本發(fā)明屬于器官體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種器官體外培養(yǎng)系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

每天全球成千上萬器官衰竭病人等待著器官移植，以延長生命，然而，器官的短缺是當(dāng)今世界面臨的一大難題。器官再生已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。器官再生是指通過器官移植和人工器官或者手術(shù)使功能障礙的器官發(fā)揮功能。由于用于移植的器官嚴(yán)重短缺，人造器官成為器官再生研究的重點(diǎn)，器官的體外培養(yǎng)成為研究的重中之重。在18世紀(jì)人們就開始了對器官培養(yǎng)的研究，《Organ culture》一書于1964年在巴黎以法語的形式出版，1970年J.Thomas重新修訂后以英文的形式重新出版，該書不斷的被修訂，增加最新的器官研究新進(jìn)展，對器官研究起了極大的推動作用。該書還介紹了一些器官培養(yǎng)的主要方法：1)凝固的血漿基質(zhì)培養(yǎng)法。最初是由Fell，H.B和Robison創(chuàng)立的，將器官碎片或者器官放置在覆蓋有凝固的血漿和雞胚浸出液的表面皿上培養(yǎng)¹。2)瓊脂基質(zhì)培養(yǎng)法。1952年E.Wolff等人在含有胚抽出液的瓊脂培養(yǎng)基上直接放置器官的方法進(jìn)行器官培養(yǎng)。3)漂浮法4)格柵培養(yǎng)法5)交替暴露于培養(yǎng)液和氣相培養(yǎng)法。人們不斷探索體外器官培養(yǎng)的方法和影響器官培養(yǎng)的因素，并取得顯著成就。早在19世紀(jì)60年代人們探索了人小腸體外培養(yǎng)的方法，并獲得了一些經(jīng)驗(yàn)。首先器官的培養(yǎng)通常用與體內(nèi)細(xì)胞生長相似的3D培養(yǎng)方法并且器官的體外培養(yǎng)還受到激素的調(diào)節(jié)；其次，氣體的組分也是影響器官培養(yǎng)的重要因素。細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，一般需要5％的CO₂濃度和95％的空氣，而器官對O₂的需求量則大大增加，在心臟³和小腸²培養(yǎng)過程中O₂的濃度達(dá)到90％以上。3D培養(yǎng)方法在人造器官中應(yīng)用廣泛，人造骨骼即是采用生骨細(xì)胞接種3D支架進(jìn)行骨骼的培養(yǎng)。細(xì)胞在體內(nèi)的3D生長環(huán)境和細(xì)胞在體外的2D培養(yǎng)相比，細(xì)胞在遷移、粘附、增殖和基因表達(dá)方面存在著很大的差異。已發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在3D培養(yǎng)和2D培養(yǎng)中蛋白的表達(dá)存在差異，3D培養(yǎng)能更精確地模擬正常細(xì)胞的形態(tài)、增殖和分化，所以3D培養(yǎng)更廣泛的應(yīng)用于組織工程器官的構(gòu)建。近來，含磁性氧化鐵的水凝膠已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的3D培養(yǎng)，細(xì)胞可以在懸浮在培養(yǎng)基和磁性物質(zhì)當(dāng)中，擺脫細(xì)胞因重力的作用而發(fā)生的聚集。3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于組織工程的構(gòu)建具有以下優(yōu)勢：1)3D細(xì)胞培養(yǎng)體系使細(xì)胞生長微環(huán)境的建立更加簡單；2)3D細(xì)胞培養(yǎng)體系更接近于體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境，細(xì)胞的生長分化更接近于體內(nèi)，從而使得工程組織器官的功能更接近正常器官；3)天然的三維支架材料在3D培養(yǎng)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，首先3D天然支架免疫原性低于非天然的合成支架，其次，3D天然支架通透性好，減少了氧氣不足的發(fā)生，給細(xì)胞的生存分化提供了基本的附著基質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種器官體外培養(yǎng)系統(tǒng)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種器官體外培養(yǎng)系統(tǒng)，包括：

一混合氣體罐，用以供應(yīng)器官培養(yǎng)所需要的氧氣和二氧化碳的混合氣體；

一培養(yǎng)基容器，其內(nèi)盛裝有培養(yǎng)基，并具有伸入培養(yǎng)基液面以下的一進(jìn)氣管、一出液管和一入液管，；

一一次性輸液管加熱裝置；

一器官培養(yǎng)套瓶，包括一外腔和一內(nèi)腔，外腔包裹內(nèi)腔以使內(nèi)腔內(nèi)保持恒定的37℃且與內(nèi)腔隔絕，內(nèi)腔內(nèi)具有二器官培養(yǎng)固定管，用以將脫細(xì)胞支架固定在內(nèi)腔中；

和一滴定泵；

混合氣體罐連通培養(yǎng)基容器的進(jìn)氣管，培養(yǎng)基容器的出液管通過輸液管和一次性輸液管加熱裝置與滴定泵的進(jìn)液端連通，一次性輸液管加熱裝置用以加熱流經(jīng)上述輸液管內(nèi)的培養(yǎng)基，滴定泵的出液端連通器官培養(yǎng)套瓶的一器官培養(yǎng)固定管，器官培養(yǎng)套瓶的另一器官培養(yǎng)固定管與培養(yǎng)基容器的入液管連通。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，還包括一恒溫浴槽，該恒溫浴槽連通器官培養(yǎng)套瓶的外腔，使得該外腔中充滿恒定的37℃的加熱液體。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述滴定泵為卡默爾多功能智能調(diào)速計量泵KSP-F01A。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明利用泵的工作原理，將泵引入培養(yǎng)系統(tǒng)，可以解決器官培養(yǎng)中培養(yǎng)基更換問題，使得培養(yǎng)的器官可以得到足夠的養(yǎng)分，利于其生長。

2、器官培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)不同，其需要更多的氣體供應(yīng)。本發(fā)明利用具有伸入培養(yǎng)基液面以下的一進(jìn)氣管、一出液管和一入液管的培養(yǎng)基容器解決了氣體供應(yīng)問題，使器官能夠在充足的氣體環(huán)境中發(fā)育。

3、本發(fā)明解決了采用培養(yǎng)基循環(huán)系統(tǒng)，使培養(yǎng)基在器官中循環(huán)流動，并可控制流動速度及流動時間，使器官得到足夠的養(yǎng)分。

4、對于解決37℃培養(yǎng)的器官的溫度條件，本發(fā)明采用37℃水浴泵循環(huán)流動，以保持培養(yǎng)瓶中溫度始終維持在37℃，使得細(xì)胞在此溫度下能夠在器官中增殖發(fā)育。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為處理中的心臟脫細(xì)胞支架，A為心臟脫細(xì)胞支架在PBS灌流液中的狀態(tài)照片；B為心臟脫細(xì)胞支架在DMEM培養(yǎng)基平衡中的狀態(tài)照片。

圖3為心臟脫細(xì)胞支架接種細(xì)胞的狀態(tài)照片。

圖4為心臟脫細(xì)胞支架的HE染色照片，其中A為接種細(xì)胞前的狀態(tài)；B為接種細(xì)胞后培養(yǎng)一周的狀態(tài)。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。

如圖1所示，一種器官體外培養(yǎng)系統(tǒng)，包括一混合氣體罐1、一培養(yǎng)基容器2、一一次性輸液管加熱裝置3、一器官培養(yǎng)套瓶4、一恒溫浴槽5和一滴定泵6。

混合氣體罐1，用以供應(yīng)器官培養(yǎng)所需要的氧氣和二氧化碳的混合氣體，其可以通過閥門調(diào)節(jié)混合氣體的進(jìn)氣量，保證培養(yǎng)基中氧氣的含量，從而通過培養(yǎng)基的供給保證器官在培養(yǎng)過程中供給氧氣充足；

培養(yǎng)基容器2，其內(nèi)盛裝有培養(yǎng)基，并具有伸入培養(yǎng)基液面以下的一進(jìn)氣管21、一出液管22和一入液管23，可以使含有飽和氣體的培養(yǎng)基循環(huán)利用；

一次性輸液管加熱裝置3，可選為輸液恒溫器或輸液加溫棒，可以恒溫加熱從培養(yǎng)基容器2中泵出的培養(yǎng)基，從而使進(jìn)入器官的培養(yǎng)基保持37℃的最佳溫度；

器官培養(yǎng)套瓶4，包括一外腔41和一內(nèi)腔42，外腔41包裹內(nèi)腔42以使內(nèi)腔42內(nèi)保持恒定的37℃且與內(nèi)腔42隔絕，內(nèi)腔42內(nèi)具有二器官培養(yǎng)固定管43，用以將脫細(xì)胞支架固定在內(nèi)腔42中；

恒溫浴槽5，連通器官培養(yǎng)套瓶4的外腔41，使得該外腔41中充滿恒定的37℃的加熱液體，為器官培養(yǎng)套瓶4中的器官提供最適環(huán)境溫度；

滴定泵6，優(yōu)選為卡默爾多功能智能調(diào)速計量泵KSP-F01A，可以持續(xù)定時定量的從培養(yǎng)基容器2中吸取培養(yǎng)基進(jìn)入器官培養(yǎng)套瓶4中，從而保證器官在營養(yǎng)充足的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；

混合氣體罐1連通培養(yǎng)基容器2的進(jìn)氣管21，培養(yǎng)基容器2的出液管22通過輸液管和一次性輸液管加熱裝置3與滴定泵6的進(jìn)液端連通，一次性輸液管加熱裝置3用以加熱流經(jīng)上述輸液管內(nèi)的培養(yǎng)基，滴定泵6的出液端連通器官培養(yǎng)套瓶4的一器官培養(yǎng)固定管43，器官培養(yǎng)套瓶4的另一器官培養(yǎng)固定管43與培養(yǎng)基容器2的入液管23連通。

用本發(fā)明培養(yǎng)大鼠心臟的過程如下：

1)大鼠心臟摘取后，置于器官培養(yǎng)套瓶4的內(nèi)腔42中，心臟的肺動脈與器官培養(yǎng)套瓶4的一器官培養(yǎng)固定管43連接并結(jié)扎結(jié)實(shí)，該器官培養(yǎng)固定管43為消化液或者培養(yǎng)基的流出口，主動脈弓與另一器官培養(yǎng)固定管43連接并結(jié)扎結(jié)實(shí)，該器官培養(yǎng)固定管43為消化液或者培養(yǎng)基的流入口。

2)將1％的SDS溶液置于培養(yǎng)基容器2中，打開滴定泵6，灌流500ml的1％的SDS，隨后灌流500ml的雙蒸水，接著灌流0.5％的Triton X-100溶液100ml，形成心臟脫細(xì)胞支架，再用1L的無菌PBS灌流，清洗平衡心臟脫細(xì)胞支架(如圖2A所示)。

3)用1L的DMEM平衡心臟脫細(xì)胞支架(如圖2B所示)。

4)打開混合氣體罐1，用95％的氧氣和5％的二氧化碳?xì)怏w通過軟管通入培養(yǎng)基容器2中的培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基氧氣飽和，再打開一次性輸液管加熱裝置3和恒溫浴槽5，使得培養(yǎng)基和心臟脫細(xì)胞支架溫度保持在37℃，在此環(huán)境下灌流200ml DMEM/FBS平衡心臟脫細(xì)胞支架，為細(xì)胞接種做準(zhǔn)備。

5)調(diào)節(jié)滴定泵6，使泵的速度為1分鐘注入500ul的DMEM心肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基。

6)準(zhǔn)備細(xì)胞1×10⁷個細(xì)胞，將細(xì)胞從連接主動脈弓的器官培養(yǎng)固定管43注射入心臟，繼續(xù)培養(yǎng)一周，即可看到細(xì)胞在心臟脫細(xì)胞支架上定植生長(如圖2至圖4所示，圖2A和B中的心臟脫細(xì)胞支架中無細(xì)胞存在，經(jīng)過器官培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)后，如圖3所示，眼觀可以看到心臟基質(zhì)變得不透明，有細(xì)胞存在于心臟脫細(xì)胞支架中，如圖4A所示，接種細(xì)胞前心臟脫細(xì)胞支架中無細(xì)胞存在，經(jīng)器官培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)后，如圖4B所示，有細(xì)胞在基質(zhì)中定植存在于心臟脫細(xì)胞支架)。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。