本發(fā)明涉及分子遺傳
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一組SNP位點(diǎn)在篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊中的應(yīng)用及試劑盒。
背景技術(shù)：
：楊樹是北半球地區(qū)廣泛栽培的重要用材樹種，具有廣泛的工業(yè)用途，是制漿造紙、膠合板、包裝材料等的重要原料，有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。楊樹的生長(zhǎng)發(fā)育、木材組織的沉積都來源于光合作用，光合能力的強(qiáng)弱對(duì)于樹木的生長(zhǎng)速率具有決定性作用。面對(duì)人們對(duì)于自然資源需求量的增加，全球氣候變暖，溫室效應(yīng)與日俱增，提高有限的林木及其他光合生物的光合能力以緩解由CO2劇增導(dǎo)致的環(huán)境問題將是一項(xiàng)有效的措施。但現(xiàn)有技術(shù)并沒有提供一種光合作用和生長(zhǎng)性能好的楊樹的篩選方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一組SNP位點(diǎn)在篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊中的應(yīng)用及試劑盒。本發(fā)明提供的應(yīng)用能夠?qū)崿F(xiàn)光合能力強(qiáng)和生長(zhǎng)快的楊樹的快速篩選，大大加速育種進(jìn)程。本發(fā)明提供了一組SNP位點(diǎn)在篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊中的應(yīng)用，所述SNP位點(diǎn)為毛白楊PetC基因第2068位、第2347位和第2457位堿基。本發(fā)明還用于篩選上述技術(shù)方案中SNP位點(diǎn)的引物，所述毛白楊PetC基因第2068位堿基所用引物的序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；第2347位堿基所用引物的序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；第2457位堿基所用引物的序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示。優(yōu)選的是，所述應(yīng)用包括以下步驟：1)提取毛白楊基因組DNA；2)從基因組DNA中擴(kuò)增出毛白楊PetC基因，利用上述技術(shù)方案所述引物分別對(duì)毛白楊PetC基因的第2068位、第2347位和第2457位的基因型進(jìn)行分型；3)根據(jù)所述步驟2)的分型結(jié)果，當(dāng)所述毛白楊PetC基因第2068位基因型為AA、第2347位基因型為AG和第2457位基因型為CC時(shí)，所述毛白楊的光合能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快；當(dāng)所述毛白楊PetC基因第2068位基因型為AG、第2347位基因型為AA和第2457位基因型為TT時(shí)，所述毛白楊的光合能力弱、生長(zhǎng)慢。優(yōu)選的是，所述毛白楊PetC基因的擴(kuò)增的條件為：94℃預(yù)變性3min，93℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5min。優(yōu)選的是，所述步驟2)毛白楊PetC基因的第2068位、第2347位和第2457位的基因型進(jìn)行分型體系各自獨(dú)立地選為：以毛白楊PetC基因?yàn)槟０?，加?.5μL10×buffer，1.8μL25mmolL-1MgCl2，1μL10mmolL-1dNTP，TaqDNA聚合酶1.0U，100nmolL-1權(quán)利要求2所述引物各1μL，加適量雙蒸水至25μL。本發(fā)明還提供了一種用于篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括上述技術(shù)方案所述引物和擴(kuò)增試劑；所述擴(kuò)增試劑包括PCR擴(kuò)增緩沖液，25mmolL-1MgCl2，10mmolL-1dNTP，TaqDNA聚合酶和雙蒸水。本發(fā)明還提供了一種與楊樹光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)的篩選方法，包括以下步驟：1)提取楊樹基因組DNA；2)測(cè)定楊樹基因組DNA中PetC基因的序列；3)篩選出所述步驟2)得到的楊樹PetC基因序列中出現(xiàn)頻率>5％的SNP位點(diǎn)，對(duì)所述SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型；4)利用tassel軟件對(duì)所述基因型分型的結(jié)果與楊樹表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并利用Qvalue軟件對(duì)所述關(guān)聯(lián)分析結(jié)果中的P值進(jìn)行FDR多重檢驗(yàn)，選取FDR<0.05的位點(diǎn)，獲得楊樹PetC基因內(nèi)與楊樹光合作用、生長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。本發(fā)明提供了一組SNP位點(diǎn)在篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊中的應(yīng)用及試劑盒。應(yīng)用本發(fā)明所述SNP位點(diǎn)，可以在毛白楊生長(zhǎng)的早期就能夠高效、準(zhǔn)確地鑒定出光合能力強(qiáng)和生長(zhǎng)快的單株，從而大大加速育種進(jìn)程，縮短選育周期。附圖說明圖1是本發(fā)明提供的篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊SNP位點(diǎn)在PetC基因上的位置示意圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一組SNP位點(diǎn)在篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊中的應(yīng)用，所述SNP位點(diǎn)為毛白楊PetC基因第2068位、第2347位和第2457位堿基。本發(fā)明還用于篩選上述技術(shù)方案中SNP位點(diǎn)的引物，所述毛白楊PetC基因第2068位堿基所用引物的序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；第2347位堿基所用引物的序列如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；第2457位堿基所用引物的序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示。在本發(fā)明中，所述SNP位點(diǎn)的引物如表1所示。采用所述引物，能夠高效、準(zhǔn)確地鑒定出毛白楊PetC基因內(nèi)與楊樹光合和生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)的3個(gè)功能SNP標(biāo)記，有利于在楊樹生長(zhǎng)的早期就能夠高效、準(zhǔn)確地鑒定出光合能力強(qiáng)和生長(zhǎng)快的單株，從而大大加速育種進(jìn)程，縮短了選育周期。表1SNP位點(diǎn)的引物在本發(fā)明中，所述毛白楊PetC基因的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。在本發(fā)明中，所述在篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊中的應(yīng)用優(yōu)選包括以下步驟：1)提取毛白楊基因組DNA；2)從基因組DNA中擴(kuò)增出毛白楊PetC基因，利用上述技術(shù)方案所述引物分別對(duì)毛白楊PetC基因的第2068位、第2347位和第2457位的基因型進(jìn)行分型；3)根據(jù)所述步驟2)的分型結(jié)果，當(dāng)所述毛白楊PetC基因第2068位基因型為AA、第2347位基因型為AG和第2457位基因型為CC時(shí)，所述毛白楊的光合能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快；當(dāng)所述毛白楊PetC基因第2068位基因型為AG、第2347位基因型為AA和第2457位基因型為TT時(shí)，所述毛白楊的光合能力弱、生長(zhǎng)慢。在本發(fā)明中，所述毛白楊PetC基因等位位點(diǎn)第2068位為A/G、第2347位為A/G和第2457位為C/T。在本發(fā)明中，所述光合作用性狀的表型優(yōu)選包括鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性和鐵氧還蛋白含量；所述生長(zhǎng)性狀的表型優(yōu)選包括胸徑和材積。在本發(fā)明中，當(dāng)所述毛白楊PetC基因第2068位基因型為AA、第2347位基因型為AG和第2457位基因型為CC時(shí)，所述毛白楊的光合能力最強(qiáng)、生長(zhǎng)最快。毛白楊PetC基因第2068位基因型為AA時(shí)，鐵氧還蛋白含量最高；毛白楊PetC基因第2347位基因型為AG時(shí)，胸徑和材積最大；毛白楊PetC基因第2457位基因型為CC時(shí)，鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性最高。毛白楊PetC基因第2068位基因型為AG、第2347位基因型為AA和第2457位基因型為TT時(shí)，所述毛白楊的光合能力最弱、生長(zhǎng)最慢。毛白楊PetC基因第2068位基因型為AG時(shí)，鐵氧還蛋白含量最低；毛白楊PetC基因第2347位基因型為AA時(shí)，胸徑和材積最??；毛白楊PetC基因第2457位基因型為TT，鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性最低。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)這3個(gè)SNP位點(diǎn)的堿基預(yù)測(cè)毛白楊光合和生長(zhǎng)性狀。在本發(fā)明中，所述步驟毛白楊PetC基因的第2068位、第2347位和第2457位的基因型進(jìn)行分型體系各自獨(dú)立地選為：以毛白楊PetC基因?yàn)槟０?，加?.5μL10×buffer，1.8μL25mmolL-1MgCl2，1μL10mmolL-1dNTP，TaqDNA聚合酶1.0U，100nmolL-1各位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物各1μL，加適量雙蒸水至25μL。本發(fā)明對(duì)所述毛白楊基因組DNA的提取方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的植物基因組DNA提取方法即可。得到毛白楊基因組DNA后，本發(fā)明從基因組DNA中擴(kuò)增出毛白楊PetC基因，本發(fā)明對(duì)所述PetC基因的擴(kuò)增方法和條件沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的從基因組中擴(kuò)增特定基因的方法即可。如設(shè)計(jì)PetC基因擴(kuò)增用引物，所述引物序列優(yōu)選如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。所述擴(kuò)增體系為：以毛白楊基因組DNA為模板，加入2.5μL10×buffer，1.8μL25mmolL-1MgCl2，1μL10mmolL-1dNTP，TaqDNA聚合酶1.0U，100nmolL-1擴(kuò)增用引物各1μL，加適量雙蒸水至25μL。在本發(fā)明中，所述毛白楊PetC基因的擴(kuò)增的條件為：94℃預(yù)變性3min，93℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5min。本發(fā)明還提供了一種用于篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊的試劑盒，包括表1所述引物和擴(kuò)增試劑；所述擴(kuò)增試劑包括PCR擴(kuò)增緩沖液，25mmolL-1MgCl2，10mmolL-1dNTP，TaqDNA聚合酶和雙蒸水。本發(fā)明還提供了一種與楊樹光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)的篩選方法，包括以下步驟：1)提取楊樹基因組DNA；2)測(cè)定楊樹基因組DNA中PetC基因的序列；3)篩選出所述步驟2)得到的楊樹PetC基因序列中出現(xiàn)頻率>5％的SNP位點(diǎn)，對(duì)所述SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型；4)利用tassel軟件對(duì)所述基因型分型的結(jié)果與楊樹表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并利用Qvalue軟件對(duì)所述關(guān)聯(lián)分析結(jié)果中的P值進(jìn)行FDR多重檢驗(yàn)，選取FDR<0.05的位點(diǎn)，獲得楊樹PetC基因內(nèi)與楊樹光合作用、生長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。在本發(fā)明中，提取楊樹基因組DNA進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，本發(fā)明對(duì)所述楊樹基因組DNA的提取方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的植物基因組提取方法即可。得到楊樹基因組DNA后，本發(fā)明對(duì)PetC基因進(jìn)行擴(kuò)增，本發(fā)明對(duì)所述擴(kuò)增用引物和擴(kuò)增體系條件沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的從基因組中擴(kuò)增目的基因的方法進(jìn)行擴(kuò)增即可。本發(fā)明對(duì)測(cè)序方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的生物公司測(cè)序方法即可。測(cè)定完序列，篩選出所述楊樹PetC基因序列中出現(xiàn)頻率>5％的SNP位點(diǎn)，對(duì)所述SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用組合利用MEGA6.0和DnaSP5.10軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，標(biāo)出SNP位點(diǎn)；基因分型優(yōu)選采用鎖核酸(LNA)法。本發(fā)明利用tassel軟件對(duì)所述基因型分型的結(jié)果與楊樹表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得楊樹PetC基因內(nèi)與楊樹光合作用、生長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。本發(fā)明所述表型數(shù)據(jù)優(yōu)選包括：凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性、鐵氧還蛋白含量、木質(zhì)素含量，綜纖維素含量，α-纖維素含量，微纖絲角，樹高，胸徑和材積。本發(fā)明利用tassel軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，將結(jié)果中的P值進(jìn)行從小到大排列，利用Qvalue軟件進(jìn)行FDR多重檢測(cè)，選擇FDR<0.05即為顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。更優(yōu)選的，利用TASSEL軟件中的混合線性模型進(jìn)行基因型和表型的關(guān)聯(lián)分析，首先選擇P<0.05的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，然后利用FDR假陽性多重檢測(cè)，選擇Q<0.05的與光合和生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP功能位點(diǎn)。下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明提供的一組SNP位點(diǎn)在篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊中的應(yīng)用及試劑盒進(jìn)行詳細(xì)的描述，但是不能將它們理解為對(duì)本申請(qǐng)保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例1光合和生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP功能位點(diǎn)的篩選(1)DNA提取DNeasyPlantMiniKits(Qiagen,Inc.,Valencia,CA,USA)對(duì)毛白楊基因組DNA進(jìn)行提取。(2)擴(kuò)增目的基因毛白楊葉片總RNA的提取和cDNA的合成分別按RNeasyPlantMiniKits(Qiagen,Inc.,Valencia,CA,USA)和Clonetech試劑盒描述的方法進(jìn)行。應(yīng)用25μLDNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系，以毛白楊葉片cDNA為模板，加入2.5μL10×buffer，1.8μL25mmolL-1MgCl2，1μL10mmolL-1dNTP，TaqDNA聚合酶1.0U(以上試劑購自Promega公司)，100nmolL-1擴(kuò)增引物各1μL，加適量雙蒸水至25μL。擴(kuò)增引物如表2中所示。表2基因擴(kuò)增所用引物序列PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3分鐘，93℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5分鐘。最終擴(kuò)增出長(zhǎng)約2500bp的cDNA片段。(3)PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序?qū)CR擴(kuò)增得到的目的基因片段回收后連接于pGEM-T上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，送公司測(cè)序。(4)SNP發(fā)現(xiàn)和基因型分型以最大程度地反映毛白楊自然分布區(qū)域的43個(gè)基因型個(gè)體的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，回收、純化目的片段后與PGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化后挑取陽性單克隆進(jìn)行序列測(cè)定，然后將每一基因片段的核苷酸序列拼接成完整的基因序列。組合利用MEGA6.0和DnaSP5.10軟件對(duì)每一基因的43個(gè)序列進(jìn)行分析，標(biāo)出SNP位點(diǎn)?；蚍中筒捎面i核酸(LNA)法(Koshkin等，TetrahedronLett.(1998)39,4381-4384)。(5)表型的測(cè)定利用LI6400光合測(cè)定儀測(cè)定凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度四個(gè)光合性狀；利用酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒測(cè)定鐵氧還蛋白含量，鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性兩個(gè)光合相關(guān)指標(biāo)；利用近紅外光譜測(cè)定儀測(cè)定每個(gè)基因型個(gè)體的木質(zhì)素含量、纖維素含量、棕纖維素含量三個(gè)木材化學(xué)性狀指標(biāo)；利用X射線衍射儀測(cè)定微纖絲角；利用生長(zhǎng)性狀測(cè)定工具測(cè)定其胸徑、樹高、材積等指標(biāo)。(6)標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析利用TASSEL軟件中的混合線性模型進(jìn)行基因型和表型的關(guān)聯(lián)分析，首先選擇P<0.05的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，然后利用FDR假陽性多重檢測(cè)，選擇Q<0.05的與光合和生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP功能位點(diǎn)。實(shí)施例2利用關(guān)聯(lián)作圖的方法鑒定毛白楊PetC基因內(nèi)與楊樹光合和生長(zhǎng)性狀相關(guān)的功能SNP標(biāo)記。1、關(guān)聯(lián)群體的選擇：全國毛白楊基因庫于1982年收集并保存，包括1047株基因型個(gè)體。對(duì)毛白楊主要分布區(qū)內(nèi)氣象條件進(jìn)行調(diào)研，依據(jù)熱、光和水等16個(gè)氣象因子，最終將整個(gè)毛白楊分布區(qū)劃分為南部氣候區(qū)、東北部氣候區(qū)和西北部氣候區(qū)。所有材料在三個(gè)氣候區(qū)覆蓋的10省市(北京、河北、河南、山東、山西、陜西、甘肅、寧夏、安徽和江蘇)的100個(gè)縣收集，通過根繁方式統(tǒng)一種植在山東省冠縣國營苗圃。本發(fā)明從全國毛白楊基因庫中選取能夠最大程度地反映毛白楊天然分布范圍的435株個(gè)體作為關(guān)聯(lián)群體。2、表型的測(cè)定：共有13種表型用于關(guān)聯(lián)分析，包括凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性、鐵氧還蛋白含量、木質(zhì)素含量，綜纖維素含量，α-纖維素含量，微纖絲角，樹高，胸徑和材積。光合指標(biāo)測(cè)定于2010年7月20日至8月8日期間的晴天，于每日早9:00-11:00進(jìn)行，測(cè)量時(shí)，選取了實(shí)驗(yàn)群體每一個(gè)體主桿頂部第4片至第6片功能葉，并掛標(biāo)簽以做標(biāo)記。光合性狀的測(cè)量以及數(shù)據(jù)記錄，由便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)(Li6400,LiCor)完成(具體操作過程見Li-6400x/說明書)。鐵氧還蛋白含量和鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性測(cè)定于2016年6月測(cè)定，利用酶聯(lián)免疫試(ELISA)劑盒測(cè)定，選取了實(shí)驗(yàn)群體每一個(gè)體主桿頂部第4片至第6片功能葉，立即放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室用液氮研磨成粉末后測(cè)定。木材測(cè)定取樣時(shí)通過取木鉆從關(guān)聯(lián)群體的435株個(gè)體的1.35m處取樣，所取的木材樣品材料包含樹皮和髓。材料長(zhǎng)15厘米直徑為10毫米，采集于2010年。生長(zhǎng)性狀收集于2011年。利用近紅外光譜測(cè)定儀測(cè)定每個(gè)基因型個(gè)體的木質(zhì)素含量、纖維素含量、棕纖維素含量三個(gè)木材化學(xué)性狀指標(biāo)；利用X射線衍射儀測(cè)定微纖絲角；利用生長(zhǎng)性狀測(cè)定工具測(cè)定其胸徑、樹高、材積等指標(biāo)。3、SNP發(fā)現(xiàn)：從全國毛白楊基因庫中選出43株個(gè)體，它們能夠最大程度地反映毛白楊天然分布范圍。以這43株個(gè)體的總DNA為模板，對(duì)每株個(gè)體的PetC基因進(jìn)行克隆測(cè)序。3.1擴(kuò)增目的基因應(yīng)用25μLDNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系,以毛白楊葉片cDNA為模板,加入2.5μL10×buffer,1.8μL25mmolL-1MgCl2,1μL10mmolL-1dNTP，TaqDNA聚合酶1.0U(以上試劑購自Promega公司),100nmolL-1引物各1μL(SEQIDNO.11-12)，加適量雙蒸水至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3分鐘，93℃變性30秒，58℃退火30s，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5分鐘。最終擴(kuò)增出長(zhǎng)約2500bp的cDNA片段。3.2PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，回收、純化目的片段后連接于pGEM-T上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)合利用MEGA6.0和DnaSP5.10軟件分析毛白楊PetC基因的43個(gè)序列，標(biāo)出基因內(nèi)的突變位點(diǎn)，計(jì)算SNP頻率和在基因不同區(qū)域的分布模式。結(jié)果見表3，表3示出了毛白楊PetC基因的核苷酸多態(tài)性。最終發(fā)現(xiàn)毛白楊PetC基因內(nèi)共52個(gè)普通SNP位點(diǎn)(最小等位頻率≥5％)。表3基因不同區(qū)域SNP位點(diǎn)分布情況區(qū)域長(zhǎng)度(bp)多態(tài)性位點(diǎn)個(gè)數(shù)多態(tài)性百分比5′UTR13921.44外顯子224531.22內(nèi)含子2405102.47外顯子311810.85內(nèi)含子3655101.53內(nèi)含子417063.53外顯子510232.943'UTR436173.9毛白楊PetC基因2597522注：插入缺失的區(qū)域在計(jì)算時(shí)被排除(4)DNA提取和基因分型從毛白楊個(gè)體的葉片中提取基因組DNA，毛白楊總DNA提取按DNeasyPlantMiniKits(Qiagen,Inc.,Valencia,CA,USA)描述的方法進(jìn)行。基因分型采用鎖核酸(LNA)法(Koshkin等，TetrahedronLett.(1998)39,4381-4384)，設(shè)計(jì)特定的引物對(duì)普通SNP在435株個(gè)體進(jìn)行基因型分型，引物如表1中所示。(5)關(guān)聯(lián)分析：利用TASSEL5.0軟件對(duì)基因分型結(jié)果與13個(gè)毛白楊光合和生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。運(yùn)用混合線性模型(MLM)進(jìn)行分析，最終獲得與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能SNP標(biāo)記。在進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時(shí)，使用Q值和K值來減少假陽性關(guān)聯(lián)，Q值用來估算群體結(jié)構(gòu)，K值用來估算個(gè)體之間的親緣關(guān)系。Q值和K值分別使用STRUCTUREVERISON2.3軟件和SPAGeDi軟件計(jì)算。最后使用Qvalue軟件進(jìn)行假陽性檢驗(yàn)，選擇Q<0.05的與光合和生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能SNP標(biāo)記。關(guān)聯(lián)結(jié)果見表4，表4示出了毛白楊PetC基因內(nèi)與光合和生長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)的SNP分子標(biāo)記。最終獲得3個(gè)SNP標(biāo)記與光合和生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)，分別位于毛白楊PetC基因的3’UTR和外顯子，解釋表型變異率為12.04％到19.46％。獲得的3個(gè)功能SNP標(biāo)記不同基因型對(duì)應(yīng)的表型平均值見表5。位于毛白楊PetC基因2068bp的SNPchr19_18617980與鐵氧還蛋白含量顯著關(guān)聯(lián)，AA基因型對(duì)于的鐵氧還蛋白均值為三種基因型中最高；位于毛白楊PetC基因2347bp的SNPchr19_18617701與胸徑和材積顯著關(guān)聯(lián)，AG基因型對(duì)應(yīng)的這兩種表型均值均為三種基因型中最高；位于毛白楊PetC基因2457bp的SNPchr19_18617591與鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性顯著關(guān)聯(lián)，CC基因型對(duì)應(yīng)的鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性最高。因此我們可以根據(jù)實(shí)際需要來選擇合適的功能SNP標(biāo)記來篩選具有目的表型的個(gè)體。圖1示出了毛白楊PetC基因與楊樹光合和生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能SNP標(biāo)記在基因中的位置。表4SNP位點(diǎn)對(duì)光合與生長(zhǎng)性狀的貢獻(xiàn)表5SNP位點(diǎn)的基因型效應(yīng)本發(fā)明上述使用的試劑均可包含在篩選楊樹光合和生長(zhǎng)性狀的試劑盒中。從以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明的毛白楊PetC基因內(nèi)與楊樹光合和生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)的3個(gè)功能SNP標(biāo)記，可以在楊樹生長(zhǎng)的早期就能夠高效、準(zhǔn)確地鑒定出光合能力強(qiáng)和生長(zhǎng)快的單株，從而大大加速育種進(jìn)程，縮短選育周期。同時(shí)，也為研究PetC基因的功能機(jī)制和此基因在林木育種中的應(yīng)用提供了重要的理論研究基礎(chǔ)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>北京林業(yè)大學(xué)<120>一組SNP位點(diǎn)在篩選光合作用強(qiáng)、生長(zhǎng)快性狀毛白楊中的應(yīng)用及試劑盒<130>2016<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>1acacttctttaaaatcaacaaccag25<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2cgacacgtcagtaaccgt18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3cgacacgtcagtaaccgc18<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>4tgtgatgcttgacaatctattcttt25<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5tgtgatgcttgacaatctattcttc25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6acggttaactagttatcataggaat25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7tgtgatgcttgacaatctattcttt25<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>8tggttaactagttatcataggaatga26<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>9cggttaactagttatcataggaatga26<210>10<211>2597<212>DNA<213>人工序列<400>10tcgtgtggcaccaatgaagctaatgtgccttatctagtacagttgtggtcgttatagttt60taacagtcctctcgcatcaccaaatcattcataataccatcaaagtgtactcagtttcct120gtccaagaatcatcaatccatggcttcctctacgctctcccctgccactccctcacaggt180aaagaaaaagaaaaaaccccaacaaacattgattattcttgaacttaatttccttctctt240tgatgatttggattgaattatgtgtttttgttttgtgtattagctatgctctagcaagag300tggcatgttctctcctacacaggcggtgtttgtgaaagcaacaaggacaaatatggtgtt360aaaggagagaggaatgagaattacatgccaggctacaagtgttcctgctgatgataaagt420gcctgacatgggtaagagggagcttatgaatctgcttcttttgggtgctctttcactccc480cactgctggcatgttggttccttacacctatttctttgtcccttctgggtaagaaatctt540cttcttcttcttcaaatttagtttggttttttcctttattatagattttttttttgttaa600tttccccttgcttcgttataggttcttcaatggaaattttgattctctaaagggcattct660ttctaaaattccactaatgatgtgtcatagctaaaatcaacttgagaagtaaagaataca720aaaattccgatgctgtgtttaagtttataaattatttcttcgagattgaccttgcttgct780aagttctaaattgcctcgtatatacaattgctatagtttatttgtttagggattaaattt840ctggccattagcaaccatagcatgcctgcatttcgttgggacgttgctaaatacaaatta900cttttccttgctgtaattggaaaaatttatcaggctcggaggaggtggtggtggcaccgt960tgccaaggatgcccttggaaatgatatcattgcagagcaatggcttaagactcatggccc1020tggtgaccgaaccctttctcaaggattaaaggtactggcagctttcctttcctttcttaa1080agaacatgttttccattgcatttccctttcttattgtataaattcgttgtccactgattg1140gtcattagaaggagtacatttatcgctgttttgatgcaagataatcatattttctgttta1200ttaacttgtcagaaagtattacacctttggttctaattttctttcaagttcttattagaa1260gtgggtcatgcattgtaagagatgttggcttggatccaatcattgctgtgatgctgtctt1320gctctagcgtaaaacagagctcgttatatgtttgcacttgagccagtgagatatttgtga1380aattgctgtcacacttctacacggggtagtatcgctgtaagcagacctataaaatgttgc1440aaactaaatcaatttttgttccttgtgaaaagaatctgtggaaattgtctaaaatggtga1500gaaaattagtgttgtttcatatttaggattttcaatatcatatcttcaaaaattttttga1560ggatctattttaacaaaactgatattacttgcaagaacacaatcatgcggcgctcaaaga1620ttgatttctatcaacttcggatactctgaaataatttgcaatactgaaaagtgaaaatca1680tttggattgttttttatggatttcagggagatccaacctaccttgttgtggagaaagata1740gagttcttgcaacttatggaattaatgcagtctgcacacaccttgggtgtgtcgtgccct1800ggaatcaagctgagaagaagttcatctgcccctgccatggatcacagtacaatgaccaag1860gaagagttgtccgaggacctgctcctctggtaagtcaaacataactttccttttatttct1920tggtggattactctattttagatgaataaaagaacaacaacacttctttaaaatcaacaa1980ccagcaacagtttgcttgctctaacgatttttgagttctccctggcaataaccgccttca2040atatgactttgctgtgcagtcattggcgctggctcactgcgacgtagacgacggcaaggt2100ggtcttcgttccatgggtcgaaacagacttcagaaccggagatgctccatggtggtctta2160agcctcttgttcaatcaatcatcaaatgtttcatatattcaagacacgaatcggtttgtt2220ttgcaacaatgccaaaacatccttttgtcatagaggcatgctatgtgaattggagctcat2280aagatgtaaggataaccatatgatttaagcatggatattcttgtgatgcttgacaatcta2340ttctttgtacctaaattctattgcattatcatttatgtccgtagccatggagcaatggca2400accatacatgttatttgtagctgccatacatgccaattgatcaatagtatccttactgtt2460ttcaaatctaggagatcaaatctatcccgcaataacatttataagtcaggaattctaatc2520ctgttagctcttgtttagaacttctactgtaactttgaaaaacaaatcccttatcaaaat2580taataacaacaataata2597<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11tcgtgtggcaccaatgaagc20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12gtagaagttctaaacaagagc21當(dāng)前第1頁1 2 3