本發(fā)明涉及引入外來遺傳物質(zhì)而修飾的細胞，具體涉及重組的HEK-293T細胞。

背景技術：

寨卡病毒(Zika virus)是黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)病毒，主要通過蚊蟲叮咬傳播、性接觸傳播，此外病毒可以通過胎盤。1947年病毒學家在烏干達發(fā)現(xiàn)ZIKA病毒，患者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、斑丘疹及關節(jié)酸痛，之后僅表現(xiàn)為零星發(fā)病和小規(guī)模流行。直到2007年在南太平洋的Yap島爆發(fā)流行，隨后在非洲、東南亞及南美洲相繼出現(xiàn)在卡病毒感染病例。中國國家衛(wèi)生計生委2016年2月9日通報，確診一例輸入性Zika病毒感染病例，截至目前共有10例輸入性Zika病毒感染病例。臨床研究證實Zika病毒能夠通過胎盤，導致胎兒出現(xiàn)小頭癥。Guillaume Carteaux報道了1例成年人中Zika病毒感染引起的腦膜腦炎。Zika病毒感染成為嚴重的世界性公共衛(wèi)生問題，同時給爆發(fā)疫情的國家和地區(qū)造成嚴重經(jīng)濟損失。世界銀行最新公布的數(shù)據(jù)顯示，在Zika病毒感染發(fā)生國，或疫情預計會大面積爆發(fā)的國家或地區(qū)，當?shù)氐膰H游客數(shù)量料將驟減，其旅游業(yè)將因此損失639億美元。我國地緣遼闊，夏季蚊蟲滋生，為該疾病的傳播創(chuàng)造了有利條件。

Zika病毒核酸為單股正鏈RNA，長10.8kb，編碼一個前體蛋白，經(jīng)病毒和宿主蛋白酶切割成3個結構蛋白(C、prM/M和E)和7個非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。Zika病毒與登革熱病毒同屬于黃病毒科病毒，二者的核酸和蛋白同源性較高，目前國內(nèi)外對登革熱病毒研究報道較多，Beth-Ann G.Coller等采用昆蟲細胞表達登革熱E蛋白，接種小鼠和非人靈長類動物均表現(xiàn)出較好的免疫原性，攻毒試驗表明該蛋白具有較好保護力，具有成為登革熱病毒亞單位疫苗的潛力。此外，Zika病毒非結構蛋白，例如NS1、NS3和NS5等在病毒黏附、侵入和復制等過程中發(fā)揮重要作用。

Zika病毒感染已經(jīng)成為影響人們健康的重要公共衛(wèi)生因素，該疾病沒有特效治療方法，且尚沒有商品化的疫苗，E蛋白結構域Ⅲ被認為是研發(fā)Zika疫苗的最佳候選蛋白，Kim MY和Poddar A等人研究均表明登革熱病毒E蛋白結構域Ⅲ能刺激動物機體產(chǎn)生較高滴度保護性抗體，具有制備登革熱病毒重組亞單位疫苗的潛力(Kim MY,Kim BY,Oh SM,Reljic R,Jang YS,Yang MS.Oral immunisation of mice with transgenic rice calli expressing cholera toxin B subunit fused to consensus dengue cEDIII antigen induces antibodies to all four dengue serotypes.Plant Mol Biol.2016Oct；92(3):347-56.Poddar A,Ramasamy V,Shukla R,Rajpoot RK,Arora U,Jain SK,Swaminathan S,Khanna N.Virus-like particles derived from Pichia pastoris-expressed dengue virus type 1glycoprotein elicit homotypic virus-neutralizing envelope domain III-directed antibodies.BMC Biotechnol.2016Jun 14；16(1):50.)。文獻報道表明，帶有IgG1Fc標簽的融合蛋白可增強融合蛋白的免疫原性，其原理可能是延長了融合蛋白的半衰期或者增加了表達FcR抗原遞呈細胞的攝入。另外，人IgG1Fc片段是人體自身成分，作為疫苗成分時發(fā)生免疫排異的風險較低。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種重組HEK-293T細胞，該重組HEK-293T細胞可穩(wěn)定分泌表達抗寨卡病毒的融合蛋白。

本發(fā)明解決上述問題的技術方案如下：

一種重組HEK-293T細胞，其特征在于，該重組HEK-293T細胞是以HEK-293T細胞為宿主轉(zhuǎn)染外源融合基因獲得，其中所述的外源融合基因的核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

上述重組HEK-293T細胞由如下方法制得：

(1)分別從GenBank中獲取ZIKA病毒E蛋白結構域III(錄入號為KU955594.1)和人IgG1Fc(錄入號為JN222933.1)的核苷酸序列，并將二者采用柔性肽(GGGS)₃連接，然后進行密碼子優(yōu)化，得到如SEQ.ID.NO.1所示的融合基因；將所得到的融合基因的起始端和終止端密碼子分別進行酶切，然后克隆至載體pMD19-T中，得到重組載體命pMD19-ZDIII-hFc；

(2)先取FUGW質(zhì)粒用PacⅠ酶切后補平再用BamHⅠ酶切回收載體大片段，再取pCDNA3.0質(zhì)粒先用BglⅡ酶切后補平再用BamHⅠ酶切后回收CMV啟動子，然后用Roche ligation kit將所回收的載體大片段和CMV啟動子連接后得到慢病毒表達質(zhì)粒pLV-CMV-EGFP；

(3)將慢病毒表達質(zhì)粒pLV-CMV-EGFP雙酶切回收大片段，再將pMD19-ZDIII-hFc雙酶切回收核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的融合基因ZDⅢ-hFc，然后將所回收的大片段與融合基因ZDⅢ-hFc在T4DNA連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化stab3感受態(tài)細胞后涂布含氨芐的LB平板，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落擴增培養(yǎng)并提取得到慢病毒重組載體pLV-CMV-EGFP-ZDⅢ-hFc；

(4)將所述慢病毒重組載體pLV-CMV-EGFP-ZDⅢ-hFc與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，即得重組HEK-293T細胞。

所述的重組HEK-293T細胞可穩(wěn)定分泌表達寨卡病毒與人源IgG1Fc融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的融合蛋白具有抗寨卡病毒生物活性。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、現(xiàn)有技術大多采用原核表達或酵母表達蛋白，上述方法制備的蛋白與天然蛋白在高級結構方法存在較大差異，本發(fā)明所選用的表達系統(tǒng)為HEK-293T細胞，得到的重組HEK-293T細胞具有與親本細胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的規(guī)模生產(chǎn)；表達蛋白在表達細胞內(nèi)能得到接近病毒蛋白的天然構象與修飾加工，抗原性好；重組細胞可以用轉(zhuǎn)瓶高密度發(fā)酵培養(yǎng)，易于大量生產(chǎn)。

2、本發(fā)明在對Zika病毒基因哺乳動物細胞密碼子偏嗜性基礎上，首次利用慢病毒表達系統(tǒng)表達E蛋白結構域Ⅲ與人源IgG1Fc融合蛋白，該融合蛋白中的Zika病毒E蛋白結構域Ⅲ與人源IgG1Fc蛋白之間通過柔性肽(GGGS)₃連接，有利于后期純化。

3、本發(fā)明的重組表達細胞系可以利用無血清培養(yǎng)基或低血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)表達，可以降低疫苗生產(chǎn)成本；

4、本發(fā)明抗原表達量高，利用普通細胞培養(yǎng)瓶皿培養(yǎng)，產(chǎn)量可達110mg/L。

附圖說明

圖1為慢病毒重組載體pLV-CMV-EGFP-ZDIII-hFc構建示意圖。

圖2為慢病毒重組載體pLV-CMV-EGFP-ZDIII-hFc酶切鑒定的電泳圖，圖中M為marker，1為挑選克隆。

圖3為Western blot鑒定不同陽性克隆細胞中Zika病毒E蛋白結構域Ⅲ與人源IgG1Fc融合蛋白表達情況的電泳圖；圖中，條帶1、2、3、4為隨機挑選的四個重組陽性克隆細胞。

圖4為重組細胞系HEK-293T-ZDⅢ-hFc不同代次細胞目的蛋白表達Western Blot電泳圖；圖中，條帶1為陰性對照，條帶2-9分別為第1、5、10、15、20，25，30，35代細胞培養(yǎng)上清Western Blot電泳結果。

圖5為不同代次重組HEK-293T細胞表達的融合基因的RT-PCR電泳圖；圖中，M為Marker DL2000，條帶1為陰性對照，條帶2-9分別為第1、5、10、15、20，25，30，35代HEK-293T細胞表達的融合基因的RT-PCR結果。

圖6為本發(fā)明所述融合蛋白純化的吸光度圖譜。

圖7為本發(fā)明所述融合蛋白純化各步留樣的電泳圖；圖中，條帶1為上樣前樣品；條帶2為流穿峰樣品；條帶3為洗脫峰樣品。

具體實施方式

實施例所涉及的材料及其來源如下所示：

HEK-293T細胞由廣州伯尼茲生物科技有限公司保存；

stab3感受態(tài)細胞購自廣州復能基因有限公司；

DL 2000Marker、DL 3000Marker、DL 5000Marker、DL10000Marker、Premix Ex Taq和去磷酸化試劑盒購自Takara公司；限制性內(nèi)切酶Sal I﹑Xho I﹑BamH I﹑Nhe I、MluⅠ、T4DNA連接酶均為NEB公司產(chǎn)品；預染蛋白Marker購自SunShineBio公司；牛血清白蛋白和瓊脂糖購自Amresco公司；二氨基聯(lián)苯胺購自上海邁瑞爾化學技術有限公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自OMEGA公司；二甲基亞砜、聚凝胺購自Sigma公司；胰蛋白胨及酵母提取物為Oxiod公司產(chǎn)品；0.25％胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基及南美胎牛血清為Hyclon公司產(chǎn)品，Zika多克隆抗體購自美國Kerafast公司。

實施例1(重組細胞系的構建及檢測)

1、編碼Zika病毒結構域Ⅲ與人源IgG1Fc基因序列設計及制備

1.1編碼Zika病毒結構域Ⅲ與人源IgG1Fc的基因序列設計

在Zika病毒Bahia03株(GenBank:ANA85188.1)基因的基礎上進行序列優(yōu)化和表達設計，在起始密碼子前加有Kozak序列與Nhe I酶切位點與保護性堿基，在E蛋白結構域Ⅲ基因與人源IgG1Fc編碼末端加有終止子與MluI酶切位點；得到的E蛋白結構域Ⅲ與人源IgG1Fc的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.2為SEQ ID NO.1翻譯后的氨基酸序列。

1.2編碼Zika病毒E蛋白結構域Ⅲ與人源IgG1Fc基因序列合成

Zika病毒E蛋白結構域Ⅲ與人源IgG1Fc基因序列由中美太和生物技術有限公司合成，具體方法如下，從GenBank中獲取ZIKA病毒E蛋白結構域III(Accession:KU955594.1)與人IgG1Fc(Accession:JN222933.1)核苷酸序列，兩個序列間采用柔性肽(GGGS)₃連接，采用JCat軟件對序列進行哺乳細胞表達進行密碼子優(yōu)化，得到SEQ.ID.NO.1，化學合成方法得到上述序列，在該序列5’端起始密碼子前加入Nhe I酶切位點，3’端終止密碼子后加入Mlu I酶切位點，將其克隆至商品化載體pMD19-T(Takara，lot No.D104A)中，重組載體命名為pMD19-ZDIII-hFc。

2、慢病毒重組載體的構建及檢測

慢病毒表達質(zhì)粒pLV-CMV-EGFP的獲得：將FUGW質(zhì)粒用PacⅠ酶切后補平再用BamHⅠ酶切回收載體大片段；將pCDNA3.0質(zhì)粒先用BglⅡ酶切后補平再用BamHⅠ酶切后回收CMV啟動子，再用Roche ligation kit將上述回收的載體大片段和CMV啟動子連接后得到慢病毒表達質(zhì)粒pLV-CMV-EGFP。

將上述慢病毒表達質(zhì)粒pLV-CMV-EGFP用Nhe I和MluⅠ酶切處理回收大片段，然后與經(jīng)Nhe I和MluⅠ酶切回收的ZDⅢ-hFc基因在T4DNA連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化stab3感受態(tài)細胞后涂布含氨芐的LB平板，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落擴增培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用菌落PCR及Nhe I和MluⅠ酶切對其進行鑒定，鑒定的陽性質(zhì)粒即為本實施例所需慢病毒重組載體，將其命名為pLV-CMV-EGFP-ZDⅢ-hFc。

上述FUGW質(zhì)粒、pCDNA3.0質(zhì)粒和Roche ligation kit均為市售。

上述含氨芐的LB平板，其培養(yǎng)基配方為100mL：胰化蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化鈉1g、瓊脂1.5g，加蒸餾水溶解，高壓滅菌20min，待液體冷卻到55℃加入氨芐，搖勻后立刻倒板；所述氨芐濃度為100mg/mL，加入量為每100mL培養(yǎng)基加入100ul氨芐。

本實施例慢病毒重組載體的構建示意圖如圖1所示，提取的重組質(zhì)粒經(jīng)Nhe I和MluⅠ酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)有兩條帶，酶切產(chǎn)物電泳帶型與預期結果一致(見圖2)。

3、慢病毒包裝及滴度檢測

3.1、細胞鋪板

細胞鋪板采用本領域技術人員的常規(guī)操作，具體步驟如下所示：

倒掉HEK-293T細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)上清，用1-3ml PBS洗滌一遍，吸凈；加入1ml 0.25％的胰酶，室溫作用1-2min；待細胞都變圓，加入2-3ml DMEM完全培養(yǎng)基把細胞吹打下來，收集到離心管中，1000rpm離心5min，棄上清；用DMEM完全培養(yǎng)基將細胞沉淀充分重懸，使細胞形成單細胞懸液；

向100mm細胞培養(yǎng)皿加入10ml DMEM完全培養(yǎng)基，用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，每個皿約加入6×10⁶細胞，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。

DMEM完全培養(yǎng)基的配方為：含10％FBS、100U/ml的青霉素和0.1mg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基(Corning cellgro,USA,lot number 10-013-CVR-500ml)。

細胞狀態(tài)對于病毒包裝至關重要，細胞生長良好的狀態(tài)有利于病毒包裝，因此需要保證良好的細胞狀態(tài)。

3.2慢病毒包裝及感染

所述慢病毒包裝就是將之前制備的慢病毒重組載體pLV-CMV-EGFP-ZDⅢ-hFc與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞HEK-293T，轉(zhuǎn)染方法采用PEI(聚乙烯亞胺)方法，具體步驟如下所示。

3.2.1轉(zhuǎn)染體系

所述PEI轉(zhuǎn)染法為本領域技術人員的常規(guī)操作，其轉(zhuǎn)染體系分為A液和B液，具體如下所示：

A液

PEI儲存液 24μl；

1×HBS 補至1ml；

B液

上述PEI儲存液的配方是：稱取1.25mg PEI粉末溶解于50ml×HBS(pH7.4)中，0.2μm濾膜過濾，儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

上述1×HBS的配方為：將8.76g NaCl溶解于900ml超純水，加入20ml 1M的HEPES，調(diào)pH值到7.4，定容至1L，0.2μm濾膜過濾后儲存于4℃?zhèn)溆?。上述慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒gag/pol、Rev、VSVG購自Invitrogen公司(貨號：K4975-00)，這些包裝質(zhì)粒提供了病毒基因組mRNA包裝成完整毒粒所必需的結構蛋白、聚合酶和包膜蛋白。

3.2.2轉(zhuǎn)染

細胞鋪板后第二天，待細胞融合度達到70％-90％時，將轉(zhuǎn)染體系的A液加入到B液，充分混勻，室溫靜置20min后，輕輕滴加到100mm皿的細胞培養(yǎng)上清中，輕晃培養(yǎng)皿混勻，放37℃，5％CO₂孵箱中培養(yǎng)48h后收集上清液，然后再向細胞培養(yǎng)皿中加入10ml DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集上清液，合并兩次上清液，然后3000rpm離心5min后去除細胞碎片，則得到所需病毒液。

將該病毒液取100μl用于檢測病毒滴度，其余的分裝后放于-80℃冰箱保存或用于后續(xù)的細胞感染。

3.3病毒滴度檢測

病毒滴度檢測采用RT-QPCR測定病毒滴度，其操作方法采用本領域技術人員的常規(guī)操作和所用試劑盒說明步驟即可，檢測結果顯示病毒滴度為1×10⁸copies/ml，說明病毒包裝成功，能感染細胞并將基因插入到細胞基因組中。

3.4、細胞感染

將上述得到的病毒液感染HEK293-T細胞，具體步驟如下所示：

將生長狀態(tài)良好的HEK293-T細胞消化計數(shù)后用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至1×10⁵/mL，加入24孔板，500μL/孔，準備2個復孔，放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；

在DMEM完全培養(yǎng)基中加入polybrene(聚凝胺)，制備含polybrene的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中Polybrene的終濃度為6-8μg/mL)；

將上述3.2.2制備的病毒液10μl加入到上述含polybrene的培養(yǎng)基中，使終體積為300μl并輕吹混勻，制備得到含病毒培養(yǎng)基；

將步驟1培養(yǎng)24h后的HEK293-T細胞的舊培養(yǎng)基倒掉，每個孔內(nèi)加入300μl含病毒培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4、基因穩(wěn)定分泌表達細胞系的建立

培養(yǎng)到第3-5天后，將長滿培養(yǎng)孔的細胞用胰酶消化后，用有限稀釋法傳代于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，15天后在倒置顯微鏡下觀察每孔細胞的克隆數(shù)目；

挑選含有1個細胞集落(即1個細胞團塊)的孔，將克隆細胞在24孔板中培養(yǎng)3d后，收集上清液，10倍濃縮后加入電泳上樣緩沖液制離心后吸取上清進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后采用5％脫脂奶(BioRad公司)封閉2h，采用抗Zika病毒多克隆抗體孵育過夜(美國Kerafast公司，1：10000稀釋)，TBST洗滌3次，每次10min，孵育HRP標記的兔抗人二抗(天根生化科技(北京)有限公司，1：10000稀釋)，37℃1h，之后曝光。

Western blotting結果如圖3所示。

結果表明我們篩選得到的4個克隆都能表達Zika病毒E蛋白結構域Ⅲ與人源IgG1Fc融合蛋白，重組蛋白大小約為40kD，但表達量有差異，我們選取表達量最高的4號細胞克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)后保存，并將其命名為HEK-293T-ZDⅢ-hFc，并且對其進行穩(wěn)定性檢測。

5、本發(fā)明重組細胞系的穩(wěn)定性檢測

5.1克隆細胞不同代次細胞的Western blotting鑒定

將上述篩選得到的重組細胞系HEK-293T-ZDⅢ-hFc正常傳代并收集不同代次(第1、5、10、15、20，25，30，35代)細胞培養(yǎng)上清進行Western blotting鑒定，鑒定結果如圖4所示，結果表明不同代次的細胞均能穩(wěn)定表達目的蛋白。

5.2克隆細胞不同代次細胞的RT-PCR鑒定

根據(jù)本領域常規(guī)技術和相關試劑盒說明書，采用RT-PCR對重組細胞系HEK-293T-ZDⅢ-hFc第1、5、10、15、20，25，30，35代細胞進行目的基因的擴增后，結果如圖5所示，重組細胞系HEK-293T-ZDⅢ-hFc的不同代次的細胞均能擴增出與理論大小一致的目的條帶，表明目的基因已穩(wěn)定融合于細胞基因組中，且遺傳穩(wěn)定。

從上述檢測結果可以看出，本實施例確實獲得能夠穩(wěn)定表達Zika病毒E蛋白結構域Ⅲ的重組細胞系HEK-293T-ZDⅢ-hFc。

實施例2(融合蛋白的純化)

1、Zika病毒E蛋白結構域Ⅲ與人源IgG1Fc融合蛋白純化

細胞培養(yǎng)上清經(jīng)0.45μm濾膜過濾，rProtein A Sepharose^TM Fast Flow層析膠柱與BioLogic LP蛋白純化儀正確連接后，用3倍柱床體積的上樣緩沖液(50mM pH7.0Tris)，1ml/min平衡柱子，將預處理的樣品以1ml/min的速度上樣，結束后用上樣緩沖液進行流洗，1ml/min，5倍柱床體積，隨后用1M pH3.0甘氨酸洗脫抗體，同時用BioLogic LP蛋白純化儀進行監(jiān)測，當觀察到基線上升，即出現(xiàn)洗脫峰時開始收集，并立即用1M，pH9.0的Tris-HCl調(diào)整洗脫液pH至7.0。收集洗脫液至洗脫峰回到基線后，繼續(xù)用上樣緩沖液平衡5-10倍柱床體積，流速調(diào)至1ml/min。再用20％乙醇平衡5倍柱床體積。

2、蛋白純化分析

收集蛋白純化各步留樣進行Western blotting分析，方法同實施例1中方法。由圖6可知，上樣時所監(jiān)測到第一個峰為非結合峰與第二個峰(目的蛋白峰)分離良好。Western blotting結果表明Zika病毒E蛋白結構域Ⅲ與人源IgG1Fc融合蛋白純化條件成熟，純化效率較高(見圖7)。