本發(fā)明涉及一種線粒體雙光子熒光粘度探針及其制備方法，是一種具有無(wú)毒性、對(duì)細(xì)胞線粒體專(zhuān)一識(shí)別且光穩(wěn)定性良好的雙光子吸收材料——乙烯基吡啶硝酸鹽衍生物。

背景技術(shù)：

線粒體(Mitochondria)是細(xì)胞存活的關(guān)鍵細(xì)胞器，產(chǎn)生超過(guò)90％的身體需要的能量以維持生命并支持生長(zhǎng)，在許多重要的生理過(guò)程，諸如細(xì)胞凋亡，分化，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和活性氧(ROS)的生成中發(fā)揮著不可缺少的作用。在細(xì)胞分裂和代謝的不同階段以及在細(xì)胞發(fā)育分化過(guò)程中，線粒體的大小、數(shù)量以及形態(tài)都會(huì)發(fā)生不同的變化。近年來(lái)的工作已經(jīng)表明，線粒體的形態(tài)和數(shù)量，與許多疾病相關(guān)，如神經(jīng)變性疾病帕金森氏病(Parkinson’s disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、中風(fēng)和癌癥，其中主要表現(xiàn)為由線粒體腫脹而表現(xiàn)出的粘度增加。因此，借助熒光探針觀察活細(xì)胞中成像線粒體的形態(tài)變化，了解線粒體在生物代謝過(guò)程中的作用，在疾病早期診斷和治療方面具有指導(dǎo)意義。

然而，目前已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的有機(jī)小分子線粒體探針，大多是通過(guò)熒光和磷光技術(shù)對(duì)線粒體數(shù)量及形態(tài)進(jìn)行成像分析，例如Rhodamine123，Mito GreenFM和Mito Red FM，它們主要分為依賴(lài)于線粒體膜電位的熒光探針以及非依賴(lài)性的線粒體探針，雖然這些染料能夠進(jìn)行活細(xì)胞成像，但是它們的細(xì)胞毒性大，光不穩(wěn)定，水溶性差，Stokes位移較小，不能對(duì)因疾病而產(chǎn)生的線粒體粘度增加進(jìn)行識(shí)別，從而限制了它們的使用。因此，開(kāi)發(fā)一種無(wú)毒、水溶性好、光穩(wěn)定性高的線粒體熒光探針具有重要的科學(xué)意義和明顯的應(yīng)用前景。

申請(qǐng)人對(duì)本申請(qǐng)的主題進(jìn)行了如下的文獻(xiàn)檢索：

1、scholar.glgoo.org網(wǎng)檢索結(jié)果：(2016/9/29)

2、中國(guó)知網(wǎng)檢索結(jié)果：

檢索方式一：

篇名-線粒體雙光子熒光粘度探針：無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)。

篇名-一種線粒體雙光子熒光粘度探針——乙烯基吡啶硝酸鹽衍生物及其制備方法：無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)。

檢索方式二：

全文-線粒體雙光子熒光粘度探針：無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)。

全文-一種線粒體雙光子熒光粘度探針——乙烯基吡啶硝酸鹽衍生物及其制備方法：無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種線粒體雙光子熒光粘度探針及其制備方法，是以碘甲烷、甲基吡啶、甲基羥乙基胺、對(duì)氟苯甲醛為原料，簡(jiǎn)單高效的合成了D-π-A構(gòu)型的有機(jī)吡啶硝酸鹽。本發(fā)明目標(biāo)分子具有良好的細(xì)胞親和性，能夠?qū)罴?xì)胞線粒體進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的雙光子成像，并能識(shí)別線粒體粘度變化。為跟蹤線粒體在細(xì)胞中的變化提供有效的可視化工具，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明線粒體雙光子熒光粘度探針為乙烯基吡啶硝酸鹽衍生物，其結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明線粒體雙光子熒光粘度探針的制備方法，包括如下步驟：

1、中間體1的合成

向50mL圓底燒瓶中加入碘甲烷(14.40g，100mmol)，攪拌下緩慢滴入溶于4mL乙醇的對(duì)甲基吡啶(6.20g，65mmol)，加熱至回流反應(yīng)20min，析出大量白色晶體，過(guò)濾，乙醇洗滌并干燥后得中間體1，14.60g，產(chǎn)率96％。

2、中間體2的合成

向500mL圓底燒瓶中加入DMSO(200mL)、甲基羥乙基胺(165g,2200mmol)、無(wú)水碳酸鉀(166g，1200mmol)以及3滴Aliquat-336，升溫至95℃反應(yīng)10min，再加入對(duì)氟苯甲醛(124g,1000mmol)，95℃下繼續(xù)反應(yīng)三天；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入冰水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，劇烈攪拌后收集水層，以NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至11，收集有機(jī)層，反復(fù)操作3次，用DCM萃取收集有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鎂干燥，除去溶劑后得中間體2，為淡黃色固體，142g，產(chǎn)率79％。

3、目標(biāo)產(chǎn)物B1的合成

向100mL圓底燒瓶中加入中間體2(1.80g，10mmol)、中間體1(2.40g，20mmol)、30mL無(wú)水乙醇和3滴哌啶，60℃下攪拌反應(yīng)24h，得深紅色溶液；向所述深紅色溶液中滴加含有AgNO₃(1.70g,10mmol)的30mL無(wú)水乙醇溶液，回流反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，過(guò)濾，乙醇洗滌并干燥，再用DCM重結(jié)晶，有紅色晶體析出，得目標(biāo)產(chǎn)物2.00g，產(chǎn)率60％。

4、本發(fā)明目標(biāo)分子B1的生物成像研究

在活細(xì)胞共聚焦成像中，低濃度(1-10μmol)的目標(biāo)分子B1與人類(lèi)肝癌細(xì)胞HepG2在10分鐘的共培養(yǎng)后，PBS緩沖溶液清洗2-3遍，再與500nM的Mitotracker Far Red培養(yǎng)10分鐘。通過(guò)雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)分子和線粒體商業(yè)染料Mitotracker Far Red很好的重合，并具有響應(yīng)線粒體粘度(viscosity)變化的作用。

與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

1、本發(fā)明合成的乙烯基吡啶硝酸鹽B1是一種具有生物顯影功能的雙光子吸收有機(jī)小分子材料，能夠識(shí)別活體細(xì)胞中線粒體粘度的變化，可以作為線粒體雙光子熒光粘度探針；

2、與文獻(xiàn)報(bào)道或商品染料相比，本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)物B1具有雙光子吸收特征，對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷、水溶性好、光穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，且具有明顯的應(yīng)用價(jià)值；

3、本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)物B1能夠?qū)Ｒ粚?duì)線粒體進(jìn)行顯影，并且其極低的細(xì)胞毒性以及極高的光穩(wěn)定性可適用于長(zhǎng)時(shí)間追蹤線粒體在活細(xì)胞中的形態(tài)及粘度變化。

4、本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)物B1是一類(lèi)新型線粒體染料。

5、本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)物B1的原料易得、合成路線簡(jiǎn)短，合成條件溫和。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物B1的晶體結(jié)構(gòu)圖，說(shuō)明B1是有明確結(jié)構(gòu)的新物質(zhì)。

圖2是本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物B1的水溶性測(cè)試，說(shuō)明B1具有優(yōu)異的水溶性。

圖3是本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物B1對(duì)HepG-2及3T3的細(xì)胞增值活性影響的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果，表明B1對(duì)兩種細(xì)胞無(wú)毒，具有良好的生物相容性。

圖4是本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物B1的單、雙光子顯影及3D成像圖，(a)單光子(b)雙光子(c)重疊圖(d)三維成像，表明B1能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并具有單、雙光子顯影的功能。

圖5是本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物B1與商業(yè)染料Mitotracker Far Red共定位的顯影圖，pearson’s Rr＝0.8921說(shuō)明了B1與商業(yè)染料MTFR有著高度的重合。

圖6是本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物B1在HepG-2細(xì)胞中線粒體的顯影圖與細(xì)胞內(nèi)熒光成像區(qū)域的微粘度梯度分布圖像，表明B1具有響應(yīng)線粒體粘度(viscosity)變化的作用。

圖7是本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物B1對(duì)不同種類(lèi)細(xì)胞的成像區(qū)域的微粘度梯度分布圖像，說(shuō)明B1可以作為線粒體雙光子熒光粘度探針，具有廣泛的應(yīng)用性。

圖8是本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物B1在0-72h內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的顯影，說(shuō)明了該化合物光穩(wěn)定性高，可用于長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞的線粒體進(jìn)行追蹤。

具體實(shí)施方式

本實(shí)施例中線粒體雙光子熒光粘度探針的制備及生物顯影方法如下：

1、中間體1的合成

向50mL圓底燒瓶中加入碘甲烷(14.40g，100mmol)，攪拌下緩慢滴入溶于4mL乙醇的對(duì)甲基吡啶(6.20g，65mmol)，加熱至78℃回流反應(yīng)20min，析出大量白色晶體，過(guò)濾，乙醇洗滌并干燥后得中間體1，14.60g，產(chǎn)率96％。

2、中間體2的合成

向500mL圓底燒瓶中加入DMSO(200mL)、甲基羥乙基胺(165g,2200mmol)、無(wú)水碳酸鉀(166g，1200mmol)以及3滴Aliquat-336，升溫至95℃反應(yīng)10min，再加入對(duì)氟苯甲醛(124g,1000mmol)，95℃下繼續(xù)反應(yīng)三天；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入冰水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，劇烈攪拌后收集水層，以NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至11，收集有機(jī)層，反復(fù)操作3次，用DCM萃取收集有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鎂干燥，除去溶劑后得中間體2，為淡黃色固體，142g，產(chǎn)率79％。

3、目標(biāo)產(chǎn)物的合成

向100mL圓底燒瓶中加入中間體2(1.80g，10mmol)、中間體1(2.40g，20mmol)、30mL無(wú)水乙醇和3滴哌啶，加熱至60℃攪拌反應(yīng)24h，得深紅色溶液；向所述深紅色溶液中滴加含有AgNO₃(1.70g,10mmol)的30mL無(wú)水乙醇溶液，回流反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻，過(guò)濾，乙醇洗滌并干燥，再用DCM重結(jié)晶，有紅色晶體析出，得目標(biāo)產(chǎn)物2.00g，產(chǎn)率60％。

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ＝8.67(d,2H),8.02(d,2H),7.89(d,1H),7.56(d,2H),7.14(d,1H),6.79(d,2H),4.76(s,1H),4.17(s,3H),3.53(d,4H),3.03(d,3H).

¹³C NMR(101MHz,d₆-DMSO)δ＝153.34,151.06,144.25,141.38,130.20,122.04,116.77,111.67,58.14,53.83,46.25,38.70.

Anal.Calcd.for C₁₇H₂₁N₃O₄:C,61.62；H,6.39；N,12.68％.Found:C,56.08；H,7.052；N,11.64％.IR(KBr,cm^-1):3390(m),2925(w),1640(m),1584(s),1518(s),1377(vs),1176(s),1040(w),818(w),535(m).

M.p.＝120℃.ESI:m/z,cal:269.36,found:269.42[M⁺]

4、本發(fā)明目標(biāo)分子B1的生物成像研究

在活細(xì)胞共聚焦成像中，低濃度(1-10μmol)的目標(biāo)分子B1與人類(lèi)肝癌細(xì)胞HepG2在10分鐘的共培養(yǎng)后，PBS緩沖溶液清洗2-3遍，再與500nM的Mitotracker Far Red培養(yǎng)10分鐘。通過(guò)雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)分子和線粒體商業(yè)染料Mitotracker Far Red很好的重合，并具有響應(yīng)線粒體粘度(viscosity)變化的作用。