本發(fā)明涉及一種胞外醛糖酸內(nèi)酯酶，尤其涉及一種胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是世界上最豐富的可再生資源，可用于生產(chǎn)生物乙醇燃料和其它增值產(chǎn)品。纖維素的降解需要內(nèi)切葡聚糖酶纖維二糖水解酶協(xié)同作用，使其轉(zhuǎn)化成纖維二糖，再由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)一種裂解性多糖單加氧酶(LPMOs)，能夠通過(guò)氧化的方式斷開(kāi)纖維素鏈，從而和其它纖維素水解酶一起協(xié)同降解木質(zhì)纖維素。研究表明，多糖單加氧酶的水解產(chǎn)物包括纖維寡糖、醛糖酸內(nèi)酯和醛糖酸。而眾所周知，醛糖酸內(nèi)酯對(duì)多種糖苷水解酶都有抑制作用，比如β-葡萄糖苷酶受到葡萄糖酸內(nèi)酯的強(qiáng)烈抑制。多糖單加氧酶能夠和β-葡萄糖苷酶協(xié)同作用促進(jìn)纖維素的降解，但是其產(chǎn)物醛糖酸內(nèi)酯又對(duì)β-葡萄糖苷酶有抑制作用。在纖維素酶降解木質(zhì)纖維素的體系中，能夠產(chǎn)生內(nèi)酯的不止限于多糖單加氧酶，還有纖維二糖脫氫酶和其它氧化還原酶類；受內(nèi)酯抑制的酶類，不止限于β-葡萄糖苷酶，還有其它多種糖苷水解酶類。

經(jīng)檢索，有關(guān)胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC及其應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC，其特征在于：該胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

具體的，所述胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC包括419個(gè)氨基酸，N-端19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，成熟的PoALAC的理論分子量為43.1kDa。進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC還涵蓋在：所使用的蛋白為表現(xiàn)出醛糖酸內(nèi)酯酶活性的PoALAC的變體，包括對(duì)該蛋白少量氨基酸的修改、插入或刪除；以及所使用的蛋白為表現(xiàn)出醛糖酸內(nèi)酯酶活性的與PoALAC序列一致度在50％及以上的醛糖酸內(nèi)酯酶。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種包含上述醛糖酸內(nèi)酯酶基因poalac的重組載體pPIC-poalac。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種包含上述重組載體pPIC-poalac的重組畢赤酵母工程菌株GS115/poalac。

本發(fā)明所述的胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC是由重組畢赤酵母工程菌株GS115/poalac發(fā)酵培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化回收獲得。

用William公開(kāi)的(Applied and Environmental Microbiology.2011,77:650-656)測(cè)量醛糖酸內(nèi)酯酶活性的方法測(cè)定純化的PoALAC比酶活是173009IU/mg。

本發(fā)明所述胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC在與多糖單加氧酶和β-葡萄糖苷酶協(xié)同降解磷酸膨脹纖維素中的應(yīng)用

具體的，本發(fā)明提供了胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC在與多糖單加氧酶PoLPMO1和β-葡萄糖苷酶PoBGL1的在協(xié)同水解磷酸膨脹纖維素中的應(yīng)用。

PoBGL1單獨(dú)不能降解磷酸膨脹纖維素，PoLPMO1和PoBGL1協(xié)同作用可以降解磷酸膨脹纖維素產(chǎn)生葡萄糖。PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1三者協(xié)同作用與PoLPMO1和PoBGL1二者協(xié)同作用相比，內(nèi)酯濃度降低、β-葡萄糖苷酶比酶活升高、產(chǎn)生的葡萄糖濃度升高。說(shuō)明PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1三者協(xié)同作用，能進(jìn)一步提高磷酸膨脹纖維素的降解效果。

本發(fā)明所述胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC在降解木質(zhì)纖維素中的應(yīng)用。

具體的，本發(fā)明提供了胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC與多糖單加氧酶PoLPMO1和β-葡萄糖苷酶PoBGL1協(xié)同作用促進(jìn)多種木質(zhì)纖維素降解的應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)：無(wú)論是水解微晶纖維素還是不同方法預(yù)處理的天然底物，向來(lái)源于草酸青霉的混合纖維素酶SP或來(lái)源于里氏木霉的混合纖維素酶ST2中分別添加PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1都能提高水解效果；添加量減半后兩種酶同時(shí)添加，比單獨(dú)添加效果要好，說(shuō)明PoLPMO1和PoBGL1，PoALAC和PoLPMO1，PoALAC和PoBGL1兩者間有協(xié)同作用；添加量減少三分之二后三種酶同時(shí)添加，比兩兩添加效果更好，說(shuō)明PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1三者間有強(qiáng)烈的協(xié)同作用。

醛糖酸內(nèi)酯酶能夠與多糖單加氧酶和葡萄糖苷酶協(xié)同作用降解木質(zhì)纖維素，其原因在于醛糖酸內(nèi)酯酶能夠解除內(nèi)酯抑制作用，從而進(jìn)一步增強(qiáng)多糖單加氧酶和葡萄糖苷酶的協(xié)同作用。事實(shí)上，適用這個(gè)協(xié)同效果的醛糖酸內(nèi)酯酶的來(lái)源不限于草酸青霉；能產(chǎn)生內(nèi)酯的氧化還原酶不限于多糖單加氧酶，來(lái)源不限于草酸青霉；能被內(nèi)酯抑制的糖苷水解酶不限于β-葡萄糖苷酶，來(lái)源不限于草酸青霉；能被三者協(xié)同促進(jìn)水解效果的纖維素酶酶系來(lái)源不限于草酸青霉和里氏木霉；用于協(xié)同促進(jìn)水解的底物不限于微晶纖維素、水熱預(yù)處理玉米秸稈、稀酸預(yù)處理玉米秸稈、木糖渣和脫木素木糖渣。

本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)源于草酸青霉114-2的胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC及其應(yīng)用，該酶能夠?qū)⑷┨撬醿?nèi)酯高效水解成醛糖酸，除去體系中對(duì)糖苷水解酶不利的內(nèi)酯，從而進(jìn)一步提高水解效果。將該醛糖酸內(nèi)酯酶加入已添加多糖單加氧酶和β-葡萄糖苷酶的纖維素酶系中，不僅能夠進(jìn)一步提高微晶纖維素的降解效果，還能進(jìn)一步提高多種不同預(yù)處理的天然木質(zhì)纖維素底物的降解效果，在生物能源和生物基化學(xué)品工業(yè)應(yīng)用中具有很大的潛力。

因此，本醛糖酸內(nèi)酯酶可用于能源工業(yè)，促進(jìn)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可酵解糖。

附圖說(shuō)明

圖1：純化的PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1的SDS-PAGE。

其中：1、PoBGL1，2、PoALAC，3、PoLPMO1。

圖2：PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1協(xié)同水解0.5％(wt/vol)磷酸膨脹纖維素。三種酶的添加量分別為4mg/g纖維素，單獨(dú)或共同作用于磷酸膨脹纖維素。50℃，200rpm，水解60h后測(cè)定葡萄糖濃度、內(nèi)酯濃度和β-葡萄糖苷酶酶活。

其中：1、對(duì)照，2、PoBGL1，3、PoALAC，4、PoLPMO1，5、PoBGL1+PoALAC，6、PoLPMO1+PoALAC，7、PoLPMO1+PoBGL1，8、PoBGL1+PoALAC+PoLPMO1。

圖3：PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1協(xié)同促進(jìn)1％(wt/vol)微晶纖維素的降解?？偟鞍琢堪?7％的纖維素酶SP和3％的添加蛋白。其中纖維素酶SP的用量是16FPU/g纖維素。在3％的添加蛋白中，各組分的用量是平均的，牛血清白蛋白(BSA)作為對(duì)照。50℃，200rpm，水解24h后測(cè)定葡萄糖濃度。

其中：1、3％BSA，2、3％SP，3、3％PoLPMO1，4、3％PoBGL1，5、3％PoALAC，6、1.5％PoLPMO1+1.5％PoBGL1，7、1.5％PoLPMO1+1.5％PoALAC，8、1.5％PoALAC+1.5％PoBGL1，9、1％PoLPMO1+1％PoBGL1+1％PoALAC。

圖4：PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1協(xié)同促進(jìn)多種預(yù)處理天然底物的降解。總蛋白量包含97％的纖維素酶和3％的添加蛋白。其中纖維素酶(A)SP，(B)ST2的用量是16FPU/g纖維素。在3％的添加蛋白中，各組分的用量是平均的，牛血清白蛋白(BSA)作為對(duì)照。50℃，200rpm，水解24h后測(cè)定葡萄糖濃度。底物包括5％(wt/vol)水熱預(yù)處理玉米秸稈，稀酸預(yù)處理玉米秸稈，脫木素木糖渣和木糖渣。

其中：1、水熱預(yù)處理玉米秸稈，2、稀酸預(yù)處理玉米秸稈，3、脫木素木糖渣，4、木糖渣。

具體實(shí)施方式

下面是本發(fā)明具體的實(shí)施示例。需要指出的是，這些實(shí)施例僅僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。在本發(fā)明的思路和范圍下對(duì)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行的修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1：胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC的制備

1、微生物來(lái)源和載體

原始出發(fā)菌草酸青霉(Penicillium oxalicum)野生菌株114-2，該菌株是申請(qǐng)人先前專利申請(qǐng)時(shí)保藏的菌株。該菌株于2011年9月28日保藏于中國(guó)微生物菌株保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號(hào)是CGMCC No.5302。

畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K及畢赤酵母菌株GS115購(gòu)自于Invitrogen公司。

2、培養(yǎng)基

菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，MgSO₄﹒7H₂O 0.5g/L，CaCl₂ 0.5g/L，F(xiàn)eSO₄﹒7H₂O 0.0075g/L，MnSO₄﹒H₂O 0.0025g/L，ZnSO₄﹒7H₂O 0.0036g/L，CoCl₂﹒6H₂O 0.0037g/L。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：將菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的20.0g/L葡萄糖替換成1％纖維素和1％葡萄糖。

大腸桿菌培養(yǎng)基LB：10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10.0g/L NaCl，pH 7.0。

酵母培養(yǎng)基YPD：10.0g/L酵母粉，20.0g/L蛋白胨，10.0g/L葡萄糖。

重組轉(zhuǎn)化子篩選培養(yǎng)基MD：3.4g/L不含硫酸銨的酵母氮堿，10.0g/L硫酸銨，10.0g/L葡萄糖，滅菌后加入2mL 500×生物素貯存液(制備方法：20mg生物素溶于100ml去離子水，過(guò)濾除菌)。MD固體培養(yǎng)基含1.8％瓊脂粉。

BMGY培養(yǎng)基：不含硫酸銨的酵母氮堿3.4g/L，KH₂PO₄ 11.8g/L，K₂HPO₄﹒3H₂O 3g/L，硫酸銨10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，1％(vol/vol)甘油，pH 6.0，滅菌后加入2mL500×生物素貯存液。

BMMY培養(yǎng)基：與BMGY培養(yǎng)基配方相同，但不含甘油。滅菌后除了加入生物素貯存液外，再加入1％(vol/vol)甲醇。

3、草酸青霉重組醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC的基因克隆、表達(dá)和純化

草酸青霉114-2的RNA提取和cDNA合成：

接種新鮮的孢子懸液至菌絲生長(zhǎng)液體培養(yǎng)基，30℃，200rpm，24h過(guò)夜培養(yǎng)，向誘導(dǎo)培養(yǎng)基里接入約0.5g的濕的菌絲體。將培養(yǎng)好的菌體抽濾洗滌后，放入-20℃預(yù)冷的研缽中,加入液氮迅速研磨成均勾粉末。適量粉末迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷無(wú)RNAase的離心管中，待液氮揮發(fā)后加入1mL RNAiso試劑，禍旋振蕩混合。室溫靜置5mim，12000rpm，4℃離心l0min，上清液移至新離心管中,棄沉淀。加入0.2mL氯仿，震蕩15s后室溫靜置5min,12000rpm，4℃離心l5min，取約400μL上層水樣至新的離心管。加入2倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置10min。12000rpm，4℃離心10min，棄上清，RNA沉于管底。加入1mL預(yù)冷的用DEPC處理的雙蒸水配置的濃度為75％的乙醇洗滌沉淀2次，溫和震蕩離心管，4℃不超過(guò)7500rpm，離心5min，盡量棄去上清。室溫放置瞭干5-10min。加入適量(30-50μL)DEPC處理的雙蒸水溶解RNA。

cDNA的合成使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa公司的PrimeScript ^RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

使用以下引物來(lái)擴(kuò)增poalac：

poalac限制性內(nèi)切酶：AvrII和NotI

poalac-正向：GTACCTAGGCAAGACAGCGCCGGACGCCATA(SEQ ID NO.3)

poalac-反向：TTCGCGGCCGCCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGTCCCAAATAACACTGCTCAGT(SEQ ID NO.4)

PCR產(chǎn)物純化，將表達(dá)載體pPIC9K和上述編碼基因分別進(jìn)行雙酶切，切出的基因片段與pPIC9K連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC-poalac用MssI酶切線性化，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得重組畢赤酵母菌株GS115/poalac。

重組畢赤酵母菌株接種于50mL BMGY培養(yǎng)液中，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)18h，離心收集菌體，并于100mL BMMY培養(yǎng)基重懸，用1％甲醇誘導(dǎo)5天后，離心收集上清。

培養(yǎng)液經(jīng)0.22μm聚醚砜膜過(guò)濾后，上樣經(jīng)結(jié)合緩沖液再生后的1ml HisTrap^TM柱(GE Healthcare，Lot.#17-5319-01)，再用結(jié)合緩沖液沖洗一遍，用洗脫緩沖液洗脫重組蛋白。重組蛋白過(guò)夜透析，將緩沖液換成50mM檸檬酸緩沖液(pH 4.8)。經(jīng)純化的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE顯示于圖1(其中：1、PoBGL1，2、PoALAC，3、PoLPMO1)。

其中：0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.8)：分別配制0.1M檸檬酸(C₆H₈O₇﹒H₂O)溶液(21.01g/L)和0.1M檸檬酸鈉((Na₃C₆H₅O₇﹒2H₂O))溶液(29.41g/L)，往0.1M檸檬酸溶液中加入0.1M檸檬酸鈉溶液至pH 4.8。

0.5M磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)：分別配制0.5M磷酸氫二鉀(K₂HPO₄﹒3H₂O)溶液(114.11g/L)和0.5M磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)溶液(680.45g/L)，往0.5M磷酸氫二鉀溶液中加入0.5M磷酸二氫鉀溶液至pH 7.4。

2M咪唑母液(300ml)：稱40.848g咪唑，定容至275ml，濃鹽酸調(diào)pH至7.4，4℃保存。

結(jié)合緩沖液(1L)：10ml 2M咪唑，40ml 0.5M磷酸鉀緩沖液，29.22g NaCl。

洗脫緩沖液(250ml)：62.5ml 2M咪唑，10ml 0.5M磷酸鉀緩沖液，7.305g NaCl。

4、醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC的酶活測(cè)定

醛糖酸內(nèi)酯酶的酶活測(cè)定按照William和Beeson等人所述文獻(xiàn)(Applied and Environmental Microbiology.2011,77:650-656)。在25℃下，在96微孔板上操作。將100μL 10mg/mL新鮮的葡糖酸-δ-內(nèi)酯與100μL醛糖酸內(nèi)酯酶混合反應(yīng)1min。加入40μL鹽酸羥胺-NaOH混合液(2M鹽酸羥胺和1.5M NaOH等體積混合)淬滅1min。加入20μL 4M鹽酸酸化體系穩(wěn)定糖氧肟酸鹽。加入20μL 0.5M FeCl₃顯色，測(cè)定540nm吸光值。

蛋白質(zhì)的濃度采用Bradford法測(cè)定。在室溫下，在96微孔板上操作。取20μL適量稀釋的蛋白質(zhì)溶液，加入200μL Bradford試劑(生工，Lot.:BC18DB0008)，靜置10min后，測(cè)定595nm吸光值。

實(shí)施例2：胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC在協(xié)同降解纖維素中的應(yīng)用。

1、醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC與多糖單加氧酶PoLPMO1和β-葡萄糖苷酶PoBGL1的協(xié)同實(shí)驗(yàn)

磷酸膨脹纖維素的制備方法：在50mL的離心管中加入2g微晶纖維素和6mL雙蒸水，充分?jǐn)嚢枋估w維素粉末成均勻的漿狀物。加入10mL冰冷的86％磷酸充分?jǐn)嚢?，使纖維素充分溶解，混合物變澄清。冰中放置1h，期間不斷攪拌，最后加入冰水強(qiáng)烈攪拌，至磷酸的終濃度達(dá)到83.2％(wt/vol)，此時(shí)有大量白色膠狀物質(zhì)沉淀析出，于5000rpm，4℃離心20min。用冰冷的雙蒸水洗滌膠狀物3次，最后使用2M Na₂CO₃中和殘余的磷酸。制備的膠狀物4℃保存。

協(xié)同實(shí)驗(yàn)方法：水解底物為0.5％(wt/vol)磷酸膨脹纖維素。純化的PoALAC，PoLPMO1和PoBGL1三種酶的添加量分別為4mg/g纖維素，單獨(dú)或共同作用于磷酸膨脹纖維素。50℃，200rpm，水解60h后測(cè)定葡萄糖濃度、內(nèi)酯濃度和β-葡萄糖苷酶酶活。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

葡萄糖濃度測(cè)定用生物傳感儀SBA-40C(Shandong Academy of Sciences.China)。內(nèi)酯濃度測(cè)定參照William和Beeson等人所述文獻(xiàn)(Applied and Environmental Microbiology.2011,77:650-656)。

2、醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC、多糖單加氧酶PoLPMO1和β-葡萄糖苷酶PoBGL1與纖維素酶系的協(xié)同作用

降解1％(wt/vol)微晶纖維素的添加實(shí)驗(yàn)：總蛋白量包含97％的纖維素酶SP和3％的添加蛋白。其中纖維素酶SP的用量是16FPU/g纖維素。在3％的添加蛋白中，各組分的用量是平均的，牛血清白蛋白(BSA)作為對(duì)照。50℃，200rpm，水解24h后測(cè)定葡萄糖濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

降解5％(wt/vol)預(yù)處理天然底物的糖化實(shí)驗(yàn)：總蛋白量包含97％的纖維素酶和3％的添加蛋白。其中纖維素酶SP或ST2的用量是16FPU/g纖維素。在3％的添加蛋白中，各組分的用量是平均的，牛血清白蛋白(BSA)作為對(duì)照。50℃，200rpm，水解24h后測(cè)定葡萄糖濃度。底物包括水熱預(yù)處理玉米秸稈，稀酸預(yù)處理玉米秸稈，脫木素木糖渣和木糖渣。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

水熱預(yù)處理玉米秸稈的成分：59.72％纖維素、0.78％半纖維素、14.77％木素、5.93％灰分、15.7％抽出物。

稀酸預(yù)處理玉米秸稈的成分：49.48％纖維素、半纖維素低于檢測(cè)水平、25.32％木素、3.9％灰分、12.88％抽出物。

脫木素木糖渣的成分：65.74％纖維素、1.79％半纖維素、3.15％木素、5.83％灰分、23.39％抽出物。

未脫木素的木糖渣的成分：62.58％纖維素、2.38％半纖維素、17.69％木素、6.84％灰分、10.52％抽出物。

濾紙酶活(FPA)測(cè)定方法：稱取50mg Waterman定量濾紙片(Cat No1001125，Whatman)，加入1ml 50mM檸檬酸緩沖液(pH 4.8)和500μl適當(dāng)稀釋的酶液，混勻后50℃水浴1h，加入2ml DNS終止反應(yīng)，煮沸5min，冷卻后加蒸餾水定容到25ml，搖勻，540nm測(cè)OD值。

DNS試劑的制備：將104g NaOH溶于1.3L蒸餾水中，加入30g 3，5-二硝基水楊酸混勻，加熱溶解。稱取910g酒石酸鉀鈉溶于2.5L蒸餾水中，再加入25g重蒸酚和25g無(wú)水亞硫酸鈉。將以上各步驟的溶液混合，加入1.2L蒸餾水(使得總體積5.0L)，保存于棕色瓶中，暗處放置一周后即可使用。

序列表

<110>山東大學(xué)

<120>一種胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC及其應(yīng)用

<141> 2016-11-24

<160> 4

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列

<221>胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC的氨基酸序列

<222>（1）…（419）

<400> 1

MRLTHAPLFS LLTLTGASLQ DSAGRHTTSR LWATHYNGNV YSLAFNGKSL SLTDTAKTCG 60

TMPSWLTFDR DTQTVYCSDE AGSADPSTHG SLWAYHAGRD GSLQQYAKTD TVGGGVNSVI 120

YKNDQGDKYL AIAHYEGSAV STFALPLHDG DSALQEFHFK LTRPGAVAQQ DSPHPHEVFL 180

DPTGSFVVSP DLGADLLRIY SIDGESGKLH ECPSVNITFG FGPRHGVFWS DGTSDQKHSR 240

DDQTGHASDS RQAQAVGKTM MYLANEIGGT VDVFDVTYAR SGCLSFEKIQ TMVPYTNGVM 300

PKGATPAEIR LIDDTLYVSI RSDQGFAPSD SMVALDRSPR TGTVKFRQKT PSYGKVPRTV 360

AINRAGDLVA IGDQASSNVA IVRRDRKTGN LGEKIATLQV GEPGQVGTAE GLSSVIWDE 419

<210> 2

<211> 1260

<212> cDNA

<213>人工序列

<221>胞外醛糖酸內(nèi)酯酶PoALAC的核苷酸序列

<222>（1）…（1260）

<400> 2

atgcgcctca cgcacgcccc cttgttctct cttctcaccc tcacgggcgc ttccctgcaa 60

gacagcgccg gacgccatac cacgtctcgg ctttgggcta cccattacaa tggcaatgtc 120

tattcgctcg ccttcaatgg caagagcctt tccctgaccg acacagccaa gacttgtggt 180

accatgccca gctggctcac ctttgatcga gacacccaga cggtgtattg ctcagacgaa 240

gccggttctg cagaccccag cacgcatggc tccctctggg cataccatgc gggacgagat 300

ggctccttgc agcaatatgc caagacggac acggtgggcg gcggcgtcaa cagtgtcatc 360

tacaagaatg atcagggcga caagtacctg gccattgcac attacgaggg ctcggcggtt 420

tcgacctttg ctcttcctct gcacgacggc gattccgcgc tccaggaatt ccacttcaaa 480

ctgactcgcc cgggtgccgt tgctcaacaa gactccccgc atccgcacga ggtctttttg 540

gatccgaccg gctccttcgt cgtgagcccc gacttgggcg ctgatctcct ccgcatctac 600

tccatcgacg gtgaatccgg caagctgcat gaatgcccct cggtcaatat cacttttgga 660

tttggaccgc gtcacggcgt gttctggtcc gatggtacca gcgaccagaa acactctcgg 720

gatgaccaga ctggtcacgc cagtgactcg cgacaggctc aagccgtcgg aaagacgatg 780

atgtatttgg ccaatgagat tggtggtacg gtcgacgtct tcgacgtcac ctatgcgcgg 840

tctggctgtc tctcattcga gaagattcag accatggtgc cctacaccaa cggtgtgatg 900

cccaaggggg ccaccccagc agagatccgc ttgatcgacg acaccctgta cgtgtccatc 960

cgttccgatc agggcttcgc ccccagcgac agtatggtgg ctttggatcg atcgccacgt 1020

acgggcaccg tcaagttccg ccaaaagacc ccctcgtatg gcaaggtccc ccggaccgtt 1080

gcgatcaatc gcgcgggtga tctggtggcg atcggtgacc aggcctcgtc gaatgtggcg 1140

attgttcgca gagaccgcaa gacaggcaac ttgggcgaga agattgcgac gctgcaagtc 1200

ggcgagcctg gccaagtagg tactgccgag ggactgagca gtgttatttg ggacgagtga 1260

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<221> poalac-正向引物序列

<222>（1）…（31）

<400>3

gtacctaggc aagacagcgc cggacgccat a 31

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213>人工序列

<221> poalac-反向引物序列

<222>（1）…（57）

<400>4

ttcgcggccg cctagtggtg gtggtggtgg tgctcgtccc aaataacact gctcagt 57