522515CG5chr14130678090TG這些分子標(biāo)記在基因組水平上提供了浙江省地方豬品種鑒定的依據(jù)，通過對tagSNP的分型即可鑒定樣品所屬的地方豬品種。當(dāng)前第1頁1 2 3