本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胡蘿卜軟腐歐文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

軟腐歐文氏菌是一種廣泛的致病菌，主要發(fā)生在大白菜、卷心菜、菜花、馬鈴薯等作物上，主要為害葉、莖及塊莖。葉染病近地面老葉先發(fā)病，病部呈不規(guī)則暗褐色病斑，濕度大時腐爛。近些年來，由于多方面的原因，重大病害出現(xiàn)的頻率和面積明顯增加，造成的產(chǎn)量損失都在50-60%左右。而這些蔬菜是我國北方地區(qū)不可缺少的重要蔬菜，但每年因病害的損失估計可達數(shù)十億元。為了對付嚴(yán)重的這些蔬菜軟腐病害，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者大量使用化學(xué)農(nóng)藥。化學(xué)農(nóng)藥的施用也確實對蔬菜病害的控制做出了巨大的貢獻。但是，化學(xué)農(nóng)藥的大量施用也正在顯示著嚴(yán)重的負面影響。因此，隨著生物防治、綠色農(nóng)業(yè)等呼聲日益高漲，植物抗病免疫技術(shù)的研究成為近年興起的重要研究領(lǐng)域。

植物免疫抗病激活劑是一些生物和非生物因子，能夠誘導(dǎo)植物獨特的生理狀態(tài)，植物能夠更好或更快或者既好又快的調(diào)配防衛(wèi)反應(yīng)的生理狀態(tài)，使植物防御病蟲害的狀態(tài)處在臨界，達到一觸即發(fā)，當(dāng)病害在侵染植物時，植物會在短時間內(nèi)借助于誘導(dǎo)因子激發(fā)植物整體的抗性水平，調(diào)動整個植物的免疫能力，激活植物自身抗病相關(guān)基因的表達，抵抗病原物的侵染，自身不對病原菌起作用，不會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，用量低、高效、誘導(dǎo)的植物抗病譜廣、抗病持續(xù)時間長，這對于植物病害的可持續(xù)控制具有重要的意義。

目前利用植物免疫激活劑生物防治蔬菜病害的研究相對較少，因此，迫切需要篩選出一種能夠高效分泌植物蛋白激活劑的微生物菌株，從而通過植物免疫激活劑降低軟腐歐文氏菌給蔬菜生產(chǎn)帶來的危害。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服目前利用化學(xué)農(nóng)藥防治十字花科植物軟腐病帶來的環(huán)境危害，提供一種能夠防治軟腐病害，尤其是能夠高效拮抗大白菜軟腐病害的植物免疫蛋白激發(fā)子，并且本發(fā)明還提供了一種分泌上述植物免疫激活蛋白的生物菌株，并提供其能夠表達該蛋白的基因序列和蛋白質(zhì)序列，本發(fā)明還提供工程菌構(gòu)建獲得免疫激活蛋白。

為了達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明所述的胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovora pv. Carotovora strain Ecc 36（簡稱Ecc36）于2015年11月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為：CGMCC No. 11751。

進一步的，本發(fā)明所述的Ecc36能夠分泌植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR，該蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。

進一步的，本發(fā)明所述的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR能引起植物對病原菌的拮抗作用。

進一步的，本發(fā)明所述的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR表達基因hrpNecc36的序列如SEQ ID NO:2所示。

進一步的，本發(fā)明還提供所述的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR的制備方法為：將所述胡蘿卜軟腐歐文氏菌Ecc 36發(fā)酵液離心收集菌體，用發(fā)酵液1/2倍質(zhì)量的無菌水懸浮，將懸浮液煮沸30分鐘，9000rpm離心30分鐘，收集上清，冷凍干燥，獲得所述植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR粗品，其中蛋白含量不低于43%。

進一步的，上述制備方法的具體步驟為：將所述胡蘿卜軟腐歐文氏菌Ecc36菌株在LB固體培養(yǎng)基上采用劃線法，25℃培養(yǎng)24小時，獲得單菌落，挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，于25℃過夜培養(yǎng)，獲得Ecc36菌株種子，然后以10%接種于液體LB培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48小時，9000rpm離心30分鐘，收集菌體，加入原培養(yǎng)基1/2倍的無菌水懸浮，將其懸浮液煮沸30分鐘，9000rpm離心30分鐘，收集上清，冷凍干燥，獲得所述植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR粗品。

進一步的，本發(fā)明還提供所述的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR在制備用于防治植物軟腐病生物制劑中的應(yīng)用。

進一步的，所述防治植物軟腐病生物制劑中植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR的含量為18-100mg/L。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR可以有效抑制歐文氏菌所致的十字花科植物尤其是大白菜軟腐病害，具有高效的防治作用，有效率可以達到60%以上。作為生物介入手段，可以避免化學(xué)品如農(nóng)藥引起的殘留和污染，是一種更經(jīng)濟、環(huán)保、綠色的植物病害防治手段。

本發(fā)明的植物免疫激活蛋白HrpN_EccPR可以制成多種生物制劑，或作為有效成分添加到現(xiàn)有生物菌劑中，可適應(yīng)多種保存環(huán)境，并具有較長的保質(zhì)期，在常溫常壓下，可保存1-3年，利于倉儲和運輸。

生物樣品保藏信息

胡蘿卜軟腐歐文氏菌Ecc36，分類命名為Erwinia carotovora pv.Carotovora，已于2015年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，菌種保藏號為CGMCC No.11751。

附圖說明

圖1為 36號菌株對煙草形成壞死斑；

圖2為歐文氏菌Ecc36致病性測定結(jié)果；

圖3為歐文氏菌Ecc36水解酶測定結(jié)果；

圖4為歐文氏菌Ecc36在固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時的菌落形態(tài)；

圖5為激活蛋白HrpN_EccPR粗品活力檢測結(jié)果；

圖6為目的基因（hrpNecc36）的陽性克隆結(jié)果。

具體實施方式

實施例1 具有激活植物免疫抗病作用的菌株分離和篩選

采集大白菜發(fā)病嚴(yán)重地塊中腐爛的大白菜作為試驗材料，在實驗室內(nèi)從該樣品中進行細菌分離，在LB培養(yǎng)基上進行多次分離純化，得到純培養(yǎng)菌落后，進行菌株鑒定。

具體步驟：上述土壤樣品來自河北省、山東、山西等地的染有大白菜腐爛病的大白菜田中，將該樣品經(jīng)梯度稀釋后涂布于LB培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基根據(jù)“微生物培養(yǎng)基手冊”的記載制備得到，培養(yǎng)基配方為：牛肉膏5g ，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，自來水1000ml，pH7.2~7.4，121℃滅菌20min后使用。待平板長出菌落后，挑取不同形態(tài)的單菌落采用劃線分離法反復(fù)進行分離純化，直到得到單菌落的純培養(yǎng)物，純化后的菌株保存于LB培養(yǎng)基斜面。

將上述篩選得到的單菌落分別培養(yǎng)，然后分別接種于煙草葉片，以水為陰性對照，以HrpN蛋白為陽性對照，在溫度為25℃、濕度為50%情況下，正常培養(yǎng)接菌的煙草3天，然后挑選能使接種煙草葉片形成壞死斑的菌株，由于具有激活植物免疫抗病作用的菌株能使植物葉片產(chǎn)生抗性而形成壞死斑，根據(jù)壞死斑的大小來篩選具有最強激活植物免疫抗病作用的菌株，發(fā)現(xiàn)第36號菌株具有這些特征（圖1）。并對該菌株進行了保藏，保藏號為CGMCC No.11751。

實施例2 具有激活植物免疫抗病作用的36號菌株毒性測試

將分離的36號菌株在LB液體培養(yǎng)基中活化，25℃培養(yǎng)24h，制成菌懸液。將健康的白菜葉片用酒精棉表面消毒3次后，以無菌水沖洗3次，用滅菌接種針在每個健康的白菜葉片上針刺5孔，之后在每孔中加入LB液體菌懸液2mL，每個處理設(shè)3次重復(fù)，以加入無菌的LB培養(yǎng)基為對照。將處理過的白菜葉放入白色培養(yǎng)盆中，用保鮮膜覆蓋盆口保濕，置于恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)，24h后觀察發(fā)病情況并比較是否與田間發(fā)病癥狀一致（圖2）。

將分離的36號菌株接種到含0.5%蔗糖的微鹽培養(yǎng)基，25℃搖瓶培養(yǎng)至OD600=2.5，離心(4℃，10000 r/min，10min)收集上清液，取30 μL 接到半定量酶活性檢測平板，25℃培養(yǎng)。分別于18 h 后檢測多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase, Peh)、果膠酶(Pectate lyase,Pel)及纖維素酶(Cellulase，Cel)活性，30 h后檢測蛋白酶(Protease, Prt)活性。胞外酶分析平板上菌落周圍透明圈大小反映其酶活性水平高低（圖3）。

毒性檢測實驗證明分離的36號菌株具有胡蘿卜軟腐歐文氏菌特征，初步判斷為胡蘿卜軟腐歐文氏菌。

實施例3 拮抗菌株的鑒定

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中記載的實驗內(nèi)容和實驗方法，對篩得的保藏號為：CGMCC No.11751進行鑒定，挑取篩選的軟腐病菌株的培養(yǎng)物，劃線培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h后肉眼觀察菌落形態(tài)并拍照。挑取軟腐病菌的菌落進行涂片染色，4×100倍顯微鏡下觀察其菌體特征。

菌落形態(tài)觀測是在LB培養(yǎng)基上進行的，將菌株劃線接種后，于25℃恒溫培養(yǎng)24 小時觀察菌落形態(tài)。保藏號為CGMCC No. 11751的菌株的菌落圓形或不規(guī)則、稍凸起、呈灰白色、有光澤、半透明、表面光滑，與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密（圖4）。挑取培養(yǎng)24 小時菌苔革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡的100倍油鏡下觀察。在顯微鏡下可以看到，保藏號為CGMCC No. 11751的菌株為桿狀細菌，該菌為革蘭氏陰性，菌體兩端鈍圓、呈短桿狀，大?。?.4-0.7）mm×（1.0-1.8）mm。

16SrDNA鑒定：將保藏號為CGMCC No. 11751菌株接種到LB培養(yǎng)基中，25℃搖床培養(yǎng)過夜，5000rpm離心獲得菌體，利用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取軟腐病菌株的基因組DNA。以提取的DNA 作為模板，以引物fD1 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'、 引物rp 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3'引物對進行PCR擴增。PCR 的反應(yīng)體系配制為(50μL)：10× Buffer 5μL，10mmol/L dNTP 4μL， rTaq 1μL，模板 2μL，引物1 和引物2 各1μL，滅菌雙蒸水36μL。PCR 擴增的條件是：94℃初始變性5min；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，檢測擴增序列大小，將正確的PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測序后，將獲得的DNA序列（SEQ ID NO:3），輸入GenBank，用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進行比較分析。利用MEGA4.1進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。經(jīng)過序列分析顯示，保藏號為CGMCC No. 11751的菌株屬于胡蘿卜軟腐歐文氏菌。命名為 Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 36（簡稱Ecc36）。

實施例4 Ecc36-5的遺傳穩(wěn)定性

對篩選出的拮抗作用Ecc36菌株在LB培養(yǎng)基上采用劃線法進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)15代后，采用接種煙草葉片方法檢測其對植物誘導(dǎo)抗性的效果，以原始菌株為對照，該拮抗菌株經(jīng)過15代培養(yǎng)后與原始菌株具有相同的拮抗作用，說明該Ecc36菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，將抑菌效果穩(wěn)定的Ecc36菌株進行LB培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，吸取菌液進行-80℃甘油保存。

實施例5 激活蛋白HrpN_EccPR粗品的獲得

將Ecc36（保藏號為CGMCC No. 11751）菌株在LB固體培養(yǎng)基上采用劃線法，25℃培養(yǎng)24小時，獲得單菌落，挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，于25℃過夜培養(yǎng)，獲得Ecc36菌株種子，然后以10%接種于液體LB培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48小時，9000rpm離心30分鐘，收集菌體，加入原培養(yǎng)基1/2倍的無菌水懸浮，將其懸浮液煮沸30分鐘，9000rpm離心30分鐘，收集上清，冷凍干燥，獲得激活蛋白HrpN_EccPR粗品，其蛋白含量為43%。

實施例6 激活蛋白HrpN_EccPR粗品誘導(dǎo)植物抗性的活力檢測

將不同稀釋度的激活蛋白HrpN_EccPR粗品分別接種于煙草葉片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種12h后，各濃度處理均出現(xiàn)水漬狀壞死，72h后形成壞死斑（圖5）。隨著蛋白稀釋倍數(shù)的增大，其壞死斑面積變小，而滅菌水對照的葉片組織無壞死情況的出現(xiàn)，說明該激活蛋白HrpN_EccPR粗品具有很強的活性。

實施例7基因組文庫的篩選、基因擴增、克隆及測序

用EcoRⅠ消化Ecc36菌株染色體DNA，然后以地高辛標(biāo)記的菌株Ecc71的hrpN DNA 為探針進行Southern blotting。雜交條件：溫度65℃，雜交液6×SSC，5×Denhardt，5 g/L 十二烷基硫酸鈉(SDS)和100 μg/mL 變性鮭精DNA；漂洗溫度65℃，用2×SSC 漂洗30 min，再用1×SSC 和1 g/L SDS 漂洗30 min，最后用0.1×SSC和1 g/L SDS 漂洗30 min。從該文庫中篩選出3個陽性菌落（圖6），分別為34號克隆菌斑、63號克隆菌斑和89號克隆菌斑，之后選擇89號菌斑。

以Ecc71hrpN DNA序列為參考設(shè)計引物, 進行PCR 擴增。引物如下：hrpNEcc71-up: TGTGGATCCATGCTTAATTCTCTTGGTGGCGGAG；hrpN Ecc71-down: TGTAAGCTTTAG CTGGAGAGCTTCTTCAA CCC。PCR 反應(yīng)條件為94℃ 5 min; 94℃ 1 min, 55℃2 min, 72℃ 3 min, 進行25 個循環(huán)；72℃ 8 min。將PCR 產(chǎn)物純化, 經(jīng)BamHⅠ-HindⅢ酶切, 克隆到質(zhì)粒載體pET30(+)中，基因測序由大連寶生物科技公司完成。根據(jù)測序結(jié)果分析并確定hrpNecc36基因的開放閱讀框，分析基因結(jié)構(gòu)。該激活蛋白基因包括起始密碼和終止密碼在內(nèi)的開放閱讀框（ORF）共計1254bp，通過和其它hrpN基因編碼的堿基序列相比較，同源性達到86.6%（SEQ ID NO:2），根據(jù)該基因的來源將其命名為HrpN_EccPR基因。該基因基因編碼的蛋白由417個氨基酸殘基組成，分子量45.27kD，理論等電點5.73，序列中富含甘氨酸（G），該蛋白與其他HrpN蛋白的同源性達到43%（SEQ ID NO:1），尤其是C末端和N末端的同源性非常高，推測是其功能區(qū)域，這也和hrpN基因編碼的蛋白功能相一致。

實施例8-11激活蛋白HrpN_EccPR粗品防治田間大白菜軟腐病的應(yīng)用

將Ecc36-5（保藏號為CGMCC No. 11751）菌株接種到裝有1000mL PB液體培養(yǎng)基的3000mL三角瓶中，按照實施例5的方法制備激活蛋白HrpN_EccPR粗品，獲得蛋白含量為43%的激活蛋白HrpN_EccPR粗品。

在河北省泊頭市和邢臺縣兩個花生的主要種植區(qū)的大白菜軟腐病發(fā)病田中進行激活蛋白HrpN_EccPR粗品的田間試驗。將激活蛋白HrpN_EccPR粗品按照1:10000；1:30000；1:50000；1:60000比例進行稀釋，分別形成濃度為100mg/L；34mg/L；20mg/L；18mg/L的藥液，每畝地一次噴施50公斤藥液，共噴施2次，在大白菜移栽后15天噴施1次， 10天后噴施第二次，常規(guī)對照使用常規(guī)劑量的化學(xué)農(nóng)藥作為防治藥物，空白對照不施用防治藥物但施加與實施例組相同重量的水；每個處理3次重復(fù)，于大白菜收獲時調(diào)查大白菜軟腐病的發(fā)病情況和產(chǎn)量。

調(diào)查方法：

采用5點取樣法，每個點取10株白菜，記錄大白菜的腐爛程度。

大白菜的腐爛程度分級標(biāo)準(zhǔn)：

0級：大白菜完好，無被害病斑；1級：大白菜受害，有明顯的葉片病斑，但沒有整個葉片腐爛；2級：大白菜外層葉片完全腐爛，里層葉片完好；3級：大白菜外層葉片完全腐爛，里層葉片完全腐爛。統(tǒng)計大白菜各級被害數(shù)。

防效計算方法：

大白菜發(fā)病率=被害大白菜數(shù)/總大白菜數(shù)×100

病情指數(shù)=∑（被害大白菜×該被害大白菜級值）/（總大白菜數(shù)×最高級值）×100

防治效果（%）=（對照區(qū)病情指數(shù)—處理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù) ×100

防治效果如表1所示，在河北的泊頭市和邢臺市田間防病試驗表明對大白菜軟腐病的防治效果在60%以上。

表1 不同不同濃度的激活蛋白施用對大白菜軟腐病的防治效果

。

由表1結(jié)果顯示，使用激活蛋白HrpN_EccPR粗品可有效防治大白菜軟腐病，施用2次后，不同濃度激活蛋白HrpN_EccPR對大白菜軟腐病的防效均在60%以上，明顯高于化學(xué)農(nóng)藥的常規(guī)對照防治效果。

由上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明利用篩選出的保藏號為CGMCC No.11751的菌株產(chǎn)生的激活蛋白HrpN_EccPR粗品對大白菜軟腐病有良好的拮抗作用，其能夠有效防治大白菜軟腐病的發(fā)生。

以上僅為本發(fā)明的較佳實施方式，而非對其保護范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不需要付出創(chuàng)造性勞動的前提下對本發(fā)明做出的任何改進，均應(yīng)認為在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省科學(xué)院生物研究所

<120> 一種胡蘿卜軟腐歐文氏菌、其分泌的植物免疫激活蛋白及應(yīng)用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 417

<212> PRT

<213> 胡蘿卜軟腐歐文氏菌Ecc 36

<400> 1

Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Thr Ser Leu Gln Ile Thr Ile Ile

1 5 10 15

Ser Val Arg Gln Gly Glu Leu Phe His Cys Gln Ser Pro Gln Asn Gly

20 25 30

Glu Ala Leu Ser Gln Leu Cys Ser Gly Leu Gly Asp Ser Asp Ala Glu

35 40 45

Leu Gln Asn Ser Cys Arg Ile Ser Arg Pro Trp Ile Met Gly Ser Met

50 55 60

Met Phe Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Met Ala Gly Gly Leu Gly

65 70 75 80

Gly Ala Leu Gly Gly Leu Val Ser Ser Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly

85 90 95

Leu His Gly Ser Gly Leu Gly Gly Gly Leu Ala Gly Gly Leu Ser Ser

100 105 110

Arg Leu Gly Ser Gly Leu Gly Gly Ala Val Gly Cys Gly Leu Gly Gly

115 120 125

Ser Leu Arg Gly Gly Met Asn Ala Met Lys Ala Ser Leu Val Leu Gly

130 135 140

Ser Leu Leu Val Gly Val Leu Glu His Leu Met Gly Gly Gly Met Ser

145 150 155 160

Arg Trp Arg Val Gly Leu Phe Ala Ile Lys His Ala Ala Ser Leu Gly

165 170 175

Thr Ser Pro Tyr Met Gly Ser Phe His Asp Thr Trp Ser Ala Ile Ser

180 185 190

Gly Asn Gly Leu Ser Gln Ala Glu Arg Cys Val Ser Gly Leu Gln Leu

195 200 205

Arg Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Lys

210 215 220

Leu Cys Ser Thr Leu Gly Met Ala Val Gly Gln Lys Ala Gly Leu Gln

225 230 235 240

Arg Arg Ile Gln Arg Tyr Asn Phe Gly Ser Gln Arg Ser Ala Arg Leu

245 250 255

Glu Arg Arg Arg Gly Val Gln Pro Thr Glu Gln Ala Arg Trp Gly Trp

260 265 270

Phe Trp Ala Arg Lys Leu Val Cys Arg Ser Tyr Thr Thr Ser Ala Arg

275 280 285

Thr Ser Ala Ala Ala Pro Val Thr Ser Trp Ile Arg Lys Ile Gly Trp

290 295 300

Glu Trp Arg Lys Arg Leu Val Ser Met Asp Gln Tyr Pro Glu Leu Phe

305 310 315 320

Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gln Pro Val Trp Gln Thr Glu Gln Glu

325 330 335

Tyr Glu Arg Asn Val Leu Arg Pro Lys Arg Trp Thr Ser Ala Asn Gln

340 345 350

Leu Thr Met Glu Ser Thr Ile Gly Ser Met His Arg Phe Met Lys Ala

355 360 365

Val Gly Ile Arg Gln Glu Arg Trp Ala Cys Glu Tyr Pro Cys Lys Ser

370 375 380

Thr Ser Thr Leu Val Gly Thr Gly Arg Arg Phe Ala Gly Ile Asp Ala

385 390 395 400

Ala Ile Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Gln Lys Leu Ser

405 410 415

Ser

<210> 2

<211> 1254

<212> DNA

<213> 胡蘿卜軟腐歐文氏菌Ecc 36

<400> 2

atgcttaatt ctcttggtgg cggtacttct ttgcaaatca cgatcatcag cgtgcggcag 60

ggcgaattat ttcattgtca gtctccacaa aatggcgaag cgctctcgca gttgtgctct 120

gggttgggtg acagcgatgc agaattgcag aacagttgtc gcatatcacg accatggatt 180

atgggcagca tgatgttcgg tggtctcggt ggtctcggtg gtatggcagg cggtttgggc 240

ggtgcgctcg gtggtctggt aagtagtctg ggcggattag gtggcggcct tcatgggtcg 300

ggccttggtg gaggactggc aggtgggctc agcagtaggc ttgggagtgg tctaggcggc 360

gccgtcggct gtggtttagg cggttcgcta cgtggcggca tgaatgccat gaaggcatca 420

ttggtcttgg gcagcctgct cgttggcgtg ttggagcatc tgatgggtgg cggtatgtca 480

cgttggcgtg ttggcctgtt tgccattaag cacgctgcat cgctaggtac ttcgccgtat 540

atgggcagct ttcacgatac gtggtcggcg atttcaggca acggcctgag tcaggcagag 600

aggtgcgtct caggcttaca attgcgtaac aacggtctgc aaggcttgag cggcgcaggg 660

gcgttcaaca aactgtgtag cacgttaggg atggctgttg ggcaaaaagc tggtttgcag 720

cggcggattc agcgctacaa ttttgggtca caacggtctg caaggcttga gcggcgcagg 780

ggcgttcaac caactgagca agcacgttgg ggatggtttt gggctcggaa gctagtttgc 840

aggagctaca caacatcagc acgcacatcg gcagccgcac ccgttacttc gtggataagg 900

aagatcgggt gggaatggcg aaagagattg gtcagtatgg atcaatatcc tgaactcttc 960

aagccggaat accagaaaga tcagcctgtc tggcagacgg agcaagagta cgaacggaat 1020

gtcctcaggc caaagcggtg gacttcagca aaccagttga ctatggaatc gaccattggc 1080

agcatgcata gattcatgaa ggctgtcggc attcgccaag agcggtgggc gtgtgagtac 1140

ccgtgcaaat caacctcaac gctcgtcggt acaggccggc gcttcgctgg tattgatgcg 1200

gcgatcatcg gtgaccgtat cgtcaatatg gggctgcaga agctctccag ctaa 1254

<210> 3

<211> 1413

<212> DNA

<213> 胡蘿卜軟腐歐文氏菌Ecc 36

<400> 3

ggtgacgagc ggcggacggg tgagtaatgt ctgggaaact gcctgatgga gggggataac 60

tactggaaac ggtagctaat accgcataac gtcttcggac caaagagggg gaccttcggg 120

cctcttgcca tcagatgtgc ccagatggga ttagctrgta ggtgaggtaa tggctcacct 180

aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga tgaccagcca cactggaact gagacacggt 240

ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca 300

gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg ggttgtaaag cactttcagc ggggaggaag 360

gcggtgagat taatactctc atcgattgac gttacccgca gaagaagcac cggctaactc 420

cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta atcggaatga ctgggcgtaa 480

agcgcacgca ggcggtttgt taagtcagat gtgaaatccc cgagcttaac ttgggaactg 540

catttgaaac tggcaagcta gagtcttgta gaggggggta gaattccagg tgtagcggtg 600

aaatgcgtag agatctggag gaataccggt ggcgaaggcg gccccctgga caaagactga 660

cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgctgt 720

aaacgatgtc gatttggagg ttgtgccctt gaggcgtggc ttccggagct aacgcgttaa 780

atcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg 840

cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctactcttg 900

acatccagag aattcggtag agataccttg gtgccttcgg gaactgtgag acaggtgctg 960

catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1020

cttatccttt gttgccagcg gttcggccgg gaactcaaag gagactgcca gtgataaact 1080

ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cgagtagggc tacacacgtg 1140

ctacaatggc gtatacaaag agaagcgacc tcgcgagagc aagcggacct cataaagtac 1200

gtcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1260

tagatcagaa tgctacggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1320

tgggagtggg ttgcaaaaga agtaggtagc ttaaccttcg ggagggcgct taccactttg 1380

tgattcatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggt 1413