本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術領域，具體涉及到一種用于不需進行任何預處理的糖蜜原料中發(fā)酵的新型固定化酵母細胞。

背景技術：

乙醇作為一種重要的工業(yè)原料，廣泛用于食品、化工、醫(yī)藥、染料、國防等領域。同時，它還是一種可再生的清潔能源，作為燃料其燃燒值達到26900kJ/kg。

糖蜜作為制糖產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物之一，因其主要成分為糖類，為提高廢糖蜜生物質(zhì)資源的利用，將糖蜜作為碳源用于發(fā)酵過程已得到了廣泛的研究。除此之外，糖蜜中還含有較高的礦物質(zhì)離子Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cl^-等，還含有少量的蛋白質(zhì)以及硝酸鹽、酰胺類等物質(zhì)，可以作為部分無機鹽離子和氮源提供給細胞生長。但是，發(fā)現(xiàn)當乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)以廢糖蜜為碳源時，由于糖蜜中還含有其他有機酸，膠體，灰分等成分會嚴重影響游離細胞的活性，使得乙醇產(chǎn)率不高，為了達到更好的生產(chǎn)效果需要在糖蜜利用之前進行酸堿等過程的預處理，這就增加了生產(chǎn)的成本。

乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)存在嚴重的產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，當發(fā)酵液中乙醇濃度達到5％(v/v)時，就開始出現(xiàn)產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，而固定化細胞因為其具有可連續(xù)發(fā)酵，細胞成活率高，降低產(chǎn)物抑制和消耗等優(yōu)點，所以在發(fā)酵領域得到了廣泛的應用。目前細胞固定化的方法大致分為共價法、交聯(lián)法、吸附法和包埋法，其中凝膠包埋法是應用最廣泛的細胞固定化方法，常用的載體有聚丙烯酰胺凝膠，海藻酸鈉，海藻酸鈣，瓊脂糖，凝膠等。董江青等利用甘蔗塊作為酵母固定化的材料，在以廢糖蜜為碳源的發(fā)酵液中乙醇平均體積分數(shù)比游離酵母菌發(fā)酵提高了0.76％，但是其糖蜜經(jīng)過了硫酸銨和濃硫酸的預處理。Anuchit Rattanapan等利用一種絲繭作為固定化酵母的材料，在糖蜜中發(fā)酵得到的乙醇產(chǎn)量是游離菌的11.5％，最高乙醇濃度達到了52.8g/L。專利CN 102787143 A介紹了一種利用海藻酸錳凝膠代替海藻酸鈣來固定樹干畢赤酵母的方法，其方法提高了細胞耐磷酸鹽的能力，使用壽命增長，但其發(fā)酵過程用的是葡萄糖培養(yǎng)基。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種新型的固定化酵母細胞的方法，可以用于不經(jīng)任何預處理的糖蜜體系下乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)，并且固定化細胞發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量明顯高于游離菌發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量，菌體使用壽命增長，糖醇轉(zhuǎn)化率相對提高。

本發(fā)明采用的技術方案為：

一種廢糖蜜原料下固定化酵母細胞發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，包括如下步驟：

1)酵母細胞的固定化：將酵母細胞培養(yǎng)后稀釋制成菌懸液，與固定化載體均勻混合制備得到固定化酵母細胞，所述固定化載體為海藻酸鈉(SA)、聚乙二醇(PEG)，與活性炭的混合液；

2)將步驟1)制備得到的固定化酵母細胞進行增值培養(yǎng)，然后移入發(fā)酵培養(yǎng)基中，以廢糖蜜為碳源發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。

所述菌懸液與固定化載體的體積比可以在1:(2.5～5)之間，優(yōu)選為1:4。

所述固定化載體為2-6％(w/w)的海藻酸鈉，4-8％(w/w)的聚乙二醇，0.5-2％(w/w)活性炭的混合液。進一步優(yōu)選固定化載體為3-5％(w/w)的海藻酸鈉，5-7％(w/w)的聚乙二醇，0.5-1.5％(w/w)活性炭的混合液，溶劑為水。

更進一步地，優(yōu)選為聚乙二醇含量為6％(w/w)，海藻酸鈉含量為4％(w/w)，活性炭含量為1％(w/w)。

所述菌懸液中菌體濃度可以為5×10⁸-7×10⁸個/mL。

步驟2)所述增值培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：糖蜜(以糖蜜中所含葡萄糖的量來計算，相當于50g/L葡萄糖含量的糖蜜)，CaCl₂ 0.058-0.062g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.98-2.02g/L，(NH₄)₂HPO₄0.98-1.02g/L，MgSO₄ 0.098-0.102g/L，酵母粉0.5-1.5％，pH 4.5-5.0。

步驟2)所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：糖蜜(以糖蜜中所含葡萄糖的量來計算，相當于葡萄糖含量為180-220g/L的糖蜜量)，CaCl₂ 0.098-0.102g/L，KCl 0.098-0.102g/L，(NH₄)₂SO₄9.98-10.02g/L，(NH₄)₂HPO₄4.98-5.02g/L，MgSO₄ 0.098-0.102g/L，酵母粉0.1-1％，PH 4.5-5.0。

步驟2)中增值培養(yǎng)在28-32℃,180-220r/min條件下增值培養(yǎng)18-24小時。

步驟2)中發(fā)酵溫度為28-32℃，轉(zhuǎn)速70-100rpm，發(fā)酵時間為40-80h。

將固定化好的酵母細胞用無菌水洗滌3～4次后，進行增值培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵的容器為一升的發(fā)酵罐，發(fā)酵液體積與增值固定化菌的體積比可以為6:1-8:1之間。

所述的酵母細胞的固定化方法具體為：將試管斜面上的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，在30℃,200r/min條件下培養(yǎng)20小時，6000轉(zhuǎn)離心1min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌菌體3-5次，用無菌水將菌體稀釋大約5倍制成(5～7)×10⁸個/mL的菌懸液，然后與無菌的復合固定化載體均勻混合，菌懸液與固定化載體的體積比為1:4，室溫下用注射器成滴注入到無菌的5％(w/w)的CaCl₂溶液中，邊滴邊攪拌，滴完后20±2℃下水浴攪拌2h，放置4℃冰箱平衡12h。將平衡過的菌體用無菌水洗滌2-3次，置于增值培養(yǎng)基中，30℃,200r/min條件下增值培養(yǎng)20小時。

所述的復合固定化載體優(yōu)選為4％(w/w)的海藻酸鈉(SA)，6％(w/w)的聚乙二醇(PEG)，1％(w/w)活性炭的混合液。在以原糖蜜為碳源的發(fā)酵液體系中SA/PEG/活性炭復合載體固定化的細胞在發(fā)酵90小時時未發(fā)現(xiàn)有載體破損，在發(fā)酵58小時時乙醇濃度可以達到68g/L。

載體損失率是以體積比來計算的，以未出現(xiàn)任何裂痕的固定化細胞的積相當于水的體積來計算。

本發(fā)明中所述的糖蜜可以是甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，玉米糖蜜等，在發(fā)酵時只需對該糖蜜進行稀釋處理，以降低其黏度，便于量取。

本發(fā)明中所述的酵母細胞可以為釀酒酵母，畢赤酵母等產(chǎn)酒型酵母。

本發(fā)明利用的固定化載體和固定化方法使釀酒酵母細胞在糖蜜不經(jīng)任何處理的情況下提高了糖蜜乙醇發(fā)酵的乙醇抑制濃度，使得乙醇濃度達7％(v/v)時才開始出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，發(fā)酵液中最高乙醇濃度可以達到68g/L，而Anuchit Rattanapan報道的用甘蔗渣固定化的酵母細胞發(fā)酵的乙醇最高濃度為52.8g/L,并且其糖蜜原料經(jīng)過酸堿預處理過。對于未經(jīng)任何預處理的糖蜜乙醇發(fā)酵至今還未見報道。該固定化載體和固定化方法不但提高了乙醇的產(chǎn)量，還實現(xiàn)了廢棄生物質(zhì)資源糖蜜的低成本利用，對固定化細胞用于其他產(chǎn)品的糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)具有借鑒意義。

有益效果：本發(fā)明采用海藻酸鈉(SA)/聚乙二醇(PEG)/活性炭復合載體固定化酵母細胞，使其更適合在未經(jīng)任何預處理的糖蜜體系下進行發(fā)酵，并提高了發(fā)酵液中乙醇的濃度，與普通的海藻酸鈉固定化方法相比提高了乙醇產(chǎn)量，降低了載體損失率，在發(fā)酵58h乙醇濃度最高可以達到68g/L,在分批發(fā)酵90h未出現(xiàn)載體破損，在連續(xù)發(fā)酵近400h時，其產(chǎn)乙醇能力未出現(xiàn)下降。固定化細胞操作簡單，成本低廉，并為糖蜜體系下的固定化細胞發(fā)酵提供了很好的借鑒方法。

附圖說明

圖1：游離菌細胞與固定化細胞糖蜜乙醇發(fā)酵情況；

圖2：固定化載體在糖蜜乙醇發(fā)酵體系下的重復使用性；

圖3：固定化載體在糖蜜乙醇發(fā)酵體系下的菌體濃度。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，本發(fā)明所涉及的主題保護范圍并非僅限于這些實施例。

實施例中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)編號S.NJL-2001是從糖蜜乙醇發(fā)酵液中篩選得到的。保藏于國家微生物典型保藏中心保藏編號為CCTCC AY 2016001。

實施例中用的糖蜜為甘蔗糖蜜購于廣西南寧。該糖蜜的含水量為23.52％，總糖43.5％(其中葡萄糖3.69％，果糖8.91％，蔗糖30.9％)，灰分7.21％,總氮1.34％，膠體15.92％，其他8.51％，所述百分比為質(zhì)量百分比。

實施例1酵母細胞的固定化

種子培養(yǎng)基3瓶(250mL錐形瓶，裝液量120mL)：糖蜜50g/L(以糖蜜中所含葡萄糖的量來計算),CaCl₂ 0.022g,(NH₄)₂SO₄ 0.72g，(NH₄)₂HPO₄ 0.36g，MgSO₄ 0.036g，酵母粉1.8g，H₂O270mL，糖蜜需單獨滅菌后再與其他已滅菌的培養(yǎng)基成分混合。

復合固定化載體的制備：6％(w/w)PEG和4％(w/w)SA和1％(w/w)活性炭的混合液300mL(300mL混合液中18克的PEG，12g的SA，3g的活性炭)；5％(w/w)的CaCl₂溶液300mL,分別于121℃下，滅菌15min。

將試管斜面上的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，在30℃，200r/min條件下培養(yǎng)20小時，6000轉(zhuǎn)離心1min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌菌體3-5次，用無菌水將菌體稀釋5倍制成7×10⁸個/mL的菌懸液，然后與滅過菌的復合固定化載體均勻混合，菌懸液與固定化載體的體積比為1:4，室溫下用注射器成滴注入到無菌的5％(w/w)的CaCl₂溶液中，邊滴邊攪拌，滴完后20±2℃下水浴攪拌2h，然后放置4℃冰箱平衡12h，得到直徑大約2-3毫米的黑色球狀固定化酵母細胞顆粒。

實施例2復合固定化載體的優(yōu)化實驗

為了找出最佳的固定化條件，通過三因素三水平的正交試驗對固定化材料海藻酸鈉(SA)、聚乙二醇(PEG)、活性炭的濃度進行了優(yōu)化，并假定各因素之間沒有相互作用。

實驗按照實施例1，對酵母細胞進行固定化后于30℃下200rpm的搖床進行增殖培養(yǎng)，按照固定化細胞體積與發(fā)酵液體積為1:7的比例進行糖蜜乙醇發(fā)酵實驗，其中發(fā)酵液體積750ml,溫度30℃，轉(zhuǎn)速80rpm,氨水調(diào)節(jié)PH5.0，通氣，記錄發(fā)酵液中可以達到的最高乙醇濃度。

表1：因素水平表

表2：各因素水平實驗結(jié)果及分析

經(jīng)過三因素三水平的優(yōu)化實驗發(fā)現(xiàn)，當實驗組合為A₂B₂C₃，即SA含量為4％(w/w)，活性炭含量為1％(w/w)，PEG含量為6％(w/w)進行固定化酵母細胞時可以得到最高的乙醇濃度為68g/L，并且實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉的濃度對固定化細胞糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響最大，活性炭的濃度影響最小。

實施例3游離菌發(fā)酵與不同固定化載體發(fā)酵的對照實驗

實驗按照實施例1的方法將酵母細胞固定化后，同時于30℃下200rpm的搖床進行增值培養(yǎng)，并以游離菌的種子培養(yǎng)為對照實驗，增值培養(yǎng)20h后以固定化細胞體積與發(fā)酵液體積比為1:7的比例轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，游離菌以相同的菌量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。其中發(fā)酵液體積750ml,溫度30℃，轉(zhuǎn)速80rpm,氨水調(diào)節(jié)PH5.0，通氣，且每隔一定時間取樣，測量乙醇的生產(chǎn)情況和糖的消耗情況，這里的糖是以總的還原糖計的。實驗結(jié)果如圖1和表3。

表3游離細胞與固定化細胞糖蜜乙醇發(fā)酵

與游離細胞糖蜜乙醇發(fā)酵相比，普通的固定化細胞方法海藻酸鈉固定化細胞降低了發(fā)酵液中乙醇的抑制濃度，使得乙醇產(chǎn)量提高了66.7％，糖醇轉(zhuǎn)化率提高了47％。但是受糖蜜復雜成分的影響，海藻酸鈉固定化細胞在發(fā)酵大約90小時時大約有17％的載體出現(xiàn)了不同程度的裂痕。但是，當利用海藻酸鈉/聚乙二醇/活性炭復合固定化載體進行糖蜜乙醇發(fā)酵時，與普通的海藻酸鈉固定化細胞相比乙醇的產(chǎn)量不但提高了16％，糖醇轉(zhuǎn)化率也提高了近80％。關鍵是，在發(fā)酵相同時間下，海藻酸鈉/聚乙二醇/活性炭復合固定化載體并沒出現(xiàn)破損情況，這對糖蜜體系下的發(fā)酵是非常有利的。

實施例4SA/PEG/活性炭復合固定化載體固定化細胞糖蜜體系發(fā)酵與模擬糖蜜體系發(fā)酵的對比。

實驗按照實施例1的方法將酵母細胞固定化后，同時于30℃下200rpm的搖床進行增值培養(yǎng)，并以游離菌的種子培養(yǎng)為對照實驗，增值培養(yǎng)20h后以固定化細胞體積與發(fā)酵液體積比為1:7的比例分別接種到糖蜜體系的發(fā)酵系統(tǒng)和模擬糖蜜體系的發(fā)酵系統(tǒng)，這里的模擬糖蜜體系是根據(jù)糖蜜中所含蔗糖，葡萄糖，果糖的比例來配置的。發(fā)酵液體積為750ml,發(fā)酵溫度30℃，轉(zhuǎn)速80rpm,PH＝5.0氨水調(diào)節(jié)，通氣，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵大約108小時結(jié)束時，糖蜜體系下發(fā)酵的固定化載體幾乎沒有破裂，而模擬糖蜜體系下的固定化載體有的破損，有的出現(xiàn)了裂痕，載體損失率達30％以上，這是因為未經(jīng)任何前期處理糖蜜中含有Ca²⁺,Mg²⁺等有利于固定化載體的固化，而活性炭的加入有利于這些鹽離子被吸附在固定化載體表面，從而增強了固定化細胞的強度，除此之外，活性炭本身就可以增加載體的機械強度；另一方面，聚乙二醇具有潤滑的作用從而減少了在攪拌過程中載體與載體之間以及載體與罐體之間的摩擦力，進一步降低了固定化載體的損失率。

實施例5糖蜜體系下載體的重復性實驗

實驗按照實施例1的方法將酵母細胞固定化后，同時于30℃下200rpm的搖床進行增值培養(yǎng)，并以游離菌的種子培養(yǎng)為對照實驗，增值培養(yǎng)20h后以固定化細胞體積與發(fā)酵液體積比為1:7的比例轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基。其中發(fā)酵液體積750ml,溫度30℃，轉(zhuǎn)速80rpm,氨水調(diào)節(jié)PH5.0，通氣。當乙醇的濃度出現(xiàn)明顯的降低時，更換新的發(fā)酵液，進行第二次發(fā)酵。實驗一共進行了三次發(fā)酵，發(fā)酵總時長約為390h，每隔一定時間取樣測量其乙醇的量和還原糖的濃度，并計算最終發(fā)酵結(jié)束時載體的損失率，實驗的乙醇生產(chǎn)曲線圖和還原糖的消耗曲線如圖2和圖3所示。

從圖中可以看出，在發(fā)酵時間達到大約300h固定化載體開始出現(xiàn)嚴重破損，由發(fā)酵罐中菌體的OD曲線看出，此時發(fā)酵罐中游離菌的濃度明顯增大，這是由于載體破損使大量菌體游離出來導致的。在發(fā)酵達到390h，結(jié)束發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)固定化載體的損失率約為30％，由發(fā)酵罐中乙醇的濃度曲線知道菌體產(chǎn)乙醇的能力一直都保持在較高的水平，糖耗也保持在一個較穩(wěn)定的狀態(tài)。