本實(shí)用新型涉及微流控技術(shù)和聚合物芯片的設(shè)計(jì)、加工、制作和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別提供了一種集成化藥物篩選與染色微流控芯片。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)中，微流控芯片是一種在微小通道中操控微小體積流體流動(dòng)的系統(tǒng)，其中通道的尺度為幾十到幾百微米，承載流體的量為10^-9～10^-18L。微流控芯片的各個(gè)操作單元通過微通道網(wǎng)絡(luò)內(nèi)流體的流動(dòng)相互聯(lián)系。微流體控制是微流控芯片實(shí)驗(yàn)室的操作核心，所涉及的進(jìn)樣、混合、反應(yīng)、分離等過程都是在可控流體的運(yùn)動(dòng)中完成的。無論是宏觀還是微觀流體，閥都是流體控制的核心部件。由于其重要性，微型閥的研制早在微流控芯片誕生之前引起人們的廣泛關(guān)注。理論上講，凡是能控制微通道閉合和開啟狀態(tài)的部件均可作為微流控芯片中的微閥使用。一個(gè)理想的微閥應(yīng)該具備以下特征：低泄漏、低功耗、響應(yīng)速度快、線性操作能力和適應(yīng)面廣。微流體和微型閥構(gòu)成了一套完整的微流控芯片系統(tǒng)。

微流控分析的核心是利用微流控芯片將樣品預(yù)處理、生物和化學(xué)反應(yīng)、分離檢測(cè)等基本操作單元集成在具有微米或納米微通道網(wǎng)絡(luò)的芯片上，通過操控流體完成復(fù)雜的分析過程，具有樣品和試劑消耗量少、分析時(shí)間短、高通量、容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模平行測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。利用微流控分析技術(shù)可方便的實(shí)現(xiàn)分析系統(tǒng)的小型化、集成化和便攜化。目 前，該系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)、疾病診斷與治療、藥物合成與篩選等領(lǐng)域。

細(xì)胞水平藥物篩選微流控芯片系統(tǒng)旨在通過設(shè)計(jì)有不同功能的芯片來培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞施加藥物刺激，并配合自動(dòng)化的檢測(cè)裝置，采集藥物與細(xì)胞相互作用的信號(hào)，收集數(shù)據(jù)，從而分析藥物的作用，進(jìn)行篩選并得到篩選結(jié)果。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于通過對(duì)樣品全分析過程的微縮化和集成化，實(shí)現(xiàn)高靈敏的快速檢測(cè)，高通量輸出以及在線自動(dòng)化操作等功能，較以往的細(xì)胞水平篩選技術(shù)表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)，非常適合藥物成分的篩選。

免疫熒光染色技術(shù)是將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)定位的技術(shù)，是用于觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分布和定位的普遍方法。免疫熒光染色的傳統(tǒng)做法需要消耗大量的試劑，人力和時(shí)間，特別是某些珍貴抗體的消耗，限制了傳統(tǒng)方法的使用。微流控芯片技術(shù)以其大大減少樣品消耗，節(jié)省人工及時(shí)間成本，可在厘米見方的空間上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、高通量的實(shí)驗(yàn)等優(yōu)勢(shì)，受到了廣泛的關(guān)注。

人們迫切希望獲得一種技術(shù)效果優(yōu)良的集成化藥物篩選與染色微流控芯片的制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種技術(shù)效果優(yōu)良的集成化藥物篩選與染色微流控芯片的制備方法。以解決以往細(xì)胞藥物篩選與染色過程中存在的操作步驟繁瑣復(fù)雜、消耗大量試劑等局限。

本發(fā)明提供了一種集成化藥物篩選與染色微流控芯片，所述微流控芯片由上層、下層、底面三層順序串聯(lián)貼合布置組成，其中：上層為液路控制層，下層為氣路控制層，底面為空白玻璃底板；

所述液路控制層具體設(shè)置有下述結(jié)構(gòu)：

——細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口：位于在整個(gè)液路控制層的最上游；其設(shè)置有至少兩個(gè)以其為入口的通道相互并聯(lián)并最終匯成一個(gè)共用的通道；最終匯成的共用通道還分別連接著下游的細(xì)胞培養(yǎng)室和液體流出通道；

——熒光染色進(jìn)樣通道區(qū)(P1)：布置在細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口和細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)之間用于溝通二者；

——細(xì)胞進(jìn)樣口：其設(shè)置有至少兩個(gè)，每一個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口都設(shè)置在細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)中的其中一條通道上，且前述細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)中的每一條通道都串接著一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室；

——細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)：設(shè)置在熒光染色進(jìn)樣通道區(qū)(P1)和細(xì)胞培養(yǎng)室之間；

——細(xì)胞培養(yǎng)室：至少有二個(gè)，布置在細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)和藥物進(jìn)樣通道區(qū)(P3)之間；

——藥物進(jìn)樣通道區(qū)(P3)：其為包括覆蓋所有細(xì)胞培養(yǎng)室和藥物進(jìn)樣口之間的通道的區(qū)域；

——藥物進(jìn)樣口：其數(shù)量和細(xì)胞培養(yǎng)室相等，各自布置在每一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室下游的通道上；

——液體流出通道區(qū)(P4)：其布置在細(xì)胞培養(yǎng)室下游通道的下 游和整個(gè)液路最尾端的出液口(13)之間；

——出液口(13)：布置在整個(gè)液路控制層所有結(jié)構(gòu)的最下游。

所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片，其特征在于：所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片還滿足下述要求：

細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)置有四個(gè)，與之對(duì)應(yīng)的在細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)上游的細(xì)胞進(jìn)樣口和下游藥物進(jìn)樣通道區(qū)(P3)的藥物進(jìn)樣口也都有四個(gè)；每一條通道上從上游開始依次串接布置有1個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口、1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室、1個(gè)藥物進(jìn)樣口。

所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片，其特征在于：所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片還滿足下述要求之一或其組合：

其一，細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口設(shè)置有四個(gè)，所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片中設(shè)置有四個(gè)以細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口為入口的通道，其相互并聯(lián)并最終匯成一個(gè)共用的通道；最終匯成的共用通道再次一分為四，變成四條各自設(shè)置有一個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口的四條通道，每個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口還分別依次連接著下游的細(xì)胞培養(yǎng)室、藥物進(jìn)樣口和再之后的液體流出通道；

其二，液體流出通道區(qū)(P4)：其是將細(xì)胞培養(yǎng)室下游的至少兩條通道合并為最終的共用的一個(gè)出液口(13)的通道合并區(qū)域；

其三，所述微流控芯片的下層即氣路控制層具體由泵閥控制區(qū)組成，每個(gè)熒光染色液體入口有單獨(dú)的泵閥單元控制，以使進(jìn)樣液體互 相不影響；氣路控制層具體包含有下述結(jié)構(gòu)之一或其組合：設(shè)置在各個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口上游的控制用的閥；設(shè)置在各個(gè)藥物進(jìn)樣口下游的控制用的閥；設(shè)置在各個(gè)細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口下游通道上的控制用的閥；所述微芯片的所有控制用的閥均為常閉閥，使用時(shí)打開。

所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片，其特征在于：所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片還滿足下述要求之一或其組合：

其一，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室由單獨(dú)的細(xì)胞培養(yǎng)液入口、藥物入口、熒光染色液入口、進(jìn)樣通道組成；

其二，至少兩個(gè)并聯(lián)的細(xì)胞培養(yǎng)室(圖1中)共同組成液路層；

其三，所述上層芯片和下層芯片的材料均為聚二甲基硅氧烷PDMS聚合物，上層芯片厚1～5mm，下層芯片厚100～500μm；

其四，所述細(xì)胞培養(yǎng)室的尺寸為15mm×2mm×100μm的長(zhǎng)梭形；

其五，所述芯片的氣路和液路通道高度相同，均為80～200μm；

其六，所述芯片的氣路和液路通道寬度不同，氣路通道寬度為100～300μm，液路通道寬200～600μm。

所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片，其特征在于：所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片還滿足下述要求：

所述液路層為基于SU-8模板所得的PDMS模塊；氣路層是在制作成功的氣路SU-8模板上甩一層高于模板10～50μm的聚二甲基硅 氧烷PDMS膜，所述液路層的聚二甲基硅氧烷PDMS模板有結(jié)構(gòu)一側(cè)封接到氣路層聚二甲基硅氧烷PDMS膜無結(jié)構(gòu)一側(cè)，氣路層聚二甲基硅氧烷PDMS膜有閥結(jié)構(gòu)一側(cè)等離子鍵合到潔凈的玻璃片上。

本發(fā)明還要求保護(hù)一種如上所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片的制備方法，其特征在于：所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片的制備方法相關(guān)步驟依次要求如下：

(1)采用光刻和腐蝕方法制備出通道部分凸起的光刻膠SU-8模板；

(2)用乳酸乙酯對(duì)光刻膠SU-8模板進(jìn)行顯影，165℃～180℃堅(jiān)膜1～3h；

(3)將芯片下層的光刻膠SU-8模板用硅烷化試劑處理5～10min，使PDMS容易剝離模板底面；

(4)將聚二甲基硅氧烷PDMS與引發(fā)劑以體積比(5～20)：1混合均勻，分別澆注于芯片上、下層結(jié)構(gòu)光刻膠SU-8模板，80℃烘箱固化20～40min，將聚二甲基硅氧烷PDMS與芯片上層光刻膠SU-8模板剝離，得到帶有結(jié)構(gòu)的聚二甲基硅氧烷PDMS芯片；

(5)將芯片上層帶有結(jié)構(gòu)的一側(cè)與光刻膠SU-8模板上無結(jié)構(gòu)的芯片下層進(jìn)行氧等離子體處理1～3min，70～90℃熱烘30～60min，進(jìn)行不可逆封接；

(6)將上述封接好的聚二甲基硅氧烷PDMS芯片與下層結(jié)構(gòu)光刻膠SU-8模板剝離，與干凈的空白玻璃片經(jīng)過氧等離子體處理1～3 min，70～90℃熱烘30～60min進(jìn)行不可逆封接，即得到集成化藥物篩選與染色微流控芯片。

所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片的制備方法，其特征在于：所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片的制備方法還滿足下述要求：所述微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)室中在接種細(xì)胞且細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)區(qū)域底面后，在藥物進(jìn)樣區(qū)加入藥物刺激；細(xì)胞培養(yǎng)周期結(jié)束，固定細(xì)胞，進(jìn)行熒光染色。

本發(fā)明利用微流體與微型閥技術(shù)，制備了一種集細(xì)胞培養(yǎng)、藥物篩選與熒光染色為一體，三種檢測(cè)指標(biāo)相繼進(jìn)行的微流控芯片。整個(gè)芯片平臺(tái)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，集成度高，分析速度快，效率高，無需任何復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，無需大量細(xì)胞與試劑消耗。綜上所述，發(fā)明一種方便，快捷，集成度高，應(yīng)用范圍廣的集成化藥物篩選與染色微流控芯片具有十分重要意義的。

本發(fā)明解決了以往細(xì)胞藥物篩選與染色過程中存在的操作步驟繁瑣復(fù)雜、消耗大量試劑等技術(shù)局限。本發(fā)明制備過程穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，集成度高。

本發(fā)明所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片的用途說明：該芯片可用于施加不同濃度藥物刺激對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性研究，并對(duì)該條件下的細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行熒光染色檢測(cè)。所述集成化微流控芯片可進(jìn)行不同種類的細(xì)胞培養(yǎng)，可進(jìn)行不同種類或不同濃度的藥物刺激，可進(jìn)行不 同種類的抗體染色。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、操作簡(jiǎn)便、快捷；2、細(xì)胞與試劑用量少，實(shí)驗(yàn)成本低廉；3、不接觸有毒有害試劑，環(huán)境友好；4、高度集成化、應(yīng)用范圍廣泛。

附圖說明

下面結(jié)合附圖及實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明：

圖1為集成化藥物篩選與染色微流控芯片結(jié)構(gòu)示意簡(jiǎn)圖；

圖2為集成化藥物篩選與染色微流控芯片上層結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為集成化藥物篩選與染色微流控芯片下層結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

附圖標(biāo)記含義如下：

圖1中，附圖標(biāo)記1～4均為細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口，其具體分別為：一抗入口1、二抗入口2、細(xì)胞核染料入口3、PBS緩沖液入口4；熒光染色進(jìn)樣通道P1；5～8分別為細(xì)胞進(jìn)樣口一5、細(xì)胞進(jìn)樣口二6、細(xì)胞進(jìn)樣口三7、細(xì)胞進(jìn)樣口四8；細(xì)胞進(jìn)樣通道P1；R1～R4分別為：細(xì)胞培養(yǎng)室一R1、細(xì)胞培養(yǎng)室二R2、細(xì)胞培養(yǎng)室三R3、細(xì)胞培養(yǎng)室四R4，可同時(shí)培養(yǎng)4種不同種類細(xì)胞；9～12分別為：藥物進(jìn)樣口一9、藥物進(jìn)樣口二10、藥物進(jìn)樣口三11、藥物進(jìn)樣口四12；藥物進(jìn)樣通道P3，可同時(shí)加入不同種類藥物或同種不同濃度藥物；液體流出通道P4，出液口13；A～D為分別控制附圖標(biāo)記為1～4的四個(gè)細(xì)胞 熒光染色進(jìn)樣口的閥，四者分別為：閥一A、閥二B、閥三C、閥四D；另有：控制染料排出的閥五E、控制藥物排出的閥六J；附圖標(biāo)記F～I(xiàn)是分別控制附圖標(biāo)記為5～8的各個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口的閥，分別具體是：閥七F、閥八G、閥九H、閥十I；附圖標(biāo)記K～N為分別控制附圖標(biāo)記9～12這四個(gè)藥物進(jìn)樣口的閥，其具體是：閥十一K、閥十二L、閥十三M、閥十四N；

圖1、圖2中，基體材料的邊界線省略未畫出，圖3中基體材料的邊界線即外部的矩形框僅為示意；特此說明。

實(shí)施例1

一種集成化藥物篩選與染色微流控芯片，所述微流控芯片由上層、下層、底面三層順序串聯(lián)貼合布置組成，其中：上層為液路控制層，下層為氣路控制層，底面為空白玻璃底板；

所述液路控制層具體設(shè)置有下述結(jié)構(gòu)：

——細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口：位于在整個(gè)液路控制層的最上游；其設(shè)置有至少兩個(gè)以其為入口的通道相互并聯(lián)并最終匯成一個(gè)共用的通道；最終匯成的共用通道還分別連接著下游的細(xì)胞培養(yǎng)室和液體流出通道；

——熒光染色進(jìn)樣通道區(qū)(P1)：布置在細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口和細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)之間用于溝通二者；

——細(xì)胞進(jìn)樣口：其設(shè)置有至少兩個(gè)，每一個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口都設(shè)置在細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)中的其中一條通道上，且前述細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)中的每一條通道都串接著一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室；

——細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)：設(shè)置在熒光染色進(jìn)樣通道區(qū)(P1)和細(xì)胞培養(yǎng)室之間；

——細(xì)胞培養(yǎng)室：至少有二個(gè)，布置在細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)和藥物進(jìn)樣通道區(qū)(P3)之間；

——藥物進(jìn)樣通道區(qū)(P3)：其為包括覆蓋所有細(xì)胞培養(yǎng)室和藥物進(jìn)樣口之間的通道的區(qū)域；

——藥物進(jìn)樣口：其數(shù)量和細(xì)胞培養(yǎng)室相等，各自布置在每一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室下游的通道上；

——液體流出通道區(qū)(P4)：其布置在細(xì)胞培養(yǎng)室下游通道的下游和整個(gè)液路最尾端的出液口(13)之間；

——出液口(13)：布置在整個(gè)液路控制層所有結(jié)構(gòu)的最下游。

所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片還滿足下述要求：細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)置有四個(gè)，與之對(duì)應(yīng)的在細(xì)胞進(jìn)樣通道區(qū)(P2)上游的細(xì)胞進(jìn)樣口和下游藥物進(jìn)樣通道區(qū)(P3)的藥物進(jìn)樣口也都有四個(gè)；每一條通道上從上游開始依次串接布置有1個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口、1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室、1個(gè)藥物進(jìn)樣口。

所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片還滿足下述要求之一或其組合：

其一，細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口設(shè)置有四個(gè)，所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片中設(shè)置有四個(gè)以細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口為入口的通道， 其相互并聯(lián)并最終匯成一個(gè)共用的通道；最終匯成的共用通道再次一分為四，變成四條各自設(shè)置有一個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口的四條通道，每個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口還分別依次連接著下游的細(xì)胞培養(yǎng)室、藥物進(jìn)樣口和再之后的液體流出通道；

其二，液體流出通道區(qū)(P4)：其是將細(xì)胞培養(yǎng)室下游的至少兩條通道合并為最終的共用的一個(gè)出液口(13)的通道合并區(qū)域；

其三，所述微流控芯片的下層即氣路控制層具體由泵閥控制區(qū)組成，每個(gè)熒光染色液體入口有單獨(dú)的泵閥單元控制，以使進(jìn)樣液體互相不影響；氣路控制層具體包含有下述結(jié)構(gòu)之一或其組合：設(shè)置在各個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口上游的控制用的閥；設(shè)置在各個(gè)藥物進(jìn)樣口下游的控制用的閥；設(shè)置在各個(gè)細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口下游通道上的控制用的閥；所述微芯片的所有控制用的閥均為常閉閥，使用時(shí)打開。

所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片還滿足下述要求之一或其組合：

其一，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室由單獨(dú)的細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物刺激、熒光染色液體入口、進(jìn)樣通道組成；

其二，至少兩個(gè)并聯(lián)的細(xì)胞培養(yǎng)室(圖1中)共同組成液路層；

其三，所述上層芯片和下層芯片的材料均為聚二甲基硅氧烷PDMS聚合物，上層芯片厚1～5mm，下層芯片厚100～500μm；

其四，所述細(xì)胞培養(yǎng)室的尺寸為15mm×2mm×100μm的長(zhǎng)梭形；

其五，所述芯片的氣路和液路通道高度相同，均為80～200μm；

其六，所述芯片的氣路和液路通道寬度不同，氣路通道寬度為100～300μm，液路通道寬200～600μm。

所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片還滿足下述要求：

所述液路層為基于SU-8模板所得的PDMS模塊；氣路層是在制作成功的氣路SU-8模板上甩一層高于模板10～50μm的聚二甲基硅氧烷PDMS膜，所述液路層的聚二甲基硅氧烷PDMS模板有結(jié)構(gòu)一側(cè)封接到氣路層聚二甲基硅氧烷PDMS膜無結(jié)構(gòu)一側(cè)，氣路層聚二甲基硅氧烷PDMS膜有閥結(jié)構(gòu)一側(cè)等離子鍵合到潔凈的玻璃片上。

一種如上所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片的制備方法，其相關(guān)步驟依次要求如下：

(1)采用光刻和腐蝕方法制備出通道部分凸起的光刻膠SU-8模板；

(2)用乳酸乙酯對(duì)光刻膠SU-8模板進(jìn)行顯影，165℃～180℃堅(jiān)膜1～3h；

(3)將芯片下層的光刻膠SU-8模板用硅烷化試劑處理5～10min，使PDMS容易剝離模板底面；

(4)將聚二甲基硅氧烷PDMS與引發(fā)劑以體積比(5～20)：1混合均勻，分別澆注于芯片上、下層結(jié)構(gòu)光刻膠SU-8模板，80℃烘箱固化20～40min，將聚二甲基硅氧烷PDMS與芯片上層光刻膠SU-8 模板剝離，得到帶有結(jié)構(gòu)的聚二甲基硅氧烷PDMS芯片；

(5)將芯片上層帶有結(jié)構(gòu)的一側(cè)與光刻膠SU-8模板上無結(jié)構(gòu)的芯片下層進(jìn)行氧等離子體處理1～3min，70～90℃熱烘30～60min，進(jìn)行不可逆封接；

(6)將上述封接好的聚二甲基硅氧烷PDMS芯片與下層結(jié)構(gòu)光刻膠SU-8模板剝離，與干凈的空白玻璃片經(jīng)過氧等離子體處理1～3min，70～90℃熱烘30～60min進(jìn)行不可逆封接，即得到集成化藥物篩選與染色微流控芯片。

所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片的制備方法還滿足下述要求：所述微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)室中在接種細(xì)胞且細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)區(qū)域底面后，在藥物進(jìn)樣區(qū)加入藥物刺激；細(xì)胞培養(yǎng)周期結(jié)束，固定細(xì)胞，進(jìn)行熒光染色。

本實(shí)施例利用微流體與微型閥技術(shù)，制備了一種集細(xì)胞培養(yǎng)、藥物篩選與熒光染色為一體，三種檢測(cè)指標(biāo)相繼進(jìn)行的微流控芯片。整個(gè)芯片平臺(tái)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，集成度高，分析速度快，效率高，無需任何復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，無需大量細(xì)胞與試劑消耗。綜上所述，發(fā)明一種方便，快捷，集成度高，應(yīng)用范圍廣的集成化藥物篩選與染色微流控芯片具有十分重要意義的。

本實(shí)施例解決了以往細(xì)胞藥物篩選與染色過程中存在的操作步驟繁瑣復(fù)雜、消耗大量試劑等技術(shù)局限。本實(shí)施例制備過程穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，集成度高。

本實(shí)施例所述集成化藥物篩選與染色微流控芯片的用途說明：該芯片可用于施加不同濃度藥物刺激對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性研究，并對(duì)該條件下的細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行熒光染色檢測(cè)。所述集成化微流控芯片可進(jìn)行不同種類的細(xì)胞培養(yǎng)，可進(jìn)行不同種類或不同濃度的藥物刺激，可進(jìn)行不同種類的抗體染色。

本實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)在于：1、操作簡(jiǎn)便、快捷；2、細(xì)胞與試劑用量少，實(shí)驗(yàn)成本低廉；3、不接觸有毒有害試劑，環(huán)境友好；4、高度集成化、應(yīng)用范圍廣泛。

實(shí)施例2

集成化藥物篩選與染色芯片采用光刻和腐蝕方法制備出通道部分突起的SU-8模板，芯片上下層結(jié)構(gòu)分別由兩個(gè)SU-8模板反模PDMS組成；兩個(gè)SU-8模板同時(shí)制作，取兩塊潔凈的玻璃片，在甩膠機(jī)上甩SU-8膠厚度為100μm，95℃前烘20min，自然降溫，將芯片上下層結(jié)構(gòu)的兩個(gè)掩膜置于SU-8膠平板上面，紫外曝光30s，95℃后烘20min，自然降溫；最后，采用乳酸乙酯將上述SU-8膠顯影5min，180℃堅(jiān)膜2h，自然降溫，得到芯片模版。

實(shí)施例3

將芯片下層結(jié)構(gòu)的SU-8模板用硅烷化試劑處理10min，使PDMS容易剝離模板底面；PDMS與引發(fā)劑以體積比10：1混合均勻，分別澆注于芯片上、下層結(jié)構(gòu)SU-8模板，80℃烘箱固化40min，將PDMS 與芯片上層SU-8模板剝離，得到帶有結(jié)構(gòu)的PDMS芯片；將芯片上層帶有結(jié)構(gòu)的一側(cè)與SU-8模板上無結(jié)構(gòu)的芯片下層進(jìn)行氧等離子體處理2min，80℃熱烘1h，不可逆封接；將上述封接好的PDMS芯片與下層結(jié)構(gòu)SU-8模板剝離，與干凈的空白玻璃片經(jīng)過氧等離子體處理2min，80℃熱烘1h進(jìn)行不可逆封接，即得到集成化藥物篩選與染色微流控芯片。

圖1中，附圖標(biāo)記1～4均為細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口，其具體分別為：一抗入口1、二抗入口2、細(xì)胞核染料入口3、PBS緩沖液入口4；熒光染色進(jìn)樣通道P1；5～8分別為細(xì)胞進(jìn)樣口一5、細(xì)胞進(jìn)樣口二6、細(xì)胞進(jìn)樣口三7、細(xì)胞進(jìn)樣口四8；細(xì)胞進(jìn)樣通道P1；R1～R4分別為：細(xì)胞培養(yǎng)室一R1、細(xì)胞培養(yǎng)室二R2、細(xì)胞培養(yǎng)室三R3、細(xì)胞培養(yǎng)室四R4，可同時(shí)培養(yǎng)4種不同種類細(xì)胞；9～12分別為：藥物進(jìn)樣口一9、藥物進(jìn)樣口二10、藥物進(jìn)樣口三11、藥物進(jìn)樣口四12；藥物進(jìn)樣通道P3，可同時(shí)加入不同種類藥物或同種不同濃度藥物；液體流出通道P4，出液口13；細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣通道將細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口和細(xì)胞進(jìn)樣口連接，細(xì)胞進(jìn)樣通道將細(xì)胞進(jìn)樣口和細(xì)胞培養(yǎng)室連接，藥物進(jìn)樣通道將藥物進(jìn)樣口和細(xì)胞培養(yǎng)室連接，液體流出通道將藥物進(jìn)樣口和出液口連接；A～D為分別控制附圖標(biāo)記為1～4的四個(gè)細(xì)胞熒光染色進(jìn)樣口的閥，四者分別為：閥一A、閥二B、閥三C、閥四D；另有：控制染料排出的閥五E、控制藥物排出的閥六J；附圖標(biāo)記F～I(xiàn)是分別控制附圖標(biāo)記為5～8的各個(gè)細(xì)胞進(jìn)樣口的閥，分別具體是：閥七F、閥八G、閥九H、閥十I；附圖標(biāo)記K～N為分別控制 附圖標(biāo)記9～12這四個(gè)藥物進(jìn)樣口的閥，其具體是：閥十一K、閥十二L、閥十三M、閥十四N。

所有進(jìn)樣口由單獨(dú)的閥控制，不同種類的細(xì)胞通過附圖標(biāo)記分別為5～8的結(jié)構(gòu)分別進(jìn)入附圖標(biāo)記分別為R1～R4的四個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞培養(yǎng)室，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，從附圖標(biāo)記分別為9～12的結(jié)構(gòu)處加入不同藥物刺激細(xì)胞，分別將細(xì)胞固定液、細(xì)胞封閉液從附圖標(biāo)記分別為5～8的結(jié)構(gòu)處加入，隨后通過附圖標(biāo)記分別為1～4的結(jié)構(gòu)處分別加入一抗、二抗、細(xì)胞核染料和PBS沖洗后，進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。