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用于檢測NOTCH3基因SNP位點rs12082基因型的試劑盒的制作方法

文檔序號:12412909閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.用于檢測NOTCH3基因SNP位點rs12082基因型的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒包括引物對和PCR檢測反應試劑;其中,所述引物對為(1)或(2)中的一種:

(1)上游引物:NOTCH3-F 5'- AATGGGAGCCAGGGCAGAT-3',

下游引物:NOTCH3-R 5'- GAAGAGAAAGTACCACTCAGGCAG-3';

(2)與(1)中的互補序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于:所述PCR檢測反應試劑包括含EvaGreen 的Green-2-Go qPCRMastermix。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒,其特征在于:所述PCR擴增時的反應體系為:

Green-2-Go qPCRMastermix(含EvaGreen) 5μl

引物F(10μM) 0.1μl

引物R(10μM) 0.1μl

模板(50ng/μl) 0.5μl

ddH2O 4.3μl

總體積 10μl。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒還包括標準品,所述標準品為重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒,所述重組陰性質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表SEQ ID No.1,所述重組陽性質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.2。

5.一種檢測NOTCH3基因SNP位點rs12082基因型的方法,其特征在于:步驟如下:

(1)構(gòu)建重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒:所述重組陰性質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1,所述重組陽性質(zhì)粒的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No.2;

(2)構(gòu)建PCR擴增時的引物對,所述引物對為a或b中的一種:

a、上游引物:NOTCH3-F 5'- AATGGGAGCCAGGGCAGAT-3'

下游引物:NOTCH3-R 5'- GAAGAGAAAGTACCACTCAGGCAG-3';

b、與a中的互補序列;

(3)提取待測樣本的外周血基因組DNA,對重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒和待測樣本的DNA均使用步驟(2)所述引物,且在同一條件下進行PCR擴增和HRM分析,收集數(shù)據(jù);

作為優(yōu)選,所述HRM分析的條件為:94℃ 90s;60℃ 30s;83-94℃收集數(shù)據(jù),溫度上升速率為0.06℃/s;

(4)根據(jù)收集數(shù)據(jù)繪制高分辨率熔解曲線,根據(jù)重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線判斷待測樣本NOTCH3基因SNP位點rs12082的基因型:

與重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線重合則NOTCH3基因SNP位點rs12082的基因型為GG;

與重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線重合則NOTCH3基因SNP位點rs12082的基因型為AA;

在重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒之間的則NOTCH3基因SNP位點rs12082的基因型為GA。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于:所述PCR擴增時的反應體系為:

Green-2-Go qPCRMastermix(含EvaGreen) 5μl

引物F(10μM) 0.1μl

引物R(10μM) 0.1μl

模板(50ng/μl) 0.5μl

ddH2O 4.3μl

總體積 10μl。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于:所述PCR擴增時的反應條件為:94℃預變性3min;94℃變性10s;60℃退火/延伸20s;40個循環(huán)。

8.權(quán)利要求1-4任一所述的試劑盒的使用方法,其特征在于:步驟如下:

(1)提取待測樣本的外周血基因組DNA,對重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒和待測樣本的DNA均使用相同引物,且在同一條件下進行PCR擴增和HRM分析,收集數(shù)據(jù);

所述HRM分析的條件為:94℃ 90s;60℃ 30s;83-94℃收集數(shù)據(jù),溫度上升速率為0.06℃/s;

(2)根據(jù)收集數(shù)據(jù)繪制高分辨率熔解曲線,根據(jù)重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線判斷待測樣本NOTCH3基因SNP位點rs12082的基因型:

與重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線重合則NOTCH3基因SNP位點rs12082的基因型為GG;

與重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線重合則NOTCH3基因SNP位點rs12082的基因型為AA;

在重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒之間的則NOTCH3基因SNP位點rs12082的基因型為GA。

9.權(quán)利要求1-4任一所述的試劑盒在制備輔助診斷非綜合征唇腭裂的試劑中的應用。

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