專利名稱：一種以Keap1為靶點(diǎn)的新型防癌抗癌藥物的虛擬篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物篩選方法，尤其涉及以keapl為靶點(diǎn)、利用分子對接的藥物虛擬 篩選方法進(jìn)行的新型防癌抗癌藥物的篩選方法。
背景技術(shù)：
癌癥是人類的大敵，尤其肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、鼻咽癌等發(fā) 病及死亡率近年仍居高不下。為了戰(zhàn)勝癌癥，幾乎每個(gè)國家都花費(fèi)了大量資金和人力。根 據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，2000年全球新發(fā)癌癥病人1010萬人，死亡620萬人，現(xiàn)患癌癥病例 2240萬。全球癌癥仍呈上升趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)專家預(yù)測，2020年全球總?cè)丝趯?達(dá)80億，癌癥新發(fā)病例將達(dá)2000萬，1200萬人死于癌癥，癌癥將成為新世紀(jì)人類的第一殺 手。經(jīng)醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)同，癌癥并非死亡之神。自20世紀(jì)90年代開始，美國、加拿大、澳大利 亞等西方發(fā)達(dá)國家常見癌癥開始下降，日本癌癥死亡已趨平穩(wěn)不再升高。這種變化，令人振 奮和鼓舞。而發(fā)展中國家增長加快，癌癥病人中60%發(fā)生在發(fā)展中國家。我國2000年癌癥 發(fā)病人數(shù)為200萬，死亡150萬。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1991年-2000年我國城市居民中癌癥死亡率上升 了 18. 1%，農(nóng)村居民中癌癥死亡率上升了 11. 03%，平均每死亡5人就有一人死于癌癥。我 國正處于由發(fā)展中國家向發(fā)達(dá)國家癌譜過渡的時(shí)期。在各種致癌因子作用下，正常細(xì)胞發(fā)展成腫瘤細(xì)胞是一個(gè)長期和隱蔽過程。有充 足證據(jù)表明癌基因的持續(xù)活化或/和抑癌基因的失活是由于致癌物質(zhì)對DNA不斷損傷造成 的。癌變過程是由多因素引起，經(jīng)歷多個(gè)階段并涉及到多條信號(hào)傳遞通路的異常。近數(shù)10 年研究表明癌變過程是可被放慢、阻止和逆轉(zhuǎn)的。因此，阻止癌變過程是預(yù)防癌癥的最有效 策略。盡管紫外線、病毒等能引起癌變，但化學(xué)致癌劑是癌變的首要因素。一般來說，化 學(xué)致癌物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后首先會(huì)被人體的解毒系統(tǒng)代謝。人體中肝臟的解毒機(jī)制有二道程 序分別稱為Phase I與Phase II解毒系統(tǒng)。Phase I是第一道解毒程序，此系統(tǒng)主要由 Cytochrome P450酶組成，在解毒過程扮演著一個(gè)氧化與分解毒素的角色，但經(jīng)Phase I活 化后的毒素有可能比原來的分子更具毒性，因此需藉由第二道的Phase II酶系統(tǒng)來去除 毒性；Phase II酶系統(tǒng)的功用即是發(fā)揮解毒作用、使這些分子失去活性，中和毒素分子對細(xì) 胞、DNA的傷害。生物體的保護(hù)系統(tǒng)在收到刺激后通過迅速增加II相酶的數(shù)量起到保護(hù) 作用。這種酶可以有效地抵消毒素?fù)p傷DNA并且引發(fā)癌癥的能力。Phase II酶系統(tǒng)包括 Glutathione transferase, Quinone reductase等，都具有超強(qiáng)的防癌抗癌及預(yù)防細(xì)胞突 變的功能。例如其中的Quinone reductase (QR，苯醌還原酶)是研究得最為廣泛的Phase II酶之一。目前認(rèn)為phase II酶水平的增加可以提供對抗癌癥的一個(gè)相當(dāng)有效的途徑。 而通過篩選具有phase II酶誘導(dǎo)作用的化合物可以看作是化學(xué)防癌新藥研發(fā)的一個(gè)非常 有效的方法。傳統(tǒng)的藥物篩選無論是動(dòng)物水平篩選還是高通量細(xì)胞平臺(tái)篩選，都存在著天然 藥物及食物成分復(fù)雜，從確認(rèn)提取物有潛在防癌功效到確定有效成分，到最終分離出單體成分需要花費(fèi)大量的人力，時(shí)間和精力，篩選化合物的速度和效率極低，周期長，陽性率低 (0.01% 0. 1%)0因此，近年來虛擬篩選方法的發(fā)展和在新藥研究中的應(yīng)用受到了廣泛 的重視。于是建立一套高效、有效、速效的中藥化學(xué)防癌藥物篩選體系成為當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種新穎，快速，高效的以keapl為靶點(diǎn)的藥物虛擬篩選方 法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有方法的不足。本發(fā)明的機(jī)理是研究表明，與Phase II酶的調(diào)節(jié)關(guān)系最為密切的是Keapl/Nrf2/ARE通路，這是一 個(gè)與氧化劑和親電試劑致癌作用密切相關(guān)的信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。生理狀態(tài)下，Nrf2與Keapl偶 聯(lián)并與肌動(dòng)蛋白結(jié)合而被錨定在胞漿中。Keapl (Kelch-like ECH-associated protein 1) 是一種泛素連接酶，與另一種連接泛素的蛋白⑶L3組成復(fù)合體與靶蛋白如轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 相連。研究還發(fā)現(xiàn)某些具有α，β-不飽和結(jié)構(gòu)單元的天然藥物(邁克爾反應(yīng)受體分子， 含有α，β-不飽和結(jié)構(gòu)單元的化學(xué)小分子配體，其共軛結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的吸電子基團(tuán)能與親核 試劑發(fā)生邁克爾加成反應(yīng))，通過與Keapl半胱氨酸殘基的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，以共 價(jià)鍵修飾其半胱氨酸殘基，促進(jìn)Keapl泛素化并降解，從而使與之結(jié)合的Nrf2游離出來并 進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，再結(jié)合在II相酶基因5’上游的調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)元件 ARE區(qū)(antioxidantresponse element, ARE)，啟動(dòng)第II相解毒酶和抗氧化應(yīng)激蛋白基因 的轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞抗氧化損傷的能力從而預(yù)防癌癥(見圖1)。因此，活化Keapl/Nrf2/ARE 通路是預(yù)防腫瘤最有前景的策略。人Keapl蛋白含有27個(gè)半胱氨酸殘基位點(diǎn)，到底是哪些半胱氨酸殘基在邁克爾受 體分子發(fā)揮II相酶誘導(dǎo)活性過程中發(fā)揮活性作用，一直是近十幾年來化學(xué)防癌機(jī)制研究 領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Keapl研究者采用與誘導(dǎo)物結(jié)合的探針和酶學(xué)、放射標(biāo)記、UV、色譜的檢測方法 確定了 Keapl插入?yún)^(qū)的四個(gè)高活性半胱氨酸巰基位點(diǎn)(Cys257，CyS273，CyS288和Cys297) 是識(shí)別II相酶誘導(dǎo)物并與之反應(yīng)的重要細(xì)胞“傳感器”。而其中又以Cys273及Cys288最 為重要。體內(nèi)外研究均證明Cys273及Cys288兩個(gè)位點(diǎn)的變異或者Sulforaphane或GSSG 對野生型Keapl的加成，均可以直接導(dǎo)致Nrf2的解離及其II相酶及抗氧化應(yīng)激靶基因表 達(dá)的增加。另外，Cysl51位點(diǎn)也能通過被邁克爾受體分子化合物的加成修飾，在氧化應(yīng)激 誘導(dǎo)劑及Sulforaphane添加誘導(dǎo)的Keapl與Nrf2的解離中發(fā)揮重要作用。因此，能夠與 keapl的Cys273與Cys288及Cysl51的活性半胱氨酸殘基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)的化合物成 為化學(xué)防癌的潛在藥物。已知含有α，β _不飽和結(jié)構(gòu)單元的小分子配體(稱作邁克爾加成反應(yīng)受體分子) 和Keapl上Cys273與Cys288及Cysl51等半胱氨酸殘基的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)能有 效的上調(diào)苯醌還原酶的表達(dá)，從而起到防癌作用。但事實(shí)上并非所有的邁克爾反應(yīng)受體小 分子配體都能和該活性殘基發(fā)生加成反應(yīng)，除了小分子配體本身應(yīng)具有發(fā)生邁克爾反應(yīng)的 藥效基團(tuán)(α，不飽和結(jié)構(gòu)單元)外，其與Keapl蛋白質(zhì)大分子活性口袋附近的其他氨 基酸殘基之間也有相互作用，而這種相互作用，能夠促使配體分子和活性半胱氨酸殘基的 巰基更容易發(fā)生加成反應(yīng)?；谏鲜鰴C(jī)理本發(fā)明的構(gòu)思是首先，利用同源模建軟件預(yù)測出keapl活性位點(diǎn)所在功能域(IVR)的PDB數(shù)據(jù)；然后以此為依據(jù)，分別以keapl蛋白的活性半胱氨酸殘基位 點(diǎn)Cysl51、Cys273及Cys288等為受體大分子的活性位點(diǎn)構(gòu)建活性口袋，利用分子對接軟 件，對預(yù)先構(gòu)建的小分子配體數(shù)據(jù)庫，尤其是從天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行虛擬篩選，確定出能 夠與該活性口袋相匹配的邁克爾反應(yīng)受體小分子配體，作為具有化學(xué)防癌以及抗癌作用的 新型先導(dǎo)藥物，再以細(xì)胞平臺(tái)的高通量篩選進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。本發(fā)明提供的一種以Keapl為靶點(diǎn)的新型防癌抗癌藥物的虛擬篩選方法，包括以 下步驟1)確定Keapl蛋白結(jié)構(gòu)的PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)；2)采用分子對接軟件，依據(jù)keapl的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)確定活性中心，設(shè)定 活性口袋；3)對小分子配體進(jìn)行篩選，篩選項(xiàng)目為毒性篩選、類藥性篩選、和藥效團(tuán)含有情況 篩選；4)建立對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫；5)根據(jù)設(shè)定的活性口袋，利用分子對接軟件，將對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫中的小 分子配體與活性口袋一一做對接；6)根據(jù)對接結(jié)果的排序，初步確定具有化學(xué)防癌或抗癌效果的先導(dǎo)藥物。上述的虛擬篩選方法步驟3)可以置于步驟1)至步驟6)任何一個(gè)步驟之前。即 可以對尚未進(jìn)行分子對接或者已經(jīng)對接后的小分子數(shù)據(jù)庫中的小分子配體進(jìn)行毒性、類藥 性和藥效團(tuán)含有情況進(jìn)行篩選，而不受排序限制。為了進(jìn)一步提高篩選的速度、效率和準(zhǔn)確性，上述的虛擬篩選方法步驟6)可以 為根據(jù)對接結(jié)果的排序，小分子配體藥效團(tuán)含有情況以及小分子配體與活性中心的相互 作用方式，進(jìn)行綜合評價(jià)，初步確定具有化學(xué)防癌或抗癌效果的先導(dǎo)藥物。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過藥物的虛擬篩選，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得活性化 合物的線索，將研究目標(biāo)從幾百萬個(gè)化合物集中到幾百個(gè)化合物，而且，虛擬篩選的陽性率 (5% 30%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高通量實(shí)驗(yàn)篩選(0.01% 0. )。然后再從虛擬篩選后的先導(dǎo) 化合物中，利用動(dòng)物水平篩選或者高通量細(xì)胞平臺(tái)，篩選具有防癌抗癌藥物，因此大大提高 了篩選化合物的速度和效率，縮短新藥研究的周期。


圖III相酶誘導(dǎo)劑防癌作用的分子機(jī)制。圖2hKeapl的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列。圖3hkeapl的活性功能域的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模式圖。圖4hkeapl預(yù)測三級結(jié)構(gòu)的評估。圖5小分子配體對接程序中使用的SHELL腳本。圖6化合物DEM與keapl的Cysl51活性中心的相互作用圖。圖7A陽性對照分子DEM與keapl的Cysl51活性中心的成簇分析。圖7B陽性對 照分子DEM與keapl的Cysl51活性中心的相互作用圖。圖8A陽性對照分子isoliquiritigenin與keapl的Cysl51活性中心的成簇分析。 圖8B陽性對照分子isoliquiritigenin與keapl的Cysl51活性中心的相互作用圖。
圖9A陽性對照分子xanthohumol與keapl的Cysl51活性中心的成簇分析。圖9B 陽性對照分子xanthohumol與keapl的Cysl51活性中心的相互作用圖。圖IOA大豆異黃酮與keapl的Cysl51活性中心的相互作用圖。圖IOB大豆異黃 酮與keapl的Cysl51活性中心的成簇分析。圖11高通量細(xì)胞平臺(tái)篩選化學(xué)防癌抗癌藥物方法的流程圖。圖12大豆異黃酮在細(xì)胞水平誘導(dǎo)苯醌還原酶表達(dá)的結(jié)果分析。圖13A陽性對照分子15D-PGJ2與Keapl的Cys273活性中心的相互作用圖。圖 13B陽性對照分子15D-PGJ2與Keapl的Cys288活性中心的相互作用圖。圖14A藁本內(nèi)酯與Keapl的Cys273活性中心的相互作用圖。圖14B藁本內(nèi)酯與 Keapl的Cys288活性中心的相互作用圖。圖15是藁本內(nèi)酯在細(xì)胞水平誘導(dǎo)苯醌還原酶表達(dá)的結(jié)果分析。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式 限制本發(fā)明。實(shí)施例1 一種以keapl蛋白的半胱氨酸殘基Cysl51為活性位點(diǎn)，進(jìn)行化學(xué)防癌抗 癌藥物的虛擬篩選。(一 )虛擬篩選步驟如下1、利用同源模建軟件確定Keapl蛋白結(jié)構(gòu)活性功能域的PDB的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)利用Swiss Model在線服務(wù)，提取human Keapl的氨基酸序列(FASTA格式，圖2)， 提交Swiss Model的模板搜索功能，以與keapl的BTB功能域高度保守的KLHLll的蛋白質(zhì) 三級結(jié)構(gòu)(3i3nb)為模板，同源建模，確定keapl的活性功能域的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)(1_314) 如圖3所示。通過同源建模方法得到的模型往往會(huì)有一些不合理的結(jié)構(gòu)，因此，采用在線模型 分析工具 Molprobity (http://molprobity. biochem. duke, edu/index, php)進(jìn)行評估。評 估標(biāo)準(zhǔn)為紅色表示較為嚴(yán)重的過近接觸(atom clashes)；綠色表示不合理的二面角；紫 色表示不合理的Cb ；橘黃色表示不合理的rotamer。由圖4的評估結(jié)果可以很明顯地看出， 以keapl的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)Cysl51為活性中心的口袋范圍幾乎不存在不合理結(jié)構(gòu) 或過近接觸。summary statistics顯示此模型基本合理。因此，圖3所示的keapl的活性 功能域的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的模型可以不采取進(jìn)一步優(yōu)化而直接用于后續(xù)操作。2、采用Autodock分子對接軟件，依據(jù)keapl的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)Cysl51確 定活性中心，設(shè)定活性口袋；本步驟中，首先利用已知的可與keapl的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)Cysl51發(fā)生加 成反應(yīng)的分子做陽性對照分子，依據(jù)其在以活性位點(diǎn)Cysl51為中心構(gòu)建的活性口袋中與 口袋相互作用的結(jié)合能以及是否有利于發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)，確定keapl蛋白中以 Cysl51為中心的活性口袋的大小。2. 1利用Autodock分子對接軟件進(jìn)行分子對接計(jì)算的程序設(shè)置。主要步驟如下1)、將步驟1中，同源建模確定的keapl活性功能區(qū)域的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)在
6MGLTooIs中進(jìn)行處理。主要包括去除水分子，加非極性氫，加上Gasteiger電荷。最后保存 為 hKeaplforMD. pdbqt。2)、計(jì)算格點(diǎn)能量(AutoGrid)，在 Grid > Set Map Types > Directly 中把要進(jìn)行 格點(diǎn)能量計(jì)算的原子類型輸入進(jìn)去。運(yùn)行AutoGrid，完成之后會(huì)生成一系列文件，主要為每 個(gè)原子的map文件。3)、為每個(gè)小分子配體準(zhǔn)備對接所需的文件夾，這個(gè)過程要使用SHELL腳本實(shí)現(xiàn) (圖5)。先制作一個(gè)小分子配體的列表文件ligands. list，然后按照圖5所示的SHELL腳 本的命令依次輸入命令運(yùn)行腳本a. csh ；完成上面的操作后就會(huì)為每個(gè)小分子配體生成一 個(gè)文件夾，該文件夾包含對接所需的所有文件配體、受體、AutoGrid產(chǎn)生的map文件、dpf 文件等。下一步即可以對接。4)、循環(huán)運(yùn)行AutoDock 循環(huán)運(yùn)行AutoDock，對接每一個(gè)小分子配體，并提取結(jié)合 能等對接結(jié)果并對對接結(jié)果排序。這個(gè)腳本可以同時(shí)運(yùn)行多個(gè)，互不干擾，因此可以完全利 用計(jì)算機(jī)資源。5)、提取對接結(jié)果最后得到summary, sort 虛擬篩選至此做完。2. 2以keapl的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)Cysl51為活性中心，設(shè)定活性口袋；利用Pocket-Finder搜尋在Cys 151附近可能的活性結(jié)合口袋(網(wǎng)址:http:// www. modelling, leeds. ac. uk/pocketfinder/)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Cysl51 附近沒有明顯的結(jié)合口 袋?？紤]到Cysl51是親水性氨基酸殘基，推測Cysl51附近可能會(huì)存在親水性的結(jié)合口袋。 分子對接采用Autodock4. 2程序以及相應(yīng)的圖形化分析軟件MGLTools-1. 5. 4。在MGLTools 中調(diào)整顯示方式，顯示keapl表面特征，結(jié)果見圖6。圖6中黃色部分表示Cysl51的位置， 由圖6可看到Cysl51附近有明顯圍起的凹槽，圖6中右邊為已知可與keapl的Cysl51位 置發(fā)生結(jié)合的陽性參照分子DEM6。很明顯，圖6中的那個(gè)凹槽溶劑可及面較大，為活性口袋 設(shè)置區(qū)域。由于考慮到口袋受水影響比較大，因此用Autodocki 2對小分子配體在這個(gè)口 袋中的適合度進(jìn)行考察，進(jìn)一步優(yōu)化口袋的設(shè)置。對接時(shí)活性口袋的設(shè)置首先打開keapl的坐標(biāo)文件，找到Cysl51各個(gè)原子 的坐標(biāo)，分別在χ、y、ζ三個(gè)方向求平均值，得出Cysl51的中心坐標(biāo)，并記下數(shù)值(即χ 為-10. 094、y為-6. 533、ζ為-32. 398)。設(shè)置活性口袋時(shí)，活性口袋中心處對應(yīng)的x、y、ζ 先分別填上上述數(shù)值。網(wǎng)格大小的默認(rèn)值為40X40X40，步長(spacing)為0. 375nm，然 后通過反復(fù)調(diào)整網(wǎng)格大小的數(shù)值，進(jìn)一步確定活性口袋的位置和大小，使其剛好能包住凹 槽。以keapl的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)Cysl51為活性中心的活性口袋為中心坐標(biāo)為χ 為-10. 094,y為"6. 533,ζ為-32. 398，活性口袋的大小根據(jù)下面2. 3步驟中的陽性對照分 子的分子對接結(jié)果和相互作用方式來決定。2. 3調(diào)整和驗(yàn)證活性口袋對接采用計(jì)算機(jī)廣泛應(yīng)用的Lamarckian遺傳算法(LGA)，每個(gè)配體產(chǎn)生50個(gè)對接 構(gòu)象，ga_p0p_SiZe設(shè)為300ga_num_evalS設(shè)為250000，其余參數(shù)采用程序默認(rèn)值。對接時(shí) 小分子配體可以自由轉(zhuǎn)動(dòng)，蛋白質(zhì)分子則被固定。計(jì)算結(jié)束后以RMSD值作為聚類分析的依 據(jù)。利用已知的可與keapl的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)Cysl51發(fā)生加成反應(yīng)的分子(1) xanthohumol ； (2) isoliquiritigenin ； (3)DEM(結(jié)構(gòu)式如下)做陽性對照分子，依據(jù)它們
在活性口袋中與口袋相互作用的結(jié)合能以及是否有利于發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證 keapl蛋白中以Cysl51為活性中心的活性口袋。根據(jù)反復(fù)驗(yàn)證，我們最終確定了活性口袋的設(shè)置條件。具體如下為以keapl 的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)Cysl51為活性中心的活性口袋中心坐標(biāo)為χ為-10. 094、y 為-6. 533、ζ 為-32. 398，網(wǎng)格大小值為 30 X 34 X 34，步長(spacing)為 0. 375nm。下面是在確定的這一活性口袋下，三個(gè)陽性對照分子在活性口袋中與活性中心及 周圍基團(tuán)相互作用的分析。(l)xanthohumol 結(jié)構(gòu)式(2) isoliquiritigenin 結(jié)構(gòu)式(3)DEM 結(jié)構(gòu)式作用圖截取簇中構(gòu)象數(shù)大且結(jié)合能也較高的進(jìn)行分析，結(jié)果分別如圖7至圖9。通 過觀察這三個(gè)參照分子的對接結(jié)果可得出如下結(jié)論結(jié)合能均不高，處于_3到-6之間。小 分子配體在和活性口袋周圍氨基酸殘基作用時(shí)，這種非鍵作用(結(jié)合能)既不能太大也不 能太小太小的話，一方面特異性差，另一方面配體還來不及穩(wěn)定在Cys 151附近就可能受 其它干擾因素的影響而離開口袋；太大的話又限制了配體的空間取向，不能使配體中的不 飽和單元采取最有利的空間取向和Cysl51的巰基發(fā)生加成反應(yīng)。仔細(xì)觀察氫鍵的形成發(fā) 現(xiàn)Vall32、Argl35、Lysl3U Lysl50這四個(gè)殘基在促進(jìn)配體與受體發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)起 了關(guān)鍵作用。在DEM與Keapl的作用中可以看到大部分的構(gòu)象中Lysl31與Vall32殘基 中肽鍵單元中的N-H分別與DEM的醚氧和羰基氧形成氫鍵，同時(shí)Lysl50殘基上ε -氨基中 的氫與另外一個(gè)羰基氧形成氫鍵，這種空間結(jié)合恰好使Cysl51的巰基與DEM上的碳碳雙鍵 相對，促進(jìn)了 DEM發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。在isoliquiritigenin與Keapl的作用中可以看 到大部分的構(gòu)象中Argl35殘基胍基中的N-H與一側(cè)的酚羥基氧形成氫鍵，一部分構(gòu)象中 Lysl31和Vall32殘基中肽鍵單元的N-H與羰基氧形成氫鍵，一部分構(gòu)象中Lysl50殘基上
ε -氨基中的氫與一側(cè)的酚羥基氧形成氫鍵。這種空間結(jié)合也同樣促進(jìn)配體與Cysl51殘基 的巰基發(fā)生加成反應(yīng)。xanthohumol的結(jié)構(gòu)與isoliquiritigenin比較相似，氫鍵形成方式 與xanthohumol幾乎類同。通過xanthohumol，isoliquiritigenin, DEM 做陽性對照，確定了上述以 keapl 蛋 白中Cysl51為活性中心的活性中心及活性口袋設(shè)置的合理性，可以進(jìn)行下一步的小分子 配體篩選。3、對小分子配體進(jìn)行篩選，篩選項(xiàng)目為毒性篩選、類藥性篩選、和藥效團(tuán)含有情況 篩選在正式對接前對小分子配體數(shù)據(jù)庫中的小分子配體進(jìn)行篩選。篩選項(xiàng)目為毒性篩 選、類藥性篩選、以及藥效團(tuán)含有情況篩選(三種篩選排序不分先后)。小分子配體數(shù)據(jù)庫選定免費(fèi)的國際天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(httpV/bioinformatics. charite. de/supernatural/)，該數(shù)據(jù)庫中含有45917種目前國際上已經(jīng)報(bào)道過的并且是容易從公司購買得到的天然有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。當(dāng)然，除此之外，還可以根據(jù)中藥藥 理的最新研究成果，根據(jù)科學(xué)研究和文獻(xiàn)報(bào)道，搜集一批含有α，β-不飽和結(jié)構(gòu)單元(藥 效基團(tuán))的小分子化合物及其結(jié)構(gòu)信息，與國際天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫合并構(gòu)建小分子配體數(shù)據(jù)庫。3. 1毒性篩選運(yùn)用化合物毒性預(yù)測軟件Osiris對小分子配體數(shù)據(jù)庫中的小分子 配體進(jìn)行毒性預(yù)測，淘汰毒性預(yù)測結(jié)果顯示陽性的分子。3. 2類藥性篩選運(yùn)用ADME (藥代動(dòng)力學(xué))預(yù)測軟件或相關(guān)軟件的ADME預(yù)測功能 計(jì)算小分子配體數(shù)據(jù)庫中各個(gè)小分子配體的類藥性指數(shù)，指標(biāo)包括多項(xiàng)，比如分子量、氫 鍵受體、氫鍵給體、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)、脂水分配系數(shù)、水溶性指數(shù)、分子極性表面積、分子體積、基 于經(jīng)驗(yàn)的藥物類似性指數(shù)、化學(xué)焓變指數(shù)(分子穩(wěn)定性指數(shù))。依據(jù)各指數(shù)反映的分子類藥 性優(yōu)劣，再給予各指數(shù)以優(yōu)劣評分，指數(shù)最優(yōu)者為1，指數(shù)最劣者為0。將每個(gè)分子的10項(xiàng) 指數(shù)優(yōu)劣性評分加和，得出總類藥性評分。3. 3藥效團(tuán)含有情況篩選根據(jù)本篩選目的確定藥效基團(tuán)為α，β -不飽和結(jié)構(gòu)單 元，因此我們采用結(jié)構(gòu)式搜索的方式，將數(shù)據(jù)庫中含有α，β-不飽和結(jié)構(gòu)單元小分子配體 搜索出來。4、建立對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫綜合步驟3中的毒性篩選結(jié)果，類藥性評估結(jié)果和含有藥效團(tuán)的小分子配體的搜 索結(jié)果，建立適用于本篩選目的對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫。5、根據(jù)設(shè)定的活性口袋，利用分子對接軟件，將對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫中的小 分子配體與活性口袋一一做對接；根據(jù)上述步驟確定的活性口袋及對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫，運(yùn)行2. 1中設(shè)置的分 子對接程序。將小分子配體與活性口袋一一做對接，確定先導(dǎo)藥物。分為大批量篩選與精 確篩選兩個(gè)步驟。大批量篩選設(shè)置Autodock 中的參數(shù) ga_num_evals = 2500000 及 ga_run = 10， 運(yùn)行2. 1中設(shè)置的分子對接程序，進(jìn)行一一對接。當(dāng)然也可依據(jù)構(gòu)建的或選定的其它小分子配體數(shù)據(jù)庫的大小進(jìn)行g(shù)a_num_evalS 及ga_run的設(shè)置。精確篩選將Autodock軟件中的ga_num_evalS和ga_run參數(shù)設(shè)置到最高，即ga_ num_evals = 250000, ga_run = 50，運(yùn)行2. 1中設(shè)置的分子對接程序，進(jìn)行精確篩選。6、根據(jù)對接結(jié)果的排序，初步確定具有化學(xué)防癌或抗癌效果的先導(dǎo)藥物。經(jīng)過第5步的精確篩選，獲得對接后小分子配體數(shù)據(jù)庫，根據(jù)對接結(jié)果的排序，初 步確定具有化學(xué)防癌或抗癌效果的先導(dǎo)藥物。當(dāng)然，為了進(jìn)一步縮小先導(dǎo)藥物的個(gè)數(shù)還可以采用綜合評價(jià)對接結(jié)果的排序，小 分子配體藥效團(tuán)含有情況以及小分子配體與活性中心的相互作用方式，來確定具有化學(xué)防 癌或抗癌效果的先導(dǎo)藥物。( 二)利用細(xì)胞高通量篩選平臺(tái)篩選具有防癌抗癌藥物通過上述的虛擬篩選，從免費(fèi)的天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)中篩選出一批與以Cysl51為中心 構(gòu)建的活性口袋相互作用較好的候選化合物。然后按照圖11所示的流程圖，利用細(xì)胞高通 量篩選平臺(tái)in vitro QR activity assay系統(tǒng)，進(jìn)一步篩選候選化合物，確定II相酶誘導(dǎo)劑藥物，從而確定具有防癌抗癌藥物。1、我們從虛擬篩選后的候選化合物中，隨意選擇一個(gè)化合物大豆異黃酮， Genistein,分子結(jié)構(gòu)如下所示， 按照圖11所示的流程圖，進(jìn)行細(xì)胞高通量實(shí)驗(yàn)。苯醌還原酶(NAD(P)H:quinone reductase，QR)，是一種典型的藥物代謝Phase II 酶，能夠催化醌類物質(zhì)的兩電子還原生成氫醌，阻斷了半醌自由基的產(chǎn)生，防止了大量氧自 由基的形成，因此在腫瘤生成的初始階段發(fā)揮重要的腫瘤預(yù)防作用。由于利用鼠肝癌細(xì)胞 株H印a lclc7細(xì)胞可以容易方便地測定QR的誘導(dǎo)，具有穩(wěn)定性和高通量的優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞經(jīng) Genisteind,5,10,50,100M)及對照組(溶劑組)處理后，加入QR反應(yīng)底物(甲萘醌)及 相應(yīng)的反應(yīng)液，反應(yīng)后測定595nm處吸光度用以測定QR活性，并通過比較給藥組及對照組 單位蛋白濃度的吸光度值的變化來判定藥物的QR誘導(dǎo)活性。大豆異黃酮的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果如圖12所示，不同劑量組(1，10，50，100M)的大豆異黃 酮誘導(dǎo)QR表達(dá)，達(dá)到對照組的約1. 82,3. 05,3. 85以及4. 42倍，且這些QR表達(dá)的增加與對 照組相比均有差異或者顯著性差異(*，P < 0. 05 ；**，p < 0. 01)。結(jié)論確定大豆異黃酮為 II相酶誘導(dǎo)劑藥物，從而確定其為具有防癌抗癌的藥物。分析大豆異黃酮，Genistein,分子中含有典型的α，β -不飽和結(jié)構(gòu)單元(藥效 基團(tuán))，其分子對接結(jié)果如圖IOA和圖IOB所示，LYS150參與了幾乎所有構(gòu)象與keapl活性 口袋的相互作用，作用方式與DEM類似。因此大豆異黃酮是通過與Keapl的Cysl51的巰基 位點(diǎn)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，從而改變了 keapl的構(gòu)型，導(dǎo)致Nrf2的解離并誘導(dǎo)了 II相酶的 表達(dá)，從而發(fā)揮其防癌作用。2、通過虛擬篩選后其它候選化合物，都可以按照大豆異黃酮的方法，繼續(xù)進(jìn)行細(xì) 胞高通量實(shí)驗(yàn)，從而確定其是否為II相酶誘導(dǎo)劑藥物，最終確定其是否為具有防癌抗癌的 藥物。實(shí)施例二一種以keapl蛋白的半胱氨酸殘基Cys273以及Cys288為活性位點(diǎn)，進(jìn) 行化學(xué)防癌抗癌藥物的虛擬篩選。Keapl蛋白的Cys273以及Cys288同時(shí)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)時(shí)，方能改變Keapl的 構(gòu)型，并相應(yīng)地解離Nrf2轉(zhuǎn)錄因子，促使其進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮增加II相酶表達(dá)的作用。根據(jù)此 基本理論，確定以Cys273以及Cys288兩個(gè)半胱氨酸殘基同時(shí)做為活性中心。1、利用同源模建軟件確定Keapl蛋白結(jié)構(gòu)活性功能域的PDB的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)同實(shí)施例12、采用Autodock分子對接軟件，依據(jù)keap 1的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)CYS151確 定活性中心，設(shè)定活性口袋；同實(shí)施例1，不同是
2. 2以keapl的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)Cys273以及Cys288為活性中心，設(shè)定活性 口袋；對接時(shí)活性口袋的設(shè)置首先打開keapl的坐標(biāo)文件，找到Cys273以及Cys288各 個(gè)原子的坐標(biāo)，分別在x、y、ζ三個(gè)方向求平均值，得出Cys273以及Cys288的中心坐標(biāo)，并 記下數(shù)值(即χ為-17. 717,y為-4. 149,ζ為-78. 05)。設(shè)置活性口袋時(shí)，活性口袋中心處 對應(yīng)的x、y、z先分別填上上述數(shù)值。網(wǎng)格大小的默認(rèn)值為40X40X40，步長(spacing)為 0. 375nm，然后通過反復(fù)調(diào)整網(wǎng)格大小的數(shù)值，進(jìn)一步確定活性口袋的位置和大小，使其剛 好能包住凹槽。以keapl的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)Cys273以及Cys288為活性中心的活性 口袋活性中心坐標(biāo)為x為-17. 717、y為-4. 149、ζ為-78. 05，活性口袋的大小根據(jù)下面 2. 3步驟中的陽性對照分子的分子對接結(jié)果和相互作用方式來決定。2. 3調(diào)整和驗(yàn)證活性口袋利用已知的可與Cys273以及Cys288均發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)的15-脫氧前列腺素 J2 (15-Deoxy-12,14-Prostaglandin J2，15D-PGJ2,結(jié)構(gòu)式如下)做陽性對照分子，依據(jù)它 們在活性口袋中與口袋相互作用的結(jié)合能以及是否有利于發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn) 證并確立keapl蛋白中以Cys273以及Cys288為活性中心的活性口袋，并進(jìn)行下一步對接。根據(jù)反復(fù)驗(yàn)證，我們最終確定了活性口袋的設(shè)置條件。具體如下為以keapl的活 性半胱氨酸殘基位點(diǎn)Cys273和Cys288為活性中心的活性口袋中心坐標(biāo)為χ為-17. 717、 y 為-4. 149、ζ 為-78. 050，網(wǎng)格大小值為 60 X 62 X 62，步長(spacing)為 0. 375nm。下面是在確定的這一活性口袋下，陽性對照分子在活性口袋中與活性中心及周圍 基團(tuán)相互作用的分析。 15D-PGJ2與Cys73及Cys288活性中心相互作用的結(jié)果如圖13A和圖13B所示。 陽性對照分子15D-PGJ2與Cys273活性中心之間具有良好的相互作用，結(jié)合能達(dá)到-4. 6， 且呈現(xiàn)出15D-PGJ2的藥效基團(tuán)(α，β -不飽和基團(tuán))從空間取向上正對著Cys273半胱 氨酸殘基(黃色部分)的位置，此種作用方式使邁克爾加成反應(yīng)更容易進(jìn)行。15D-PGJ2與 Cys288的作用方式與此類似，也是從空間上更有助于邁克爾加成反應(yīng)的發(fā)生。通過陽性對照，進(jìn)一步確定并驗(yàn)證了所獲得的上述以keapl蛋白中Cys273以及 Cys288為活性中心的活性口袋的合理性，可以進(jìn)行下一步的小分子配體篩選。3、對小分子配體進(jìn)行篩選，篩選項(xiàng)目為毒性篩選、類藥性篩選、和藥效團(tuán)含有情況 篩選同實(shí)施例1。4、建立對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫同實(shí)施例1。
5、根據(jù)設(shè)定的活性口袋，利用分子對接軟件，將對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫中的小 分子配體與活性口袋一一做對接；同實(shí)施例1。6、根據(jù)對接結(jié)果的排序，初步確定具有化學(xué)防癌或抗癌效果的先導(dǎo)藥物。同實(shí)施例1。( 二)利用細(xì)胞高通量篩選平臺(tái)篩選具有防癌抗癌藥物通過上述的虛擬篩選，從免費(fèi)的天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)中篩選出一批與以Cys273以及 Cys288為中心構(gòu)建的活性口袋相互作用較好的候選化合物。然后按照圖11所示的流程圖， 利用細(xì)胞高通量篩選平臺(tái)in vitro QRactivity assay系統(tǒng)，進(jìn)一步篩選候選化合物，確定 II相酶誘導(dǎo)劑藥物，從而確定具有防癌抗癌藥物。1、我們從虛擬篩選后的候選化合物中，隨意選擇一個(gè)化合物藁本內(nèi)酯 ligustilide, Ligustilide是著名中藥當(dāng)歸中的有效成分，占當(dāng)歸揮發(fā)油成分的45%左
右。其分子結(jié)構(gòu)如下所示， 按照圖11所示的流程圖，進(jìn)行細(xì)胞高通量實(shí)驗(yàn)。由于鼠肝癌細(xì)胞株Ifepa lclc7細(xì)胞經(jīng)Ligustilide(l，5，10，50，100M)及對照 組(溶劑組)處理后，加入QR反應(yīng)底物(甲萘醌)及相應(yīng)的反應(yīng)液，反應(yīng)后測定595nm 處吸光度用以測定QR活性，并通過比較給藥組及對照組單位蛋白濃度的吸光度值的變化 來判定藥物的QR誘導(dǎo)活性。其統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果如圖15所示，不同劑量組(1，10，50，100M)的 Ligustilide誘導(dǎo)QR表達(dá)分別達(dá)到對照組的約2. 6,3. 4,4. 7以及42. 6倍，且這些QR表達(dá) 的增加與對照組相比均有差異或者顯著性差異(*，P < 0. 05 ；**，p < 0. 01)。結(jié)論確定藁 本內(nèi)酯為II相酶誘導(dǎo)劑藥物，從而確定其為具有防癌抗癌的藥物。分析藁本內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中含有典型的α，β-不飽和結(jié)構(gòu)單元，其Autodock分子對接 結(jié)果如圖14Α和圖14Β所示。與15D-PGJ2的對接結(jié)果類似，Ligustilide的α，β -不飽 和基團(tuán)也都分別從空間上處于與Cys273(圖14A)以及Cys288 (圖14B)相對的位置上，并 且其結(jié)合能均達(dá)到_5左右，充分保證了此種作用方式的穩(wěn)定性，從而使Ligustilide成為 進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞平臺(tái)驗(yàn)證的最佳藥物。2、通過虛擬篩選后其它候選化合物，都可以按照藁本內(nèi)酯的方法，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞 高通量實(shí)驗(yàn)，從而確定其是否為II相酶誘導(dǎo)劑藥物，最終確定其是否為具有防癌抗癌的藥 物。實(shí)施例三一種以keapl蛋白的半胱氨酸殘基Cys257為活性位點(diǎn)，進(jìn)行化學(xué)防癌抗
12癌藥物的虛擬篩選。方法與實(shí)施例1相同，不同點(diǎn)在于設(shè)置活性口袋時(shí)以Cys257的中心坐標(biāo)為活 性口袋的中心。實(shí)施例四一種以keapl蛋白的半胱氨酸殘基Cys297為活性位點(diǎn)，進(jìn)行化學(xué)防癌抗 癌藥物的虛擬篩選。方法與實(shí)施例1相同，不同點(diǎn)在于設(shè)置活性口袋時(shí)以Cys297的中心坐標(biāo)為活 性口袋的中心。
權(quán)利要求
一種以Keap1為靶點(diǎn)的新型防癌抗癌藥物的虛擬篩選方法，其特征在于包括以下步驟1)確定Keap1蛋白結(jié)構(gòu)的PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)；2)采用分子對接軟件，依據(jù)keap1的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)確定活性中心，設(shè)定活性口袋；3)對小分子配體進(jìn)行篩選，篩選項(xiàng)目為毒性篩選、類藥性篩選以及藥效團(tuán)含有情況篩選；4)建立對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫；5)根據(jù)設(shè)定的活性口袋，利用分子對接軟件，將對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫中的小分子配體與活性口袋一一做對接；6)根據(jù)對接結(jié)果的排序，初步確定具有化學(xué)防癌或抗癌效果的先導(dǎo)藥物。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種以Keapl為靶點(diǎn)的新型防癌抗癌藥物的虛擬篩選方法， 其特征在于步驟3)可以置于步驟1)至步驟6)任何一個(gè)步驟之前。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種以Keapl為靶點(diǎn)的新型防癌抗癌藥物的虛擬篩選方法， 其特征在于步驟6)為根據(jù)對接結(jié)果的排序，小分子配體藥效團(tuán)含有情況以及小分子配 體與活性中心的相互作用方式，綜合評價(jià)，初步確定具有化學(xué)防癌或抗癌效果的先導(dǎo)藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以Keap1為靶點(diǎn)的新型防癌抗癌藥物的虛擬篩選方法。包括以下步驟1)確定Keap1蛋白結(jié)構(gòu)的PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)；2)采用分子對接軟件，依據(jù)keap1的活性半胱氨酸殘基位點(diǎn)確定活性中心，設(shè)定活性口袋；3)對小分子配體進(jìn)行篩選；4)建立對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫；5)根據(jù)設(shè)定的活性口袋，利用分子對接軟件，將對接用小分子配體數(shù)據(jù)庫中的小分子配體與活性口袋一一做對接；6)根據(jù)對接結(jié)果的排序，初步確定具有化學(xué)防癌或抗癌效果的先導(dǎo)藥物。采用本發(fā)明可在短時(shí)間內(nèi)獲得活性化合物的線索，然后再利用動(dòng)物水平篩選或者高通量細(xì)胞平臺(tái)篩選具有防癌抗癌藥物，大大提高了速度和效率，縮短新藥研究周期。
文檔編號(hào)G06F19/00GK101916330SQ201010246449
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者劉劍利, 張勇, 曹向宇, 李芳瞳, 蘆秀麗, 陳樹超, 高兵 申請人:遼寧大學(xué)