本發(fā)明涉及一種利用伴生菌和酶解技術(shù)綜合利用高山葡萄的方法，屬農(nóng)產(chǎn)品加工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

高山葡萄屬東亞種群中的刺葡萄種，為強(qiáng)大的藤本植物，原產(chǎn)于南方雪峰山區(qū)，在高溫、濕、低光照生態(tài)環(huán)境下馴化選育而成。高山葡萄嫩葉呈紫紅色，成齡葉片心臟形，大而厚，較光滑，無光澤，邊緣鋸齒鈍。成熟的高山葡萄含糖量高達(dá)20%左右，蜂蜜香味濃郁，不但鮮食品質(zhì)好，而且釀酒品質(zhì)也屬一流，將結(jié)束我國南方各葡萄酒廠因原料品質(zhì)欠佳而釀不出高檔葡萄酒的局面，并將作為釀制高檔葡萄酒的首選原料，提升我國葡萄酒的品質(zhì)。

高山葡萄皮厚籽多，呈紫黑色，葡萄皮中含有大量白藜蘆醇、花青素等多種對人體有利的物質(zhì)，花青素具有抗氧化、抗衰老和清除人體自由基的重要保健作用；而白藜蘆醇是腫瘤的化學(xué)預(yù)防劑，也是對降低血小板聚集，預(yù)防和治療動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學(xué)預(yù)防劑。但高山葡萄皮中也含有較多的單寧等澀味物質(zhì)，是葡萄酒澀味的主要來源，如果處理不當(dāng)會嚴(yán)重影響葡萄酒的品質(zhì)。

葡萄籽是葡萄酒廠的下腳料，經(jīng)曬干后分離葡萄皮、葡萄梗后所得產(chǎn)物，葡萄籽含有各種豐富的氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等。葡萄籽提取物中的原花青素具有清除自由基、抗氧化、抗前列腺癌、抗肝臟腫瘤的作用，還可以對抗神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

在發(fā)酵生產(chǎn)高山葡萄酒的過程中，如何最大限度的使葡萄皮中的白藜蘆醇、花青素等物質(zhì)溶出，提升高山葡萄酒的品質(zhì)和保健功能，又最大限度的降低葡萄酒中具有澀味的單寧類物質(zhì)含量，同時最大限度的利用葡萄籽資源，提高葡萄籽原花青素的提取率，既是綜合利用高山葡萄面臨的技術(shù)難題，也是現(xiàn)階段沒有解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗，摸索和總結(jié)出一種利用高山葡萄伴生菌發(fā)酵制作高山葡萄酒，并同時利用酶解技術(shù)提取副產(chǎn)物葡萄籽中原花青素的方法。

本發(fā)明包括以下幾個步驟：

（1）菌種采集、馴化與擴(kuò)大培養(yǎng)：將剛采集的高山葡萄皮搗碎后進(jìn)行壓榨，收集壓榨得到的液體，往液體中加入瓊脂，加熱、溶解和滅菌后做成2-20支試管斜面培養(yǎng)基，選取2-20顆長勢較好、剛采集的高山葡萄，將各顆葡萄皮上的“白灰”分別輕輕刮下，分別接種在斜面培養(yǎng)基上，篩選長勢好的試管斜面培養(yǎng)基，馴化3-6代，將馴化好的“白灰”進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得發(fā)酵制作高山葡萄酒的混合菌種。

經(jīng)后期的研究發(fā)現(xiàn)，新鮮葡萄皮上的“白灰”實(shí)質(zhì)上是混合菌，以酵母菌為主，其中也包括了能分解澀味物質(zhì)單寧的細(xì)菌、能分解果膠的細(xì)菌、以及能分解纖維素的細(xì)菌。

（2）配料和發(fā)酵：將剛采集的高山葡萄清洗后瀝干水分，然后除梗破碎，拌勻后接入（1）中得到的混合菌種，在25-35℃的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，12小時后加入3-5%的蔗糖混勻，48小時后繼續(xù)加入3-5%的蔗糖混勻，84小時后再加入3-5%的蔗糖混勻；發(fā)酵開始后每天攪拌1-2次，每次使上浮的葡萄皮重新浸入發(fā)酵液中；發(fā)酵5-7天后，當(dāng)發(fā)酵液中含糖量≤7g/L時，用粗篩網(wǎng)將發(fā)酵液過濾，將濾渣曬干后分離出皮和籽，皮用作動物飼料，籽粉碎后用正己烷脫脂，然后加入纖維素酶和果膠酶酶解3-5小時，最后用60%-80%的乙醇回流提取，提取液濃縮后干燥得葡萄籽原花青素提取物；濾液繼續(xù)發(fā)酵至含糖量≤4g/L時，虹吸出上層酒液，棄去底層酵母泥，將上層酒液在15-30℃的條件下繼續(xù)發(fā)酵15-30天即得高山葡萄酒。繼續(xù)發(fā)酵主要是蘋果酸-乳酸發(fā)酵，有利于改善葡萄酒的品質(zhì)和提升葡萄酒的口感。

利用本發(fā)明得到的高山葡萄酒為干紅型，酒精度12-18度，口感醇厚，風(fēng)味上佳，可溶性物質(zhì)、花青素和白藜蘆醇的含量都很高，無任何澀味和苦味，其中可溶性物質(zhì)是普通市售干紅的4-6倍，花青素含量是普通市售干紅的3-5倍，白藜蘆醇含量比普通市售干紅高出20%-50%。

利用本發(fā)明得到的葡萄籽原花青素提取物，由于采用纖維素酶和果膠酶酶解，有效破壞了植物細(xì)胞壁，有利于原花青素的提取，葡萄籽原花青素廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和保健食品領(lǐng)域，具有清除自由基、抗氧化、抗前列腺癌、抗肝臟腫瘤的作用，還可以對抗神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果還在于：

本發(fā)明是在發(fā)現(xiàn)新鮮葡萄皮上伴生的“白灰”實(shí)質(zhì)上是混合菌的基礎(chǔ)上做出的，混合菌以酵母菌為主，其中也包括了能分解澀味物質(zhì)單寧的細(xì)菌、能分解果膠的細(xì)菌、以及能分解纖維素的細(xì)菌?；旌暇械慕湍妇軐l(fā)酵液中的糖分轉(zhuǎn)化為酒精，這是釀制葡萄酒的基本條件；分解澀味物質(zhì)單寧的細(xì)菌能有效降解葡萄皮中的澀味物質(zhì)，降低葡萄酒的澀味和提升葡萄酒的口感；而分解果膠和纖維素的細(xì)菌能有效破壞植物細(xì)胞壁，使高山葡萄皮中本身含量就較高的花青素和白藜蘆醇等多酚類物質(zhì)最大限度的溶解到酒液中，由于花青素和白藜蘆醇本身具有較強(qiáng)的抗氧化、抗酸敗作用，因而酒液中豐富的花青素、白藜蘆醇等多酚類物質(zhì)能夠使葡萄酒在四、五年甚至更長的時間內(nèi)緩慢陳化但不會酸敗，從而避免了添加二氧化硫這種葡萄酒中普遍使用但卻對人體有一定危害作用的抗氧化、抗酸敗劑，是一種無硫葡萄酒，大幅度提升了葡萄酒的品質(zhì)。

本發(fā)明利用與高山葡萄伴生的混合菌種作為發(fā)酵菌種，并利用獨(dú)特的馴化方法增強(qiáng)伴生菌在發(fā)酵液中的適應(yīng)性和發(fā)酵能力，使伴生菌的各種功能和作用得以充分發(fā)揮，并有效縮短了發(fā)酵時間、提高了工作效率，酒精發(fā)酵的時間比常規(guī)法縮短了20%以上；發(fā)酵過程中，除添加蔗糖提供碳源，為伴生菌的繁殖提供有利條件外，沒有任何其他添加物，是一種完全生態(tài)化的釀酒方法。

本發(fā)明采用分步添加白糖的方法，使發(fā)酵液中含糖量始終保持在一個合理的水平，有利于伴生菌的繁殖和充分發(fā)揮各種伴生菌的功能作用。

由于白藜蘆醇和花青素在發(fā)酵初期溶解較快，而澀味物質(zhì)在發(fā)酵后期溶解較快，因而在發(fā)酵5-7天、發(fā)酵液中含糖量≤7g/L，此時酒精發(fā)酵沒有完全結(jié)束即將皮籽分離，這樣可以大大降低酒液中澀味物質(zhì)的含量，但對花青素和白藜蘆醇的溶解影響不大。

本發(fā)明還采用酶解技術(shù)提取副產(chǎn)物葡萄籽中的原花青素，具有提取效率高、能耗低，有效成分保留好的特點(diǎn)。

綜上所述，本發(fā)明通過將以上多項技術(shù)進(jìn)行有效集成，實(shí)現(xiàn)了高山葡萄的最佳綜合利用，市場競爭力強(qiáng)，應(yīng)用前景廣闊。

具體實(shí)施方式

以下對利用伴生菌和酶解技術(shù)綜合利用高山葡萄的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：

（1）菌種采集、馴化與擴(kuò)大培養(yǎng)：將剛采集的高山葡萄皮搗碎后進(jìn)行壓榨，收集壓榨得到的液體，往液體中加入瓊脂，加熱、溶解和滅菌后做成18支試管斜面培養(yǎng)基，選取18顆長勢較好、剛采集的高山葡萄，將各顆葡萄皮上的“白灰”分別輕輕刮下，分別接種在斜面培養(yǎng)基上，篩選長勢好的試管斜面培養(yǎng)基，馴化5代，將馴化好的“白灰”進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得發(fā)酵制作高山葡萄酒的混合菌種。

（2）配料和發(fā)酵：將剛采集的高山葡萄清洗后瀝干水分，然后除梗破碎，拌勻后接入（1）中得到的混合菌種，在25-35℃的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，12小時后加入4.5%的蔗糖混勻，48小時后繼續(xù)加入4.5%的蔗糖混勻，84小時后再加入4.5%的蔗糖混勻；發(fā)酵開始后每天攪拌1-2次，每次使上浮的葡萄皮重新浸入發(fā)酵液中；發(fā)酵6.5天后，當(dāng)發(fā)酵液中含糖量≤7g/L時，用粗篩網(wǎng)將發(fā)酵液過濾，將濾渣曬干后分離出皮和籽，皮用作動物飼料，籽粉碎后用正己烷脫脂，然后加入纖維素酶和果膠酶酶解3.5小時，最后用65%的乙醇回流提取，提取液濃縮后干燥得葡萄籽原花青素提取物；濾液繼續(xù)發(fā)酵至含糖量≤4g/L時，虹吸出上層酒液，棄去底層酵母泥，將上層酒液在15-30℃的條件下繼續(xù)發(fā)酵28天即得高山葡萄酒。

利用本發(fā)明得到的高山葡萄酒為干紅型，酒精度16.5度，口感醇厚，風(fēng)味上佳，可溶性物質(zhì)、花青素和白藜蘆醇的含量都很高，無任何澀味和苦味，其中可溶性物質(zhì)是普通市售干紅的5.2倍，花青素含量是是普通市售干紅的4.5倍，白藜蘆醇含量比普通市售干紅高出42%。

實(shí)施例2：

（1）菌種采集、馴化與擴(kuò)大培養(yǎng)：將剛采集的高山葡萄皮搗碎后進(jìn)行壓榨，收集壓榨得到的液體，往液體中加入瓊脂，加熱、溶解和滅菌后做成4支試管斜面培養(yǎng)基，選取4顆長勢較好、剛采集的高山葡萄，將各顆葡萄皮上的“白灰”分別輕輕刮下，分別接種在斜面培養(yǎng)基上，篩選長勢好的試管斜面培養(yǎng)基，馴化4代，將馴化好的“白灰”進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得發(fā)酵制作高山葡萄酒的混合菌種。

（2）配料和發(fā)酵：將剛采集的高山葡萄清洗后瀝干水分，然后除梗破碎，拌勻后接入（1）中得到的混合菌種，在25-35℃的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，12小時后加入3.1%的蔗糖混勻，48小時后繼續(xù)加入3.1%的蔗糖混勻，84小時后再加入3.1%的蔗糖混勻；發(fā)酵開始后每天攪拌1-2次，每次使上浮的葡萄皮重新浸入發(fā)酵液中；發(fā)酵5.5天后，當(dāng)發(fā)酵液中含糖量≤7g/L時，用粗篩網(wǎng)將發(fā)酵液過濾，將濾渣曬干后分離出皮和籽，皮用作動物飼料，籽粉碎后用正己烷脫脂，然后加入纖維素酶和果膠酶酶解4.8小時，最后用75%的乙醇回流提取，提取液濃縮后干燥得葡萄籽原花青素提取物；濾液繼續(xù)發(fā)酵至含糖量≤4g/L時，虹吸出上層酒液，棄去底層酵母泥，將上層酒液在15-30℃的條件下繼續(xù)發(fā)酵18天即得高山干紅葡萄酒。

利用本發(fā)明得到的高山葡萄酒為干紅型，酒精度13度，口感醇厚，風(fēng)味上佳，可溶性物質(zhì)、花青素和白藜蘆醇的含量都很高，無任何澀味和苦味，其中可溶性物質(zhì)是普通市售干紅的5倍，花青素含量是是普通市售干紅的3.5倍，白藜蘆醇含量比普通市售干紅高出30%。

上述實(shí)施例并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍的情況下，都可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均應(yīng)落在本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。