本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，尤其是一種緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板及其構建方法。
背景技術：
：肝衰竭是多種因素引起的嚴重肝臟損害，導致其合成、解毒、排泄和生物轉化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償，出現以凝血機制障礙和黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現的一組臨床癥候群。急性肝衰蝎是臨床亟待解決的治療難題。盡管內科綜合治療措施取得了較大進展，患者病死率依然高達50％-80％。肝移植可以顯著降低病死率，但因供體短缺，大多數患者在等待供肝的過程中死亡。因此生物人工肝與肝細胞移植等細胞水平的新治療方法得到了研究與發(fā)展，在大量動物實驗和一些臨床實驗中獲得良好效果，成為有前途的肝病治療途徑。實際上無論是肝細胞移植還是生物人工肝支持治療，其核心原材料都是肝細胞，對肝功能衰竭患者的治療作用幾乎完全依賴于所用肝細胞的生物學功能。人體中的絕大多數細胞生活在三維的環(huán)境中，細胞必須通過細胞-細胞以及細胞-細胞外基質之間的相互作用，獲得各種生化和機械信號，才能維持其正常的生理活動。大量研究表明，細胞與細胞外基質以及細胞與細胞之間的相互作用對于調控細胞的遷移、增殖和分化有重要的作用。一般使用的二維單層培養(yǎng)的細胞缺乏這樣的信號傳遞，不能很好地模擬體內細胞的微環(huán)境。相反，在三維的多細胞球中細胞與外部環(huán)境的相互作用可大部分得到重建，因此，和細胞單層相比，多細胞球能更好地模擬體內細胞的微環(huán)境。正因為此，多細胞球在基因及功能表達等很多方面更接近于正常人體細胞。通常的細胞培養(yǎng)有貼壁、懸浮兩種生長方式。懸浮生長限于少數幾類細胞,如白細胞、淋巴組織細胞以及腹水癌細胞等。大部分的細胞如肝細胞為貼壁生長,雖然肝細胞失去接觸抑制的特性,但是在普通培養(yǎng)條件下,細胞仍然以二維生長為主。因此，為實現肝細胞的三維生長,創(chuàng)造避免貼壁的生長條件是現階段亟待解決的技術問題。技術實現要素：本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板。本發(fā)明所要解決的另一技術問題在于提供上述緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板的構建方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是：一種緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板，是聚酸酐包載由海藻酸鈉保護的成纖維細胞生長因子(FGF)和肝細胞生長因子(HGF)所得到的，所述海藻酸鈉具有網狀結構，成纖維細胞生長因子(FGF)和肝細胞生長因子(HGF)嵌在該網狀結構的孔隙中。上述緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板中所述聚酸酐是一類新型的醫(yī)用高分子材料，具有生物降解特性。具有(Ⅰ)所示分子結構，據R基的不同，可將聚酸酐分為脂肪族聚酸酐、芳香族聚酸酐、雜環(huán)族聚酸酐、聚酰酸酐、聚酰胺酸酐、可交聯(lián)的酸酐、含磷聚酸酐等。優(yōu)選的，上述緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板，所述聚酸酐為芳香族聚酸酐P(CPP-SA)(聚酸酐〔聚1,3-雙(對羧基苯氧基)丙烷-癸二酸])，具有(Ⅱ)所示分子結構，優(yōu)選的，上述緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板，所述膜板中各成分的用量比按重量份數計為聚酸酐94.8-97.8份、海藻酸鈉0.5-2份、成纖維細胞生長因子0.01-0.1份和肝細胞生長因子0.01-0.1份。上述緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板的構建方法，具體步驟如下：(1)配置有機相：將聚酸酐〔聚1,3-雙(對羧基苯氧基)丙烷-癸二酸](P(CPP-SA))與表面活性劑雙十二烷基二甲基溴化銨(DDDA·Br)以20-40:1-1.5的質量比混合；室溫下溶于二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷體積比為1-2:1-5的混合溶液中，至聚酸酐完全溶解，得有機相溶液A備用；(2)配置水相：成纖維細胞生長因子(FGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成600ng/mLFGF多糖保護溶液；肝細胞生長因子(HGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成600ng/mLHGF多糖保護溶液；按體積比0.1-1:1-0.1將FGF多糖保護溶液和HGF多糖保護溶液進行混合，得水相溶液B備用；(3)有機相溶液A和水相溶液B按體積比20-50：1-2投放，在2℃-6℃水浴中，通風櫥內磁力攪拌下緩慢滴加水相溶液B到有機相溶液A中，30min后放入室溫下通風櫥內磁力攪拌8h,乳化后制得油包水微球乳液；(4)將乳化后制得的油包水微球乳液在室溫下，通風櫥內環(huán)境濕度為50％-70％的條件下澆鑄在干凈的玻璃皿基底上，待有機溶劑和水完全揮發(fā)后，得到有序的凹孔狀具有緩釋生長因子的多細胞球培養(yǎng)膜板。優(yōu)選的，上述緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板的構建方法，具體步驟如下：(1)配置有機相：將聚酸酐〔聚1,3-雙(對羧基苯氧基)丙烷-癸二酸](P(CPP-SA))與表面活性劑雙十二烷基二甲基溴化銨(DDDA·Br)以20:1的質量比混合；室溫下溶于二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷體積比為1:3的混合溶液中，至聚酸酐完全溶解，得有機相溶液A備用；(2)配置水相：成纖維細胞生長因子(FGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成600ng/mLFGF多糖保護溶液；肝細胞生長因子(HGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成600ng/mLHGF多糖保護溶液；按體積比1:1將FGF多糖保護溶液和HGF多糖保護溶液進行混合，得水相溶液B備用；(3)有機相溶液A和水相溶液B按體積比25：2投放，在4℃水浴中，通風櫥內磁力攪拌下緩慢滴加水相溶液B到有機相溶液A中，30min后放入室溫下通風櫥內磁力攪拌8h,乳化后制得油包水微球乳液；(4)將乳化后制得的油包水微球乳液在室溫下，通風櫥內環(huán)境濕度為65％的條件下澆鑄在干凈的玻璃皿基底上，待有機溶劑和水完全揮發(fā)后，得到有序的凹孔狀具有緩釋生長因子的多細胞球培養(yǎng)膜板。本發(fā)明的有益效果是：上述緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板，利用聚酸酐對生物體具有良好的生物相容性，特別是聚酸酐降解過程具有表面溶蝕性，首次以具有表面溶蝕性能的聚酸酐為模板材料，包載經海藻酸鈉保護的細胞生長因子，利用乳化、溶劑揮發(fā)技術制備出具有凹槽空間(孔徑5μm-100μm)、而且緩慢釋放細胞因子的三維多細胞球培養(yǎng)膜板。不同于現有技術中聚酸酐包載生長因子，本發(fā)明采用聚酸酐制備細胞培養(yǎng)模板，而使用海藻酸鈉包載生長因子后制備凹槽，用于細胞培養(yǎng)。通過對多孔膜板制備、影響因素、細胞因子釋放、體外細胞毒性試驗等研究，證明所述多細胞球培養(yǎng)膜板具有適宜多細胞球立體培養(yǎng)的凹槽空間，可以緩慢釋放活性細胞因子，無細胞毒性，可以促進細胞三維增殖培養(yǎng)，為進一步多細胞球立體培養(yǎng)研究奠定了基礎。附圖說明圖1是多細胞球培養(yǎng)膜板結構放大圖；圖2為緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板紅外光譜圖(IR)；圖3是緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板掃描電鏡圖，可以看到在多細胞球培養(yǎng)膜板中存在著有序的周期性結構，形成孔洞比較均一的凹槽狀，約為12μm左右，孔洞呈單層排布，孔深約為2.8μm左右，孔洞和玻璃皿基底之間也存在一層較薄的聚酸酐層面；圖4是聚酸酐濃度0.2mg/ml掃描電鏡；圖5是聚酸酐濃度0.8mg/ml掃描電鏡；圖6是聚酸酐濃度3.2mg/ml掃描電鏡；圖7是DMF-CH2CL2(1：3)溶劑凹孔狀膜板掃描電鏡；圖8是DMF-CHCL3(1：3)溶劑凹孔狀膜板掃描電鏡；圖9是濕度為20％時凹孔狀膜板掃描電鏡；圖10是濕度為40％時凹孔狀膜板掃描電鏡；圖11是濕度為60％時凹孔狀膜板掃描電鏡；圖12是多細胞球培養(yǎng)膜板緩釋FGF生長因子曲線；圖13是多細胞球培養(yǎng)膜板緩釋HGF生長因子曲線。圖14是多細胞球培養(yǎng)膜板體外累積釋放FGF曲線和HGF曲線,A:緩釋FGF生長因子曲線；B:緩釋HGF生長因子曲線。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明所述技術方案作進一步的說明。下述實施例所用儀器與材料為：聚酸酐〔聚1,3-雙(對羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]P(CPP-SA))(Wcpp:Wsa＝75：25)：GCP相對分子質量測定：P(CPP-SA)聚酸酐的重均相對分子質量Mw≥20000。天津市第三中心醫(yī)院肝膽疾病研究所研制，制備方法見文獻[于美麗聚酸酐-比柔比星控釋植入劑的研究及應用[J].生物醫(yī)學工程學雜志2002；19(2)：69-79；于美麗抗膀胱癌納米控釋植入劑的制備及動物實驗研究[J].中華臨床雜志2002；2(10):41-43]；雙十二烷基二甲基溴化銨(DDDA·Br)購于SIGMA-ALDRICH，美國；二甲基甲酰胺(DMF)分析純、二氯甲烷分析純(含水量≤0.05％)、三氯甲烷分析純(含水量≤0.02％)、海藻酸鈉分析純購自天津市基準化學試劑有限公司；成纖維細胞生長因子fibroblastgrowthfactor,(FGF)、肝細胞生長因子Hepatocytegrowthfactor(HGF)購自天津市聯(lián)星生物技術有限公司；成纖維細胞生長因子(FGF)檢測試劑盒、人肝細胞生長因子定量測定(HGF)ELISA試劑盒購自上海裕平生物科技有限公司。NCTCclone929(小鼠成纖維細胞L-929)中國食品藥品檢定研究院。離心機Eppendorff德國，真空干燥機Yamato日本，掃描電鏡Phenom，FEICompany，美國，酶標儀(芬蘭雷勃公司，MK3)。實施例1緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板結構表征配置有機相：將400mg聚酸酐P(CPP-SA)與20mg雙十二烷基二甲基溴化銨(DDDA·Br)室溫下溶于500ml二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷體積比為1:3的混合溶液中，使聚酸酐完全溶解，聚酸酐濃度為0.8mg/ml,DDDA·Br濃度為0.04mg/ml。配置水相：成纖維細胞生長因子(FGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成20ml濃度為600ng/mLFGF海藻酸鈉保護溶液。肝細胞生長因子(HGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成20ml600ng/mLHGF海藻酸鈉保護溶液。按體積比1：1混合FGF海藻酸鈉保護溶液和HGF海藻酸鈉保護溶液40ml。在4℃水浴中，通風櫥內磁力攪拌下緩慢滴加水相溶液到有機相溶液中，有機相溶液和水相溶液的體積比25：2，30min后放入室溫下通風櫥內磁力攪拌8h,乳化后制得油包水微球乳液；將制備的乳化后制得油包水微球乳液在室溫下，通風櫥內環(huán)境濕度為65％的條件下(溫度25℃)澆鑄在干凈的玻璃皿基底上，待有機溶劑和水完全揮發(fā)后，得到有序的凹孔狀具有緩釋生長因子的多細胞球培養(yǎng)膜板，將所制備的緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板進行預處理干燥后噴金，進行掃描電鏡分析，觀察多孔膜板結構，如圖1所示。實施例2緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板的構建A.有機相配置：將聚酸酐〔聚1,3-雙(對羧基苯氧基)丙烷-癸二酸](P(CPP-SA))與表面活性劑雙十二烷基二甲基溴化銨(DDDA·Br)以40:1.5的質量比混合；室溫下溶于二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷體積比為1:1的混合溶液中，至聚酸酐完全溶解，得有機相溶液A備用；B.水相配置：成纖維細胞生長因子(FGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成600ng/mLFGF多糖保護溶液；肝細胞生長因子(HGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成600ng/mLHGF多糖保護溶液；按體積比0.1:1混合FGF多糖保護溶液和HGF多糖保護溶液，得水相溶液B備用；C.有機相溶液A和水相溶液B按體積比20：1投放，在4℃水浴中，通風櫥內磁力攪拌下緩慢滴加水相溶液B到有機相溶液A中，30min后放入室溫下通風櫥內磁力攪拌8h,乳化后制得油包水微球乳液；D.將乳化后制得的油包水微球乳液在室溫下，通風櫥內環(huán)境濕度為50％的條件下澆鑄在干凈的玻璃皿基底上，待有機溶劑和水完全揮發(fā)后，得到有序的凹孔狀具有緩釋生長因子的多細胞球培養(yǎng)膜板。實施例3緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板的構建A.有機相配置：將聚酸酐〔聚1,3-雙(對羧基苯氧基)丙烷-癸二酸](P(CPP-SA))與表面活性劑雙十二烷基二甲基溴化銨(DDDA·Br)以30:1的質量比混合；室溫下溶于二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷體積比為2：5的混合溶液中，至聚酸酐完全溶解，得有機相溶液A備用；B.水相配置：成纖維細胞生長因子(FGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成600ng/mLFGF多糖保護溶液；肝細胞生長因子(HGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成600ng/mLHGF多糖保護溶液；按體積比1:0.1混合FGF多糖保護溶液和HGF多糖保護溶液，得水相溶液B備用；C.有機相溶液A和水相溶液B按體積比50：2投放，在4℃水浴中，通風櫥內磁力攪拌下緩慢滴加水相溶液B到有機相溶液A中，30min后放入室溫下通風櫥內磁力攪拌8h,乳化后制得油包水微球乳液；D.將乳化后制得的油包水微球乳液在室溫下，通風櫥內環(huán)境濕度為60％的條件下澆鑄在干凈的玻璃皿基底上，待有機溶劑和水完全揮發(fā)后，得到有序的凹孔狀具有緩釋生長因子的多細胞球培養(yǎng)膜板。實施例4配置0.2mg/ml、0.8mg/ml、3.2mg/ml濃度聚酸酐觀察凹孔狀膜板的形貌變化。溶劑的選擇對于凹孔狀膜板的形貌和柔韌度起到了很大的作用，實驗選擇二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷體積比1:3混合物、二甲基甲酰胺(DMF)和三氯甲烷體積比1:3混合物，進行了多細胞球培養(yǎng)膜板的比較研究。一定的濕度條件是制備凹孔狀膜板的先決條件，實驗利用飽和氯化鈉溶液控制環(huán)境濕度，濕度50％-75％條件下控制所成凹孔狀膜板孔徑的大小。1.多細胞球培養(yǎng)膜板緩釋FGF和HGF生長因子測定多細胞球培養(yǎng)膜板是由聚酸酐包載海藻酸鈉保護的成纖維細胞生長因子(FGF)和肝細胞生長因子(HGF)組成，海藻酸鈉具有網狀結構，FGF和HGF嵌在網狀孔隙中可以保持良好的生物活性，聚酸酐具有表面溶蝕性，在細胞培養(yǎng)體系中可以緩慢釋放FGF和HGF。以PBS緩沖液100mL作為溶出介質，放入2x2cm2多細胞球培養(yǎng)膜板。溫度37±0.5℃。分別于各時間點(0d,2d,4d,6d,8d,10d,12d,14d,16d,18d,20d)取樣100μL。每次取樣后,立即補充同溫度的PBS緩沖液100μL。多細胞球培養(yǎng)膜板緩釋FGF測定：按照人成纖維細胞生長因子21(fgf-21)ELISA試劑盒說明書進行。多細胞球培養(yǎng)膜板緩釋HGF測定：按照人肝細胞生長因子定量測定(HGF)ELISA試劑盒檢測說明書檢測。2.多細胞球培養(yǎng)膜板體外細胞毒性試驗多細胞球培養(yǎng)膜板體外細胞毒性試驗依據GB/T16886.5-2003醫(yī)療器械生物學評價第5部分——體外細胞毒性試驗方法進行。采用四唑鹽(MTT)比色法，0.22μm濾器過濾的含10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液為浸提介質；樣品2.0g，加浸提介質10.0ml，37℃浸提24h后得到浸提原液；細胞株：NCTCclone929；浸提介質為空白對照，30cm2的高密度聚乙烯加入浸提介質5.0ml，置37℃，浸提24h為陰性對照，含5％二甲基亞砜的浸提介質為陽性對照。細胞懸液制備：將正常傳代培養(yǎng)的L-929細胞，經0.25％胰酶消化制成濃度為1×104/ml的細胞懸液，接種于96孔板，每孔200μl，每組6孔，置5％CO2培養(yǎng)箱內37℃培養(yǎng)24h。浸提液交換：細胞培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液，空白組用浸提介質交換，陰性對照組用浸提比例為6cm2/ml高密度聚乙烯浸提液交換，陽性對照組用含5％二甲基亞砜的浸提介質交換，試驗樣品組用浸提液進行交換。置5％CO2培養(yǎng)箱內37℃，培養(yǎng)72h。吸光度的測定：更換培養(yǎng)液后，取培養(yǎng)72h的孔板，每孔加入40μl5g/L四唑鹽(MTT)溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內液體，加入150μL二甲基亞砜，置振蕩器上振蕩10min，在酶標儀570nm和630nm處測定各孔吸光度。按下式計算相對增殖率(RGR)。A—樣品組(陰性、陽性組)吸光度A0—空白對照組吸光度細胞毒性評價等級級別相對增殖率％級別相對增殖率％0級≥1003級30～491級80～994級0～292級50～79結果如下：1.緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板IR光譜圖和掃描電鏡結果，見圖2、3。2.緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板影響因素3.聚酸酐溶液濃度的影響聚酸酐溶液濃度與所制成凹孔狀膜板的孔徑大小呈負相關。環(huán)境濕度為55％，二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷體積比為1:3的混合溶液為溶劑，聚酸酐濃度分別為0.2mg/ml、0.8mg/ml、3.2mg/ml制成凹孔狀膜板的SEM圖如下，分別為圖4-6，由SEM圖可觀察到隨著聚酸酐溶液濃度越大，所得到孔徑越小。這是由于隨著聚酸酐濃度增加，溶液粘度增大導致對流作用變弱，水分子間碰撞融合幾率變小，水分子周圍的聚酸酐濃度增大，相鄰水分子間融合速度減小，制得的凹孔狀膜板孔洞的尺寸也隨之變小。4.溶劑的影響溶劑的選擇對于凹孔狀膜板的形貌和柔韌度起到了很大的作用，實驗選擇二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷1:3混合物、二甲基甲酰胺(DMF)和三氯甲烷1:3混合物，進行了多細胞球培養(yǎng)膜板的比較研究。分別選擇二氯甲烷和三氯甲烷為溶劑所制備的凹孔狀膜板柔韌度差，為提高膜板柔韌度，實驗分別選擇二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷1:3混合物、二甲基甲酰胺(DMF)和三氯甲烷1:3混合物為溶劑，聚酸酐溶液濃度1.2mg/ml，環(huán)境濕度為55％，制成凹孔狀膜板的SEM如圖5和圖6。由于溶劑的沸點二氯甲烷低于三氯甲烷，用二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷1:3混合物制備的凹孔狀膜板孔洞(圖7)小于由二甲基甲酰胺(DMF)和三氯甲烷1:3混合物為溶劑的孔洞(圖8)，但孔洞的有序性高于二甲基甲酰胺(DMF)和三氯甲烷1:3混合物為溶劑的凹孔狀膜板?？锥吹挠行蛐砸约按笮〔町愂怯捎谌軇┑膿]發(fā)速度不同所導致的，而溶劑的揮發(fā)速度又取決于其分子量以及飽和蒸汽壓，通常情況下，溶劑的揮發(fā)速度隨其飽和蒸汽壓的降低而降低，因此，低飽和蒸汽壓的溶劑揮發(fā)的速度慢，相鄰水分子間有更多機會合并形成孔洞尺寸較大。較大尺寸孔洞會打亂水分子間原有的均勻排列，因此降低凹孔狀膜板孔洞的有序性。選擇具有合適揮發(fā)速度的溶劑對有序多孔膜的形成至關重要。5.濕度的影響二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷體積比為1:3的混合溶液為溶劑，聚酸酐濃度為1.2mg/ml，不同濕度對凹孔狀膜板結構形成以及有序性的影響，如圖9-11所示，在濕度為20％時凹孔狀膜板孔洞尺寸偏小，孔洞數目較少；在40％濕度下凹孔狀膜板孔洞尺寸變大且數目增多，形成較為有序的六方密堆積排列；在60％濕度凹孔狀膜板中有比較大孔洞存在，一致性稍差。這種現象是由于環(huán)境濕度小時，浮在液面上的微乳液中水滴揮發(fā)快，凹孔狀膜板孔洞較??；在45％濕度下，空氣中水分子會抵消揮發(fā)導致的損失，形成更大尺寸的孔洞；當在60％及以上的濕度時，大量的空氣中的水蒸氣由于有機溶劑揮發(fā)導致的溶液表面溫度降低而冷凝在液面上，使水分子聚集形成較大尺寸的孔洞。6.多細胞球培養(yǎng)膜板緩釋FGF和HGF生長因子根據多細胞球培養(yǎng)膜板各個時間點釋放液的吸光度值，分別經標準曲線得出FGF和HGF濃度,繪制出多細胞球培養(yǎng)膜板體外累積釋放FGF曲線和HGF曲線。結果顯示,20d的累積釋放率FGF達到55.7％,HGF達到48.2％(見圖12，圖13),由于聚酸酐具有表面溶蝕性，因此釋放初期基本無突釋。7.多細胞球培養(yǎng)膜板體外細胞毒性試驗結果72h陰性對照組RGR為98.8％，細胞毒性反應為1級；陽性對照組RGR為4.2％，細胞毒性反應為4級。試驗系統(tǒng)反應成立。多細胞球培養(yǎng)膜板浸提液細胞相對增殖率RGR為73.4％，細胞毒性反應為2級。綜上所述，本發(fā)明所述緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板的最優(yōu)化構建條件如下：聚酸酐〔聚1,3-雙(對羧基苯氧基)丙烷-癸二酸](P(CPP-SA))與表面活性劑雙十二烷基二甲基溴化銨(DDDA·Br)以20:1的質量比投料，成纖維細胞生長因子(FGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成600ng/mLFGF多糖保護溶液。肝細胞生長因子(HGF)溶于0.8％海藻酸鈉溶液中配成600ng/mLHGF多糖保護溶液。1:1混合FGF多糖保護溶液和HGF多糖保護溶液聚酸酐和1:1混合FGF多糖保護溶液和HGF多糖保護溶液按25:2體積比投放，溫度25℃，濕度65％。根據多細胞球培養(yǎng)膜板各個時間點釋放液的吸光度值，分別經標準曲線得出FGF和HGF濃度,繪制出多細胞球培養(yǎng)膜板體外累積釋放FGF曲線和HGF曲線。結果顯示,20d的累積釋放率FGF達到55.7％,HGF達到48.2％(見圖14),由于聚酸酐具有表面溶蝕性，因此釋放初期基本無突釋。上述參照實施例對該一種緩釋生長因子多細胞球培養(yǎng)膜板及其構建方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構思下的變化和修改，應屬本發(fā)明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3