本發(fā)明屬于多肽藥物制備領(lǐng)域，涉及一種夫替瑞林的合成方法。
背景技術(shù)：
夫替瑞林(Fertirelina)是一種黃體生成激素釋放因子，多肽序列為Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHEt，其結(jié)構(gòu)式如下所示：
現(xiàn)有夫替瑞林的合成方法中存在反應(yīng)條件苛刻，成本高，收率低等缺陷。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的至少一個不足，提供一種新的夫替瑞林的合成方法，以實現(xiàn)反應(yīng)條件溫和，工藝簡單，成本低，收率高的目的。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來實現(xiàn)：
一種夫替瑞林的合成方法，具體包括以下步驟：
步驟a，制備樹脂：Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin，以二氯甲烷為溶劑，加入Fmoc-Pro-OH溶解和2-氯三苯甲基氯樹脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin，縮寫2-CTC Resin)，加入有機堿N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，反應(yīng)得到Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin，其中2-Chlorotrityl Chloride Resin的替代度0.3-1.1mmol/g。
步驟b，制備肽樹脂：Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-2CTC Resin；以Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin為起始，采用固相法依次偶聯(lián)具有保護基團的氨基酸，合成肽樹脂。
步驟c，制備全保護肽鏈片段：Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH；將步驟b得到的肽樹脂加入切肽試劑，得到全保護肽鏈片段。
步驟d，制備全保護夫替瑞林：對全保護肽鏈片段的C端進行乙胺化得到全保護夫替瑞林。
步驟e，切除側(cè)鏈得到夫替瑞林：在全保護夫替瑞林中加入冰切割試劑低溫保持10-20min后，加熱至25℃反應(yīng)2-3h，得到夫替瑞林粗品，其中切割試劑為三氟乙酸(TFA)：三異丙基硅烷(Tris)：巰基丙酸(MPA)：苯酚：H2O＝90:4:3:2:1。
本發(fā)明中裂解反應(yīng)初期，瞬間大量放熱，溫度迅速上升，高溫容易使多肽變性同時產(chǎn)生很多副反應(yīng)，增加實驗的危險性。本發(fā)明選擇加入冰切割試劑并低溫保持，利于安全穩(wěn)定的進行實驗，并降低副反應(yīng)。
本發(fā)明中切割試劑綜合考慮夫替瑞林的結(jié)構(gòu)，促進不同保護基團的裂解，捕獲被裂解的基團，同時阻止復(fù)雜環(huán)境下的副反應(yīng)。
步驟f，粗肽純化。
進一步，所述步驟a中，室溫反應(yīng)2-4小時，抽干后進行多次洗滌，然后加入無水甲醇封閉樹脂上未連接Fmoc-Pro-OH的活性基團。
進一步，所述步驟a中，多次洗滌，分別采用DMF洗兩次，然后用DCM洗兩次，最后用無水甲醇洗兩次，接著加入無水甲醇攪拌或震蕩反應(yīng)1-3小時封閉樹脂上未連接Fmoc-Pro-OH的活性基團，抽干，得到Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin。
本發(fā)明中步驟a的洗滌，首先采用溶解性最好的DMF，溶解上一步反應(yīng)殘留物附著在樹脂上的反應(yīng)物，但是DMF不易揮發(fā)，不易抽凈。
DCM也是很好的溶解性，和DMF互溶，溶解性比較好，易揮發(fā)也易抽凈。在本步驟中，DCM和DMF的順序可以互換，影響較小，但是優(yōu)選DMF在前。
無水甲醇需要放在最后，其互溶性好，溶解性也好，可以收縮樹脂會使樹脂體積大大減小，也順應(yīng)了下一步用無水甲醇封閉樹脂多余活性基團的反應(yīng)。
其中無水甲醇既能洗滌又會收縮樹脂，使樹脂體積變小節(jié)省試劑用量，但如果最先用無水甲醇洗滌不利于樹脂徹底洗滌，在樹脂體積變小的時候上一步反應(yīng)殘留的物質(zhì)易被包裹，不利于徹底清洗。
體積小、干燥的樹脂適合保存。而DMF和DCM都會讓樹脂溶脹，體積變大。如果不用無水甲醇洗，在下一步反應(yīng)時有DMF或者DCM殘留，需要用更多的無水甲醇試劑封閉、收縮。
其次，順應(yīng)了下一步用無水甲醇封閉樹脂多余活性基團的反應(yīng)：用無水甲醇封閉氯樹脂未連接脯氨酸的活性基團，這里既有洗滌作用，又能把試劑實現(xiàn)較好的過渡。
優(yōu)選的，所述步驟a中2-Chlorotrityl Chloride Resin的替代度為0.4-0.7mmol/g。
替代度太高在會增加有機合成中氨基酸偶聯(lián)的困難，增多雜質(zhì)，延長生產(chǎn)周期，降低收率。替代度太低合成偶聯(lián)容易，但制備需要用到大量的昂貴的樹脂和試劑，也延長整體實驗時間，增加了成本，降低了效率。因此綜合考慮上述因素，本發(fā)明優(yōu)選的步驟a中2-Chlorotrityl Chloride Resin的替代度為0.4-0.7mmol/g。
進一步，所述步驟b中肽樹脂的制備方法為：
(1)取樹脂F(xiàn)moc-Pro-2-Chlorotrityl Resin，浸泡在二氯甲烷中20-40min，抽干，用DMF洗滌三遍，抽干；
(2)加入脫帽試劑，反應(yīng)兩次，去除Fmoc保護基團；洗滌至少6次，洗滌順序：二甲基甲酰胺(DMF)，無水甲醇，DMF，二氯甲烷(DCM)+DMF，DMF，DMF，抽干；以DMF為溶劑，加入Fmoc-Arg(pbf)-OH及N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)和1-羥基苯并三唑(HOBT)的組合或者N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)和縮合劑的組合，其中縮合劑選自2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PYBOP)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)和1-羥基苯并三唑(HOBT)的混合物、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PYBOP)和1-羥基苯并三唑(HOBT)的混合物中的一種；偶聯(lián)1-3小時，茚三酮檢測反應(yīng)進程；偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌3遍；重復(fù)(2)上述步驟直至完成最后一個氨基酸焦谷氨酸PGlu；DMF洗三遍，DCM洗三遍，無水甲醇洗三遍,無水甲醇每次5-10min，洗滌后干燥得到肽樹脂。
此步驟中，之所以設(shè)計洗滌至少6次，洗滌順序：二甲基甲酰胺(DMF)，無水甲醇，DMF，二氯甲烷(DCM)+DMF，DMF，是申請人在發(fā)明試驗中不斷觀察，思考，實踐得到：
DMF溶解性最好，可以溶解并帶走大量反應(yīng)殘留物，因此首先使用。
甲醇可以使樹脂收縮，體積變小，減少樹脂表面附著物，樹脂體積縮小也減少洗滌所需要的試劑數(shù)量。但是之后的偶聯(lián)反應(yīng)時如果有無水甲醇殘留會容易參與反應(yīng)形成副產(chǎn)物。所以只能放在前面使用，不能用在后面洗滌。
樹脂洗滌時一縮一脹可以在較少的試劑用量下達到更好的洗滌效果，也節(jié)省試劑。
DMF對樹脂有適當?shù)娜苊浶?，介于甲醇和DCM之間，使樹脂溫和的溶脹開，便于洗滌。
DCM有較好的溶解性和很強的溶脹性，使樹脂充分進一步溶脹開，便于很好的洗滌樹脂，充分溶脹開的狀態(tài)也利于后面的偶聯(lián)反應(yīng)。
樹脂溶脹開后在偶聯(lián)反應(yīng)中更有利于進行，所以需要DCM再次將樹脂充分溶脹開。
后面用溶解性最好的DMF洗滌，進一步保證清洗徹底，避免殘留物進入影響下一步反應(yīng)產(chǎn)生副反應(yīng)。
進一步，步驟b中每一步氨基酸為樹脂摩爾量的1.3-4倍，N,N-二異丙基碳二亞胺為樹脂摩爾量的2.6-24倍，縮合劑為樹脂摩爾量的1.3-4倍。
進一步，步驟b中脫帽試劑為體積分數(shù)20％的哌啶(DBLK)/DMF。
進一步，步驟b中加入脫帽試劑后第一次反應(yīng)10min，第二次反應(yīng)5min。
申請人發(fā)現(xiàn)一次反應(yīng)只能去除大部分的FMOC保護基團。需要再次加新的脫帽試劑，二次反應(yīng)達到相對完全的去除程度。而一次加入過多脫帽試劑也難以達到相對完全的去除程度，二次反應(yīng)后去除效果最佳。
進一步，步驟c中，將步驟b得到的肽樹脂加入切肽試劑體積分數(shù)2％的三氟乙酸/DCM混合溶液；-20到0℃下加入肽樹脂，震蕩/攪拌，保持低溫10-20min；然后升溫至25℃，反應(yīng)2-3小時；抽濾，收集濾液，加有機堿調(diào)節(jié)pH至中性，減壓蒸餾獲得全保護肽鏈片段。
進一步，步驟d中，全保護肽鏈片段溶于DMF中，加六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和乙胺鹽酸鹽；加入有機堿調(diào)節(jié)pH為8-9，攪拌反應(yīng)2-6小時；乙胺化結(jié)束后加入飽和檸檬酸水溶液析出白色固體，抽干，干燥，得全保護夫替瑞林，其中乙胺鹽酸鹽的加入量為全保護肽鏈片段摩爾量的1.2-2倍。
進一步，步驟f中將夫替瑞林粗品溶于水中，用0.45μm微孔過濾板過濾；濾液通過C18制備柱上樣制備，洗脫，收集目標峰肽溶液；高純度肽溶液通過反相柱轉(zhuǎn)鹽，成轉(zhuǎn)醋酸鹽形式；溶液減壓旋蒸濃縮，濃縮液通過低溫冷凍機干燥為粉末狀夫替瑞林。
其中本發(fā)明中用到的所有甲醇均為無水甲醇。
本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：
本發(fā)明通過對工藝路線的深入研究，優(yōu)化合成路線和條件，得到的合成方法操作簡易，反應(yīng)條件溫和，工藝溫和，生產(chǎn)成本低，收率高。
為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，作詳細說明如下。
具體實施方式
實施例1
夫替瑞林的合成方法：
1.制樹脂：Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin。
反應(yīng)器中加入50ml有機溶劑DCM，加入4.5g Fmoc-Pro-OH溶解，加入10g 2-Chlorotrityl Chloride Resin(2-CTC Resin)，浸泡，攪拌或震蕩使其充分溶脹；加入10ml有機堿N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)室溫下反應(yīng)3小時，抽掉。
洗滌：分別采用DMF*2+DCM*2+甲醇*2進行洗滌，加入60ml甲醇攪拌或震蕩反應(yīng)2小時封閉樹脂上未連接Fmoc-Pro-OH的活性基團。抽干，得到Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin。
紫外法檢測樹脂替代度0.6mmol/g。
2.制備肽樹脂：Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-2CTC Resin。
以連接好的樹脂F(xiàn)moc-Pro-2-Chlorotrityl Resin為起始。
(1)取10g樹脂F(xiàn)moc-Pro-2-Chlorotrityl Resin，浸泡在100ml有機溶劑DCM中30min，輔以攪拌使其充分溶脹。抽干，用DMF洗滌三遍，抽掉。
(2)加入100ml脫帽試劑：20％DBLK+DMF，分別反應(yīng)兩次，第一次10min，第二次5min以去除Fmoc保護基團。然后洗滌6遍，具體洗滌順序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF為溶劑，加入9.7g Fmoc-Arg(pbf)-OH，10ml DIPEA和TBTU(4.8g)+HOBT(2g)，常溫下偶聯(lián)2小時，茚三酮檢測反應(yīng)進程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌3遍。
(3)加入100ml脫帽試劑：20％DBLK+DMF，分別反應(yīng)兩次，第一次10min，第二次5min以去除Fmoc保護基團。然后洗滌6遍，具體洗滌順序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF為溶劑，加入5.3g Fmoc-Leu-OH，10ml DIPEA和TBTU(4.8g)+HOBT(2g)常溫下偶聯(lián)2小時，茚三酮檢測反應(yīng)進程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌3遍。
(4)加入100ml脫帽試劑：20％DBLK+DMF，分別反應(yīng)兩次，第一次10min，第二次5min以去除Fmoc保護基團。然后洗滌6遍，具體洗滌順序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF為溶劑，加入4.5g Fmoc-Gly-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶聯(lián)2小時，茚三酮檢測反應(yīng)進程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌3遍。
(5)加入100ml脫帽試劑：20％DBLK+DMF，分別反應(yīng)兩次，第一次10min，第二次5min以去除Fmoc保護基團。然后洗滌6遍，具體洗滌順序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF為溶劑，加入6.9g Fmoc-Tyr(tbu)-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶聯(lián)2小時，茚三酮檢測反應(yīng)進程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌3遍。
(6)加入100ml脫帽試劑：20％DBLK+DMF，分別反應(yīng)兩次，第一次10min，第二次5min以去除Fmoc保護基團。然后洗滌6遍，具體洗滌順序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF為溶劑，加入5.7g Fmoc-Ser(tbu)-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶聯(lián)2小時，茚三酮檢測反應(yīng)進程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌3遍。
(7)加入120ml脫帽試劑：20％DBLK+DMF，分別反應(yīng)兩次，第一次10min，第二次5min以去除Fmoc保護基團。然后洗滌6遍，具體洗滌順序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF為溶劑，加入7.9g Fmoc-Trp(boc)-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶聯(lián)2小時，茚三酮檢測反應(yīng)進程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌3遍。
(8)加入120ml脫帽試劑：20％DBLK+DMF，分別反應(yīng)兩次，第一次10min，第二次5min以去除Fmoc保護基團。然后洗滌6遍，具體洗滌順序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF為溶劑，加入9.3g Fmoc-His(trt)-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶聯(lián)2小時，茚三酮檢測反應(yīng)進程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌3遍。
(9)加入120ml脫帽試劑：20％DBLK+DMF，分別反應(yīng)兩次，第一次10min，第二次5min以去除Fmoc保護基團。然后洗滌6遍，具體洗滌順序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干。以DMF為溶劑，加入2g H-Pyr-OH，5ml DIC和2g HOBT，29度下偶聯(lián)2小時，茚三酮檢測反應(yīng)進程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液。用DMF洗滌3遍，DCM洗3遍，甲醇洗3遍,其中甲醇每次8min，完成洗滌和樹脂收縮。干燥得到肽樹脂。
3.制備全保護肽鏈片段：Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH。
配置2％的三氟乙酸(TFA)DCM混合溶液。-10℃下加入肽樹脂，震蕩，保持低溫15min。升溫至25度，反應(yīng)2.5小時。抽濾，收集濾液，加少量有機堿：N,N-二異丙基乙胺調(diào)解pH至中性，減壓旋蒸獲得全保護片段PGluP-9。
4.制備全保護夫替瑞林。
將3中制得全保護片段PGluP-9溶于適量DMF中，加入PYBOP和乙胺鹽酸鹽。加入有機堿:N,N-二異丙基乙胺調(diào)節(jié)pH＝8.5。攪拌反應(yīng)5小時.HPLC跟蹤反應(yīng)進程。乙胺化結(jié)束后加入飽和檸檬酸水溶液析出白色固體，抽干，干燥，得全保護夫替瑞林。
5.切除側(cè)鏈得夫替瑞林粗品。
玻璃容器中加入冰切割試劑(三氟乙酸TFA：三異丙基硅烷Tris：巰基丙酸mpa：苯酚：H2O＝90：4:3:2:1)低溫保持15min。加熱至25度左右反應(yīng)2.5h。反應(yīng)結(jié)束后。加入冰無水乙醚沉淀，離心/過濾收集沉淀，再用常溫無水乙醚洗滌5遍，真空干燥，得到夫替瑞林粗品。HPLC檢測純度。稱重6.94g。
6.粗肽純化
將6.94g夫替瑞林粗品溶于水中，用0.45μm微孔過濾板過濾。濾液通過C18制備柱上樣制備，洗脫，收集目標峰肽溶液。高純度肽溶液轉(zhuǎn)鹽成醋酸鹽形式。溶液減壓旋蒸濃縮，濃縮液通過低溫冷凍機干燥為粉末狀夫替瑞林2.19g，純度99.6％，收率31.6％。
本發(fā)明雖然已以較佳實施例公開如上，但其并不是用來限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出可能的變動和修改，因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護。