本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以SGLT2蛋白為靶點(diǎn)的抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病主要分為I型糖尿病和II型糖尿病，前者是由于胰島β細(xì)胞不能產(chǎn)生足夠的胰島素(胰島素絕對(duì)缺乏)所致，后者是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗(胰島素相對(duì)缺乏)所致。糖尿病患者中約有90％～95％屬于II型糖尿病。

鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLT)是一類在小腸粘膜(SGLT1)和腎近曲小管(SGLT2和SGLT1)中發(fā)現(xiàn)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族。SGLT2是一種低親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其在腎臟中特異性的表達(dá)并且在近曲小管的腎臟血糖重吸收中發(fā)揮非常重要的作用。約90％的葡萄糖通過近曲小管S1段SGLT2的作用被重吸收，因此，選擇性地抑制SGLT2蛋白的活性，是一種創(chuàng)造性的治療策略，即通過增加尿糖的排出以治療II型糖尿病。

近年來，新機(jī)制降糖藥物鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)抑制劑所受關(guān)注日益增加，目前研究發(fā)現(xiàn)SGLT2抑制劑可通過降低腎臟葡萄糖重吸收而改善糖尿病患者高血糖狀態(tài)，更有研究提示抑制SGLT2有潛在改善腎臟功能的作用。

藥物篩選模型是尋找和發(fā)現(xiàn)新藥物的重要條件之一。目前抗腫瘤藥物的篩選方法主要在包括體內(nèi)和體外篩選方法，體內(nèi)篩選方法成本高，操作難度大，不利于高通量的藥物篩選；體外篩選方法主要是在分子和細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)的，具有材料用量少，作用機(jī)制明確，易用于大規(guī)模篩選等優(yōu)點(diǎn)，是藥物篩選的主要方法。

目前，針對(duì)SGLT2抑制劑藥物篩選的細(xì)胞模型鮮有報(bào)道，通過已有模型對(duì)葡萄糖攝取的檢測(cè)，存在背景高，靈敏度低等不足。因此，有必要建立良好的基于SGLT2抑制劑藥物篩選細(xì)胞模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種以SGLT2蛋白為靶點(diǎn)的抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型及其制備和應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明公開了一種以SGLT2蛋白為靶點(diǎn)的抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型，該細(xì)胞模型是以具有組成型活性的慢病毒顆粒為基礎(chǔ)，感染panc-1細(xì)胞，構(gòu)建得到；所述具有組成型活性的慢病毒顆粒為帶有人源SGLT2基因、報(bào)告基因以及篩選基因的慢病毒顆粒。

所述報(bào)告基因?yàn)榫G色熒光蛋白eGFP，其與人源SGLT2基因通過T2A連接。

所述篩選基因?yàn)猷堰识舅豴uro，通過EF1啟動(dòng)子啟動(dòng)。

所述慢病毒顆粒為PCDH慢病毒包裝系統(tǒng)，該慢病毒顆粒濃縮后滴度為5*10⁸TU/ML。

panc-1細(xì)胞來源于ATCC。

本發(fā)明還公開了上述以SGLT2蛋白為靶點(diǎn)的抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)運(yùn)用慢病毒顆粒攜帶基因與宿主基因組的隨機(jī)整合技術(shù)，將人源SGLT2基因、報(bào)告基因以及篩選基因整合到panc-1細(xì)胞基因組中；

2)通過報(bào)告基因的表達(dá)量和篩選基因的篩選雙重控制，確保目的蛋白SGLT2在目的細(xì)胞panc-1中高效表達(dá)，從而建立抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型。

本發(fā)明還公開了上述以SGLT2蛋白為靶點(diǎn)的抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型在篩選抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明公開的以SGLT2蛋白為靶點(diǎn)的抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型，是通過慢病毒建立的穩(wěn)定高表達(dá)目的蛋白(SGLT2)的細(xì)胞模型，與轉(zhuǎn)染和同源重組相比，提高了基因整合效率，縮短了篩選時(shí)間；該模型通過綠色熒光蛋白(eGFP)的表達(dá)和篩選基因(puro)的篩選(嘌呤霉素)雙重控制，更好保證了目的蛋白(SGLT2)在目的細(xì)胞(panc-1)中的高表達(dá)水平。Western-Blot對(duì)目的蛋白(SGLT2)檢測(cè)結(jié)果顯示，和對(duì)照細(xì)胞相比(空載病毒感染的細(xì)胞)，目的蛋白(SGLT2)表達(dá)量顯著提高；該模型采用的panc-1細(xì)胞，自身葡萄糖攝取量低，而構(gòu)建成細(xì)胞模型后，糖攝取結(jié)果顯示，和對(duì)照細(xì)胞相比(空載病毒感染的細(xì)胞)，糖攝取量提高了5.2倍。

附圖說明

圖1為所構(gòu)建載體基本骨架圖；

圖2為慢病毒包裝結(jié)果圖；

圖3為panc-1細(xì)胞模型篩選后結(jié)果圖；

圖4為Western-Blot結(jié)果圖；

圖5為糖攝取結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明的抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，運(yùn)用慢病毒攜帶基因與宿主基因組隨機(jī)整合技術(shù)，將SGLT2基因、報(bào)告基因及篩選基因整合到panc-1細(xì)胞基因組中，通過綠色熒光蛋白(eGFP)的表達(dá)量和篩選基因(puro)的篩選(嘌呤霉素)雙重控制，確保目的蛋白(SGLT2)在目的細(xì)胞(panc-1)中穩(wěn)定的高效的表達(dá)，從而建立藥物的篩選平臺(tái)。

本發(fā)明的抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型，通過Western-Blot技術(shù)對(duì)目的蛋白(SGLT2)檢測(cè)，結(jié)果顯示，和對(duì)照細(xì)胞相比(空載病毒感染的細(xì)胞)，目的蛋白(SGLT2)表達(dá)量顯著提高。

本發(fā)明的抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型，通過糖攝取檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其對(duì)葡萄糖的攝取量。結(jié)果顯示，和對(duì)照細(xì)胞相比(空載病毒感染的細(xì)胞)，糖攝取量提高了5.2倍，滿足后續(xù)的藥物篩選。

1、載體構(gòu)建

參見圖1，將人工合成的SGLT2基因，通過Not I和N he I酶切位點(diǎn)，利用雙酶切、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化等技術(shù)，將目的基因(SGLT2)插入到慢病毒表達(dá)載體上(該載體包含eGFP-EF1-PURO基因)，命名為PCDH-SGLT2-eGFP-PURO，構(gòu)建成功后通過測(cè)序確保正確無誤。利用質(zhì)粒大提試劑盒提取無內(nèi)毒素、高濃度質(zhì)粒。

所述的人源SGLT2基因序列為生工生物工程(上海)股份有限公司合成(序列來源：NCBI Reference Sequence:NM_003041.3)。具體核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、慢病毒包裝

1)轉(zhuǎn)染前一天，以合適的細(xì)胞密度接種HEK293細(xì)胞到10cm培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞達(dá)到90～95％的融合；

2)利用脂質(zhì)體將PLP1，PLP2，PMDG與PCDH-SGLT2-eGFP-PURO質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，于37℃，5％的CO₂培養(yǎng)箱中孵育；

3)48h后熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率(參見圖2)；

4)48h后收獲細(xì)胞上清，3000rpm離心15min，0.45um濾器過濾，每3體積上清加入1體積PEG，4℃過夜；

3000rpm離心，棄上清，加入100ul PBS溶解沉淀，并測(cè)定病毒滴度，分裝-80℃保存。包裝的病毒命名為V-SGLT2(目的病毒)和V-control(空載病毒)。

3、慢病毒感染

將包裝好的慢病毒同時(shí)感染HEK293和panc-1細(xì)胞，48h后加入嘌呤霉素篩選，篩選穩(wěn)定后通過流式細(xì)胞儀分選出eGFP表達(dá)高的細(xì)胞，于37℃，5％的CO₂培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)。V-SGLT2感染panc-1的細(xì)胞命名為SGLT2pane-1，V-control感染panc-1的細(xì)胞命名為control panc-1，V-SGLT2感染HEK293的細(xì)胞命名為SGLT2HEK293，V-control感染HEK293的細(xì)胞命名為control HEK293，結(jié)果參見圖3。

4、Western-Blot檢測(cè)

收集1*10⁷個(gè)篩選穩(wěn)定的細(xì)胞系(SGLT2pane-1與control panc-1)，經(jīng)過RIPA裂解、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、顯色等步驟，檢測(cè)目的蛋白(SGLT2)的表達(dá)情況。結(jié)果見圖4，圖中，control panc-1為空載病毒感染細(xì)胞，SGLT2pane-1為模型組細(xì)胞，SGLT2為目的蛋白，β-actin為內(nèi)參蛋白，結(jié)果顯示和對(duì)照細(xì)胞相比，模型組細(xì)胞中，目的蛋白(SGLT2)表達(dá)量明顯提高。

5、糖攝取檢測(cè)細(xì)胞模型的葡萄糖攝取量

利用糖攝取檢測(cè)試劑盒分別對(duì)panc-1細(xì)胞模型(實(shí)驗(yàn)組和空載組)與HEK293細(xì)胞模型(實(shí)驗(yàn)組和空載組)葡萄攝取量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖5，圖中，SGLT2pane-1為panc-1細(xì)胞模型組，control panc-1為panc-1細(xì)胞對(duì)照組，SGLT2HEK293為HEK293細(xì)胞模型組，control HEK293為HEK293細(xì)胞對(duì)照組。結(jié)果顯示，panc-1細(xì)胞模型組，和對(duì)照細(xì)胞相比，葡萄糖攝取量提高了5.2倍；HEK293細(xì)胞模型組只提高了2.0倍，說明panc-1細(xì)胞模型組更適合做藥物篩選細(xì)胞模型。

核苷酸序列表

<110> 陜西脈元生物科技有限公司

<120>一種以SGLT2蛋白為靶點(diǎn)的抗糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型及其制備和應(yīng)用

<160> 1

<210> 1

<211> 2019

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggaggagc acacagaggc aggctcggca ccagagatgg gggcccagaa ggccctgatt 60

gacaatcctg ctgacatcct agtcattgct gcatatttcc tgctggtcat tggcgttggc 120

ttgtggtcca tgtgcagaac caacagaggc actgtgggcg gctacttcct ggcaggacgc 180

agcatggtgt ggtggccggt tggggcctct ctcttcgcca gcaacatcgg cagtggccac 240

tttgtgggcc tggcagggac tggcgctgca agtggcttgg ctgttgctgg attcgagtgg 300

aatgcgctct tcgtggtgct gctactgggc tggctgtttg cacccgtgta cctgacagcg 360

ggggtcatca cgatgccaca gtacctgcgc aagcgcttcg gcggccgccg catccgcctc 420

tacctgtctg tgctctccct tttcctgtac atcttcacca agatctcagt ggacatgttc 480

tccggagctg tattcatcca gcaggctctg ggctggaaca tctatgcctc cgtcatcgcg 540

cttctgggca tcaccatgat ttacacggtg acaggagggc tggccgcgct gatgtacacg 600

gacacggtac agaccttcgt cattctgggg ggcgcctgca tcctcatggg ttacgccttc 660

cacgaggtgg gcgggtattc gggtctcttc gacaaatacc tgggagcagc gacttcgctg 720

acggtgtccg aggatccagc cgtgggaaac atctccagct tctgctatcg accccggccc 780

gactcctacc acctgctccg gcaccccgtg accggggatc tgccgtggcc cgcgctgctc 840

ctcggactca caatcgtctc gggctggtac tggtgcagcg accaggtcat cgtgcagcgc 900

tgcctggccg ggaagagcct gacccacatc aaggcgggct gcatcctgtg tgggtacctg 960

aagctgacgc ccatgtttct catggtcatg ccaggcatga tcagccgcat tctgtaccca 1020

gacgaggtgg cgtgcgtggt gcctgaggtg tgcaggcgcg tgtgcggcac ggaggtgggc 1080

tgctccaaca tcgcctaccc gcggctcgtc gtgaagctca tgcccaacgg tctgcgcgga 1140

ctcatgctgg cggtcatgct ggccgcgctc atgtcctcgc tggcctccat cttcaacagc 1200

agcagcacgc tcttcaccat ggacatctac acgcgcctgc ggccacgcgc cggcgaccgc 1260

gagctgctgc tggtgggacg gctctgggtg gtgttcatcg tggtagtgtc ggtggcctgg 1320

cttcccgtgg tgcaggcggc acagggcggg cagctcttcg attacatcca ggcagtctct 1380

agctacctgg caccgcccgt gtccgccgtc ttcgtgctgg cgctcttcgt gccgcgcgtt 1440

aatgagcagg gcgccttctg gggactcatc gggggcctgc tgatgggcct ggcacgcctg 1500

attcccgagt tctccttcgg ctcgggcagc tgtgtgcagc cctcggcgtg cccagctttc 1560

ctctgcggcg tgcactacct ctacttcgcc attgtgctgt tcttctgctc tggcctcctc 1620

accctcacgg tctccctgtg caccgcgccc atccccagaa agcacctcca ccgcctggtc 1680

ttcagtctcc ggcatagcaa ggaggaacgg gaggacctgg atgctgatga gcagcaaggc 1740

tcctcactcc ctgtacagaa tgggtgccca gagagtgcca tggagatgaa tgagccccag 1800

gccccggcac caagcctctt ccgccagtgc ctgctctggt tttgtggaat gagcagaggt 1860

ggggtgggca gtcctccgcc ccttacccag gaggaggcag cggcagcagc caggcggctg 1920

gaggacatca gcgaggaccc gagctgggcc cgtgtggtca acctcaatgc cctgctcatg 1980

atggcagtgg ccgtgttcct ctggggcttc tatgcctaa 2019