本發(fā)明屬于富里酸的分離提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用無(wú)機(jī)酸堿及大孔徑樹(shù)脂提取藻體中富里酸的方法。
背景技術(shù)：
富里酸(fulvic acid)是一種天然大分子有機(jī)混合物，廣泛存在于水體、土壤和沉積物中。研究表明，富里酸中含有羥基、羧基和羰基等多種官能團(tuán)，因此具有較強(qiáng)的絡(luò)合、吸附-氧化還原能力，它能與環(huán)境中的痕量有毒金屬離子，N、P等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及有機(jī)污染物等發(fā)生相互作用，從而影響其在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化、毒性的生物有效性及其歸宿。因此，加深對(duì)富里酸的研究，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及重金屬、有機(jī)物的環(huán)境行為研究具有一定的積極作用。
傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，富里酸來(lái)自于動(dòng)植物殘?bào)w的物理、化學(xué)和生物降解。最新研究表明水生藻體植物活體中也含有大量的富里酸。水藻藻體作為一種重要的水生植物，研究其中富里酸的含量及結(jié)構(gòu)，將對(duì)重新認(rèn)識(shí)水環(huán)境中物質(zhì)和能量循環(huán)具有重要意義。
一般來(lái)說(shuō)，對(duì)水體和土壤富里酸提取方法研究較多。例如華中科技大學(xué)的李會(huì)杰在其碩士學(xué)位論文《腐殖酸和富里酸的提取與表征研究》(2012年)中對(duì)從不同季節(jié)不同湖泊采集到的底泥中提取到的腐殖酸和富里酸的提取方法及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了討論，其中采用氫氧化鈉和焦磷酸鈉的混合溶液提取其中的腐殖酸和富里酸的混合物，分離后分別對(duì)其進(jìn)行純化。申請(qǐng)人在之前的專(zhuān)利申請(qǐng)文件《一種水體中富里酸亞組分的分級(jí)提取方法》(申請(qǐng)日2015.09.16，申請(qǐng)?zhí)?01510586450.8)中采用pH值呈梯度變化的焦磷酸鈉溶液提取水體中富里酸的亞組分。專(zhuān)利申請(qǐng)文件《一種活性炭分離富集土壤中富里酸的方法》(申請(qǐng)日2015.09.16，申請(qǐng)?zhí)?01510586573.1)中先采用酸液、弱堿和強(qiáng)堿對(duì)土壤中的富里酸進(jìn)行提取，然后使用活性炭對(duì)其分離富集。
由于不同來(lái)源(土壤、沉積物、水體、藻體)的富里酸含量、物質(zhì)結(jié)構(gòu)存在差異。不同介質(zhì)中富里酸的賦存狀態(tài)不同，結(jié)合方式不同，存在的主要雜質(zhì)也不同。例如，相比水體、土壤和沉積物中的富里酸，藻體中富里酸中含有更多的脂肪、蛋白質(zhì)及聚糖類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)與富里酸結(jié)構(gòu)相似，上述方法并無(wú)法直接應(yīng)用于提取藻體中的富里酸。再者藻體中富里酸的含量極少，目前還沒(méi)一個(gè)統(tǒng)一、有效的分離方法。只有少數(shù)研究者在提取藻體腐殖酸中產(chǎn)生部分廢液可以看做粗品富里酸溶液。例如，Ghabbour EA等人于1994年發(fā)表在《應(yīng)用藻類(lèi)學(xué)雜志》(Journal of Applied Phycology)第6期第459-468頁(yè)上的《從褐藻間囊藻中分離提取腐殖酸》(Isolation of humic acid from the brown alga Pilayella littoralis)；以及Radwan A等人于1997年發(fā)表在《應(yīng)用藻類(lèi)學(xué)雜志》(Journal of Applied Phycology)第8期第553-562頁(yè)上的《從球型褐藻、墨角藻和糖昆布三種褐藻類(lèi)及海生被子植物大葉藻中分離提取腐殖酸》(Isolation of humic acid from the brown algae Ascophyllum nodosum,Fucus vesiculosus,Laminaria saccharina and the marine angiosperm Zostera marina)。最近中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院的林櫻在其碩士學(xué)位論文《土壤、沉積物以及藍(lán)藻中有機(jī)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取與表征》(2011年)中第19-20頁(yè)對(duì)太湖藍(lán)藻有機(jī)質(zhì)提取，采用傳統(tǒng)方法提取藻類(lèi)植物中的富里酸。Ghabbour EA、Radwan A及林櫻等研究組采用的方法主要包括以下步驟：藻體預(yù)處理、藻體索氏提取、藻體氯化鈣及酸洗、藻體碳酸鈉處理、藻體堿液提取、藻體富里酸除硅、藻體腐殖酸與富里酸分離等。但該方法存在以下問(wèn)題：1)藻體索氏提取過(guò)程中需要用到乙醚、丙酮、乙醇、二氧雜環(huán)己烷等多種易燃易爆有機(jī)溶劑，操作安全性差；2)整個(gè)索氏提取過(guò)程一般耗時(shí)約240-360小時(shí)，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)；3)索氏提取使用大量有機(jī)溶劑，處理處置耗費(fèi)物力和財(cái)力，如果處理不當(dāng)極易造成環(huán)境污染；4)目前方法多為從藻體中提取腐殖酸，而富里酸作為雜質(zhì)溶液，關(guān)于提取高純度藻體富里酸固體樣品的報(bào)道少，步驟不清晰。因此，如何能克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，快速、高收率地提取藻體中的富里酸，是研究藻類(lèi)植物中富里酸的首要問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中提取藻體中富里酸的方法中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供利用無(wú)機(jī)酸堿及大孔徑樹(shù)脂快速、高收率地提取藻體中富里酸的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了利用無(wú)機(jī)酸堿及大孔徑樹(shù)脂提取藻體中富里酸的方法，該方法包括以下步驟：
a、酸洗藻體植物粉末
向藻體植物粉末中加入去離子水，用鹽酸調(diào)節(jié)得到pH＝1.0-3.0，固液比為1:8-10的固液混合物A，攪拌后靜置，離心，得上層清液1和固體沉淀1；
b、焦磷酸鈉提取富里酸
1)向固體沉淀1中加入去離子水，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)得到pH＝6.0-8.0，固液比為1:3-5的固液混合物B；
2)向固液混合物B中加入焦磷酸鈉溶液，得到固液比為1:8-10且焦磷酸鈉的濃度為0.05-0.2mol/L的固液混合物，攪拌后靜置，離心，得上層清液2和固體沉淀2；
3)重復(fù)步驟b1)和b2)對(duì)固體沉淀2進(jìn)行提取1-3次，并將上層清液2與每次得到的上層清液合并，得上層清液3和固體沉淀3；
4)向上層清液3中加入鹽酸使其pH＝1.0-2.0，攪拌后靜置，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸1；
c、氫氧化鈉提取富里酸
1)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向固體沉淀3中加入氫氧化鈉溶液，得到固液比為1:8-10且氫氧化鈉的濃度為0.1-0.3mol/L的固液混合物C，攪拌后靜置，離心，得下層固體沉淀4和上層清液4；
2)重復(fù)步驟c1)，對(duì)固體沉淀4進(jìn)行1-3次提取，并將上層清液4與每次得到的上層清液合并，得上層清液5；
3)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上層清液5中加入鹽酸使其pH＝1.0-2.0，攪拌后靜置，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸2；
4)合并上層清液1、粗提富里酸1和粗提富里酸2，標(biāo)記為富里酸粗提液；
d、XAD-4樹(shù)脂純化富里酸
將富里酸粗提液通過(guò)XAD-4樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為富里酸XAD-4純化液。
優(yōu)選地，步驟a中的藻體植物粉末經(jīng)過(guò)以下預(yù)處理步驟：置于陰涼處風(fēng)干，剔除雜物，在45-65℃下烘干，碾磨后過(guò)50-200目篩，得到藻體植物粉末。
優(yōu)選地，富里酸粗提液通過(guò)XAD-4樹(shù)脂柱的流速為12-18BV/h。
優(yōu)選地，所述方法中的攪拌后靜置步驟中，攪拌時(shí)間為3-5h，靜置時(shí)間為20-26h。
優(yōu)選地，所述方法還包括步驟e：對(duì)得到的富里酸XAD-4純化液進(jìn)行除硅、富集、除鹽及干燥，得固態(tài)富里酸。
進(jìn)一步優(yōu)選地，除硅的具體操作為：向富里酸XAD-4純化液中加入氫氟酸溶液，使溶液中氫氟酸的濃度為0.2-0.5mol/L，攪拌后靜置，離心，得上層清液標(biāo)記為無(wú)硅富里酸溶液。
進(jìn)一步優(yōu)選地，富集的具體操作為：將無(wú)硅富里酸溶液以12-18BV/h的流速通過(guò)XAD-8樹(shù)脂柱，棄去流出液；
用0.5-2BV去離子水以12-18BV/h的流速?zèng)_洗樹(shù)脂柱，棄去流出液；
在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，依次用1-3BV的0.1mol/L氫氧化鈉溶液和2-3BV的去離子水以3-5BV/h的流速淋洗樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為含鹽富里酸溶液。
進(jìn)一步優(yōu)選地，除鹽及干燥的具體操作為：將含鹽富里酸溶液以12-18BV/h的流速通過(guò)氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，得到的流出液即為無(wú)鹽富里酸，將無(wú)鹽富里酸冷凍干燥，得到固態(tài)富里酸粉末。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，該方法還包括步驟f：取得到的固態(tài)富里酸粉末在80-100℃下烘干20-40h后，在500-600℃下灼燒4-6h，然后測(cè)定固態(tài)富里酸粉末的灰分；
如果固態(tài)富里酸粉末中灰分質(zhì)量含量大于0.5％，則將固態(tài)富里酸粉末用0.1mol/L鹽酸溶解后作為XAD-4純化液，重復(fù)除硅、富集、除鹽及干燥步驟的操作，直到其灰分質(zhì)量含量小于0.5％。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，該方法還包括步驟g：取步驟f得到的固態(tài)富里酸粉末測(cè)定其磷含量，如果固態(tài)富里酸粉末中磷質(zhì)量含量大于0.1％，則將固態(tài)富里酸粉末用0.1mol/L鹽酸溶解后作為富里酸粗提液，重復(fù)XAD-4樹(shù)脂純化、除硅、富集、除鹽及干燥步驟的操作，直到磷質(zhì)量含量小于0.1％。
更進(jìn)一步詳細(xì)的，本發(fā)明公開(kāi)的利用無(wú)機(jī)酸堿及大孔徑樹(shù)脂提取藻體中富里酸的方法，所述方法包括以下步驟：
a、酸洗藻體植物粉末
向藻體植物粉末中加入去離子水，用鹽酸調(diào)節(jié)得到pH＝1.0，固液比為1:10的固液混合物A，攪拌后靜置，離心，得上層清液1和固體沉淀1；
b、焦磷酸鈉提取富里酸
1)向固體沉淀1中加入去離子水，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)得到pH＝7.0，固液比為1:4的固液混合物B；
2)向固液混合物B中加入焦磷酸鈉溶液，得到固液比為1:10且焦磷酸鈉的濃度為0.1mol/L的固液混合物，攪拌后靜置，離心，得上層清液2和固體沉淀2；
3)重復(fù)步驟b1)和b2)對(duì)固體沉淀2進(jìn)行提取1-3次，并將上層清液2與每次得到的上層清液合并，得上層清液3和固體沉淀3；
4)向上層清液3中加入6mol/L的鹽酸使其pH＝1.0，攪拌后靜置，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸1；
c、氫氧化鈉提取富里酸
1)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向固體沉淀3中加入氫氧化鈉溶液，得到固液比為1:10且氫氧化鈉的濃度為0.1mol/L的固液混合物C，攪拌后靜置，離心，得下層固體沉淀4和上層清液4；
2)重復(fù)步驟c1)，對(duì)固體沉淀4進(jìn)行提取1-3次，并將上層清液4與每次得到的上層清液合并，得上層清液5；
3)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上層清液5中加入6mol/L鹽酸使其pH＝1.0，攪拌后靜置，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸2；
4)合并上層清液1、粗提富里酸1和粗提富里酸2，標(biāo)記為富里酸粗提液；
d、XAD-4樹(shù)脂純化富里酸
將富里酸粗提液通過(guò)XAD-4樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為富里酸XAD-4純化液。
優(yōu)選地，步驟a中的藻體植物粉末經(jīng)過(guò)以下預(yù)處理步驟：置于陰涼處風(fēng)干，剔除雜物，在50℃下烘干，碾磨后過(guò)100目篩，得到藻體植物粉末。
優(yōu)選地，富里酸粗提液通過(guò)XAD-4樹(shù)脂柱的流速為15BV/h。
優(yōu)選地，所述方法中的攪拌后靜置步驟中，攪拌時(shí)間為4h，靜置時(shí)間為24h。
優(yōu)選地，所述方法還包括步驟e：對(duì)得到的富里酸XAD-4純化液進(jìn)行除硅、富集、除鹽及干燥，得固態(tài)富里酸。
進(jìn)一步優(yōu)選地，除硅的具體操作為：向富里酸XAD-4純化液中加入氫氟酸溶液，使溶液中氫氟酸的濃度為0.3mol/L，攪拌后靜置，離心，得上層清液標(biāo)記為無(wú)硅富里酸溶液。
進(jìn)一步優(yōu)選地，富集的具體操作為：將無(wú)硅富里酸溶液以15BV/h的流速通過(guò)XAD-8樹(shù)脂柱，棄去流出液；
用0.65V去離子水以15BV/h的流速?zèng)_洗樹(shù)脂柱，棄去流出液；
在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，依次用1BV的0.1mol/L氫氧化鈉溶液和2BV的去離子水以4BV/h的流速淋洗樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為含鹽富里酸溶液。
進(jìn)一步優(yōu)選地，除鹽及干燥的具體操作為：將含鹽富里酸溶液以15BV/h的流速通過(guò)氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，得到的流出液即為無(wú)鹽富里酸，將無(wú)鹽富里酸冷凍干燥，得到固態(tài)富里酸粉末。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，該方法還包括步驟f：取得到的固態(tài)富里酸粉末在100℃下烘干24h后，在550℃下灼燒5h，然后測(cè)定固態(tài)富里酸粉末的灰分；
如果固態(tài)富里酸粉末中灰分質(zhì)量含量大于0.5％，則將固態(tài)富里酸粉末用0.1mol/L鹽酸溶解后作為XAD-4純化液，重復(fù)除硅、富集、除鹽及干燥步驟的操作，直到其灰分質(zhì)量含量小于0.5％。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，該方法還包括步驟g：取步驟f得到的固態(tài)富里酸粉末測(cè)定其磷含量，如果固態(tài)富里酸粉末中磷質(zhì)量含量大于0.1％，則將固態(tài)富里酸粉末用0.1mol/L鹽酸溶解后作為富里酸粗提液，重復(fù)XAD-4樹(shù)脂純化、除硅、富集、除鹽及干燥步驟的操作，直到磷質(zhì)量含量小于0.1％。
其中，步驟a中對(duì)藻體植物粉末進(jìn)行酸洗，一方面能夠去除酸溶性的鈣、鎂、鐵、鋁等離子，減少了酸溶離子對(duì)提取富里酸步驟的干擾；另一方面，酸洗后，部分富里酸進(jìn)一步暴露出來(lái)，有利于對(duì)其進(jìn)行提取，此外，將酸洗后的上層清液與富里酸粗提液一起經(jīng)過(guò)XAD-4樹(shù)脂純化，減少了富里酸的損失。
步驟b和c中，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值，使富里酸可溶，而雜酸腐殖酸為沉淀，進(jìn)而去除雜酸而不損失富里酸；利用焦磷酸鈉和氫氧化鈉依次提取藻體中的富里酸，與單一用氫氧化鈉或焦磷酸鈉提取相比，提取更完全。
步驟d中，大孔徑樹(shù)脂XAD-4樹(shù)脂柱容易吸附水溶性的酸、堿及中性物質(zhì)，可以除去水溶性較強(qiáng)的多糖、非腐殖物質(zhì)及藻酸等雜質(zhì)；此外，相比現(xiàn)有技術(shù)中索氏提取的方法，利用XAD-4樹(shù)脂吸附柱純化富里酸，可以大大縮短提取富里酸的時(shí)間。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的提取藻體中富里酸的方法具有如下的積極效果：1)簡(jiǎn)化了提取工藝，縮短了提取時(shí)間，相比索氏提取法，僅純化步驟就可以縮短230-350個(gè)小時(shí)以上；2)本發(fā)明提供的富里酸提取方法為一種環(huán)保型方法，每1000g藻體減少有機(jī)溶劑用量約20-50L；3)所用XAD-4和XAD-8樹(shù)脂經(jīng)過(guò)處理后，可以重復(fù)使用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。這些實(shí)施例僅是出于解釋說(shuō)明的目的，而不限制本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)。其中，本發(fā)明所述的BV/h為倍柱體積每小時(shí)；BV為倍柱體積；所述的固液比為固體質(zhì)量與液體體積比。
實(shí)施例1
本實(shí)施例中，藻體樣品取自渤海海域藻體樣品；
XAD-4樹(shù)脂；
XAD-8樹(shù)脂；
氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，Amberlite IR-120；
氫氧化鈉、鹽酸和焦磷酸鈉均為分析純；
上述樹(shù)脂及試劑均購(gòu)自Sigma公司。
利用無(wú)機(jī)酸堿及大孔徑樹(shù)脂提取藻體中富里酸的方法，該方法包括如下步驟：
預(yù)處理步驟：
取水生藻類(lèi)植物，置于陰涼處風(fēng)干，剔除雜物，在50℃下烘干，碾磨后過(guò)100目篩，得到藻體植物粉末；
a、酸洗藻體植物粉末
向藻體植物粉末中加入去離子水，用鹽酸調(diào)節(jié)得到pH＝1.0，固液比為1:10的固液混合物A，攪拌4h后靜置24h，離心，得上層清液1和固體沉淀1；
b、焦磷酸鈉提取富里酸
1)向固體沉淀1中加入去離子水，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)得到pH＝7.0，固液比為1:4的固液混合物B；
2)向固液混合物B中加入焦磷酸鈉溶液，得到固液比為1:10且焦磷酸鈉的濃度為0.1mol/L的固液混合物，攪拌5h后靜置24h，離心，得上層清液2和固體沉淀2；
3)重復(fù)步驟b1)和b2)，對(duì)固體沉淀2進(jìn)行提取3次，并將上層清液2與每次得到的上層清液合并，得上層清液3和固體沉淀3；
4)向上層清液3中加入6mol/L的鹽酸使其pH＝1.0，攪拌4h后靜置24h，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸1；
c、氫氧化鈉提取富里酸
1)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向固體沉淀3中加入氫氧化鈉溶液，得到固液比為1:10且氫氧化鈉的濃度為0.1mol/L的固液混合物C，攪拌4h后靜置24h，離心，得下層固體沉淀4和上層清液4；
2)重復(fù)步驟c1)，對(duì)固體沉淀4進(jìn)行提取1次，將上層清液4與得到的上層清液合并，得上層清液5；
3)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上層清液5中加入6mol/L的鹽酸使其pH＝1.0，攪拌4h后靜置24h，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸2；
4)合并上層清液1、粗提富里酸1和粗提富里酸2，標(biāo)記為富里酸粗提液；
d、XAD-4樹(shù)脂純化富里酸
將富里酸粗提液以15BV/h的流速通過(guò)XAD-4樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為富里酸XAD-4純化液。
e、對(duì)所述的富里酸XAD-4純化液進(jìn)行除硅、富集、除鹽及干燥，得固態(tài)富里酸；
其中，所述除硅的具體操作為：向富里酸XAD-4純化液中加入氫氟酸溶液，使溶液中氫氟酸的濃度為0.3mol/L，持續(xù)攪拌4h后靜置24h，離心，得上層清液標(biāo)記為無(wú)硅富里酸溶液。
所述富集的具體操作為：將無(wú)硅富里酸溶液以15BV/h的流速通過(guò)XAD-8樹(shù)脂柱，棄去流出液；
用0.65BV去離子水以15BV/h的流速?zèng)_洗樹(shù)脂柱，棄去流出液；
在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，依次用1BV的0.1mol/L氫氧化鈉溶液和2BV的去離子水以4BV/h的流速淋洗樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為含鹽富里酸溶液。
所述除鹽及干燥的具體操作為：將含鹽富里酸溶液以15BV/h的流速通過(guò)氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，得到的流出液即為無(wú)鹽富里酸，將無(wú)鹽富里酸冷凍干燥，得到固態(tài)富里酸粉末。
f、取得到的固態(tài)富里酸粉末在100℃下烘干24h后，在550℃下灼燒5h，然后測(cè)定固態(tài)富里酸粉末的灰分；
如果固態(tài)富里酸粉末中灰分質(zhì)量含量大于0.5％，則將固態(tài)富里酸粉末用0.1mol/L鹽酸溶解后作為XAD-4純化液，重復(fù)除硅、富集和除鹽步驟的操作，直到其灰分質(zhì)量含量小于0.5％；
g、取步驟f所得的固態(tài)富里酸粉末測(cè)定其磷含量，如果固態(tài)富里酸粉末中磷質(zhì)量含量大于0.1％，則將固態(tài)富里酸粉末用0.1mol/L鹽酸溶解后作為富里酸粗提液，重復(fù)XAD-4樹(shù)脂純化、除硅、富集和除鹽步驟的操作，直到磷質(zhì)量含量小于0.1％。
采用上述方法，1000g藻體中提取得到9.8g富里酸，富里酸中的灰分質(zhì)量含量為0.1％。
本實(shí)施例中，最終得到富里酸，利用元素分析法和13C-NMR光譜分析法對(duì)富里酸進(jìn)行定量-半定量分析；利用FT-IR進(jìn)行定性分析，結(jié)果如下：
元素分析結(jié)果顯示，該方法提取的藻體富里酸中氫碳原子比為1.5和氧碳原子比0.8，符合國(guó)際富里酸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)富里酸元素含量要求。
13C-NMR光譜分析顯示，該方法提取的藻體富里酸包含飽和脂肪碳峰26％、芳香碳34％和羧基碳21％，這與國(guó)際富里酸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)富里酸一致。
FT-IR光譜分析顯示，該方法提取的藻體富里酸均包含羥基、烷基和羧基等官能團(tuán)，這與國(guó)際富里酸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)富里酸紅外光譜結(jié)論一致。
實(shí)施例2
利用無(wú)機(jī)酸堿及大孔徑樹(shù)脂提取藻體中富里酸的方法，該方法包括如下步驟：
a、酸洗藻體植物粉末
向藻體植物粉末中加入去離子水，用鹽酸調(diào)節(jié)得到pH＝1.0-3.0，固液比為1:8-10的固液混合物A，攪拌后靜置，離心，得上層清液1和固體沉淀1；
b、焦磷酸鈉提取富里酸
1)向固體沉淀1中加入去離子水，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)得到pH＝6.0-8.0，固液比為1:3-5的固液混合物B；
2)向固液混合物B中加入焦磷酸鈉溶液，得到固液比為1:8-10且焦磷酸鈉的濃度為0.05-0.2mol/L的固液混合物，攪拌后靜置，離心，得上層清液2和固體沉淀2；
3)重復(fù)步驟b1)和b2)對(duì)固體沉淀2進(jìn)行提取1-3次，并將上層清液2與每次得到的上層清液合并，得上層清液3和固體沉淀3；
4)向上層清液3中加入鹽酸使其pH＝1.0-2.0，攪拌后靜置，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸1；
c、氫氧化鈉提取富里酸
1)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向固體沉淀3中加入氫氧化鈉溶液，得到固液比為1:8-10且氫氧化鈉的濃度為0.1-0.3mol/L的固液混合物C，攪拌后靜置，離心，得下層固體沉淀4和上層清液4；
2)重復(fù)步驟c1)，對(duì)固體沉淀4進(jìn)行1-3次提取，并將上層清液4與每次得到的上層清液合并，得上層清液5；
3)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上層清液5中加入鹽酸使其pH＝1.0-2.0，攪拌后靜置，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸2；
4)合并上層清液1、粗提富里酸1和粗提富里酸2，標(biāo)記為富里酸粗提液；
d、XAD-4樹(shù)脂純化富里酸
將富里酸粗提液通過(guò)XAD-4樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為富里酸XAD-4純化液。
實(shí)施例3
本實(shí)施例中，藻體樣品取自東海海域藻體樣品；
XAD-4樹(shù)脂；
XAD-8樹(shù)脂；
氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，Amberlite IR-120；
氫氧化鈉、鹽酸和焦磷酸鈉均為分析純；
上述樹(shù)脂及試劑均購(gòu)自Sigma公司。
利用無(wú)機(jī)酸堿及大孔徑樹(shù)脂提取藻體中富里酸的方法，該方法包括如下步驟：
預(yù)處理步驟：
取水生藻類(lèi)植物，置于陰涼處風(fēng)干，剔除雜物，在45℃下烘干，碾磨后過(guò)200目篩，得到藻體植物粉末；
a、酸洗藻體植物粉末
向藻體植物粉末中加入去離子水，用鹽酸調(diào)節(jié)得到pH＝2.0，固液比為1:9的固液混合物A，攪拌5h后靜置20h，離心，得上層清液1和固體沉淀1；
b、焦磷酸鈉提取富里酸
1)向固體沉淀1中加入去離子水，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)得到pH＝6.0，固液比為1:3的固液混合物B；
2)向固液混合物B中加入焦磷酸鈉溶液，得到固液比為1:9且焦磷酸鈉的濃度為0.05mol/L的固液混合物，攪拌5h后靜置20h，離心，得上層清液2和固體沉淀2；
3)重復(fù)步驟b1)和b2)對(duì)固體沉淀2進(jìn)行提取1次，并將上層清液2與得到的上層清液合并，得上層清液3和固體沉淀3；
4)向上層清液3中加入6mol/L的鹽酸使其pH＝1.0-2.0，攪拌5h后靜置20h，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸1；
c、氫氧化鈉提取富里酸
1)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向固體沉淀3中加入氫氧化鈉溶液，得到固液比為1:9且氫氧化鈉的濃度為0.2mol/L的固液混合物C，攪拌5h后靜置20h，離心，得下層固體沉淀4和上層清液4；
2)重復(fù)步驟c1)，對(duì)固體沉淀4進(jìn)行1-3次提取，并將上層清液4與每次得到的上層清液合并，得上層清液5；
3)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上層清液5中加入6mol/L的鹽酸使其pH＝1.0-2.0，攪拌5h后靜置20h，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸2；
4)合并上層清液1、粗提富里酸1和粗提富里酸2，標(biāo)記為富里酸粗提液；
d、XAD-4樹(shù)脂純化富里酸
將富里酸粗提液以12BV/h的流速通過(guò)XAD-4樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為富里酸XAD-4純化液。
e、對(duì)所述的富里酸XAD-4純化液進(jìn)行除硅、富集、除鹽及干燥，得固態(tài)富里酸；
其中，所述除硅的具體操作為：向富里酸XAD-4純化液中加入氫氟酸溶液，使溶液中氫氟酸的濃度為0.2mol/L，持續(xù)攪拌5h后靜置20h，離心，得上層清液標(biāo)記為無(wú)硅富里酸溶液。
所述富集的具體操作為：將無(wú)硅富里酸溶液以12BV/h的流速通過(guò)XAD-8樹(shù)脂柱，棄去流出液；
用0.5BV去離子水以12BV/h的流速?zèng)_洗樹(shù)脂柱，棄去流出液；
在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，依次用2BV的0.1mol/L氫氧化鈉溶液和3BV的去離子水以3BV/h的流速淋洗樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為含鹽富里酸溶液。
所述除鹽及干燥的具體操作為：將含鹽富里酸溶液以12BV/h的流速通過(guò)氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，得到的流出液即為無(wú)鹽富里酸，將無(wú)鹽富里酸冷凍干燥，得到固態(tài)富里酸粉末。
f、取得到的固態(tài)富里酸粉末在90℃下烘干20h后，在600℃下灼燒4h，然后測(cè)定固態(tài)富里酸粉末的灰分；
如果固態(tài)富里酸粉末中灰分質(zhì)量含量大于0.5％，則將固態(tài)富里酸粉末用0.1mol/L鹽酸溶解后作為XAD-4純化液，重復(fù)除硅、富集和除鹽步驟的操作，直到其灰分質(zhì)量含量小于0.5％；
g、取步驟f所得的固態(tài)富里酸粉末測(cè)定其磷含量，如果固態(tài)富里酸粉末中磷質(zhì)量含量大于0.1％，則將固態(tài)富里酸粉末用0.1mol/L鹽酸溶解后作為富里酸粗提液，重復(fù)XAD-4樹(shù)脂純化、除硅、富集和除鹽步驟的操作，直到磷質(zhì)量含量小于0.1％。
采用上述方法，1000g藻體中提取得到10.3g富里酸，富里酸中的灰分質(zhì)量含量為0.5％。
本實(shí)施例中，最終得到富里酸，利用元素分析法和13C-NMR光譜分析法對(duì)富里酸進(jìn)行定量-半定量分析；利用FT-IR進(jìn)行定性分析，結(jié)果如下：
元素分析結(jié)果顯示，該方法提取的藻體富里酸中氫碳原子比為1.4和氧碳原子比0.6，符合國(guó)際富里酸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)富里酸元素含量要求。
13C-NMR光譜分析顯示，該方法提取的藻體富里酸包含飽和脂肪碳峰23％、芳香碳38％和羧基碳18％，這與國(guó)際富里酸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)富里酸一致。
FT-IR光譜分析顯示，該方法提取的藻體富里酸均包含羥基、烷基和羧基等官能團(tuán)，這與國(guó)際富里酸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)富里酸紅外光譜結(jié)論一致。
實(shí)施例4
本實(shí)施例中，藻體樣品取自黃海海域藻體樣品；
XAD-4樹(shù)脂；
XAD-8樹(shù)脂；
氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，Amberlite IR-120；
氫氧化鈉、鹽酸和焦磷酸鈉均為分析純；
上述樹(shù)脂及試劑均購(gòu)自Sigma公司。
利用無(wú)機(jī)酸堿及大孔徑樹(shù)脂提取藻體中富里酸的方法，該方法包括如下步驟：
預(yù)處理步驟：
取水生藻類(lèi)植物，置于陰涼處風(fēng)干，剔除雜物，在65℃下烘干，碾磨后過(guò)50目篩，得到藻體植物粉末；
a、酸洗藻體植物粉末
向藻體植物粉末中加入去離子水，用鹽酸調(diào)節(jié)得到pH＝3.0，固液比為1:8的固液混合物A，攪拌3h后靜置26h，離心，得上層清液1和固體沉淀1；
b、焦磷酸鈉提取富里酸
1)向固體沉淀1中加入去離子水，用鹽酸調(diào)節(jié)得到pH＝8.0，固液比為1:5的固液混合物B；
2)向固液混合物B中加入焦磷酸鈉溶液，得到固液比為1:8且焦磷酸鈉的濃度為0.2mol/L的固液混合物，攪拌3h后靜置26h，離心，得上層清液2和固體沉淀2；
3)重復(fù)步驟b1)和b2)對(duì)固體沉淀2進(jìn)行提取2次，并將上層清液2與每次得到的上層清液合并，得上層清液3和固體沉淀3；
4)向上層清液3中加入6mol/L的鹽酸使其pH＝1.0-2.0，攪拌3h后靜置26h，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸1；
c、氫氧化鈉提取富里酸
1)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向固體沉淀3中加入氫氧化鈉溶液，得到固液比為1:8且氫氧化鈉的濃度為0.3mol/L的固液混合物C，攪拌3h后靜置26h，離心，得下層固體沉淀4和上層清液4；
2)重復(fù)步驟c1)，對(duì)固體沉淀4進(jìn)行1-3次提取，并將上層清液4與每次得到的上層清液合并，得上層清液5；
3)在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上層清液5中加入6mol/L的鹽酸使其pH＝1.0-2.0，攪拌3h后靜置26h，離心，棄去下層固體沉淀，得上層清液并標(biāo)記為粗提富里酸2；
4)合并上層清液1、粗提富里酸1和粗提富里酸2，標(biāo)記為富里酸粗提液；
d、XAD-4樹(shù)脂純化富里酸
將富里酸粗提液以12BV/h的流速通過(guò)XAD-4樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為富里酸XAD-4純化液。
e、對(duì)所述的富里酸XAD-4純化液進(jìn)行除硅、富集、除鹽及干燥，得固態(tài)富里酸；
其中，所述除硅的具體操作為：向富里酸XAD-4純化液中加入氫氟酸溶液，使溶液中氫氟酸的濃度為0.5mol/L，持續(xù)攪拌3h后靜置26h，離心，得上層清液標(biāo)記為無(wú)硅富里酸溶液。
所述富集的具體操作為：將無(wú)硅富里酸溶液以18BV/h的流速通過(guò)XAD-8樹(shù)脂柱，棄去流出液；
用2BV去離子水以18BV/h的流速?zèng)_洗樹(shù)脂柱，棄去流出液；
在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，依次用3BV的0.1mol/L氫氧化鈉溶液和3BV的去離子水以5BV/h的流速淋洗樹(shù)脂柱，收集流出液，標(biāo)記為含鹽富里酸溶液。
所述除鹽及干燥的具體操作為：將含鹽富里酸溶液以18BV/h的流速通過(guò)氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，得到的流出液即為無(wú)鹽富里酸，將無(wú)鹽富里酸冷凍干燥，得到固態(tài)富里酸粉末。
f、取得到的固態(tài)富里酸粉末在80℃下烘干40h后，在500℃下灼燒6h，然后測(cè)定固態(tài)富里酸粉末的灰分；
如果固態(tài)富里酸粉末中灰分質(zhì)量含量大于0.5％，則將固態(tài)富里酸粉末用0.1mol/L鹽酸溶解后作為XAD-4純化液，重復(fù)除硅、富集和除鹽步驟的操作，直到其灰分質(zhì)量含量小于0.5％；
g、取步驟f所得的固態(tài)富里酸粉末測(cè)定其磷含量，如果固態(tài)富里酸粉末中磷質(zhì)量含量大于0.1％，則將固態(tài)富里酸粉末用0.1mol/L鹽酸溶解后作為富里酸粗提液，重復(fù)XAD-4樹(shù)脂純化、除硅、富集和除鹽步驟的操作，直到磷質(zhì)量含量小于0.1％。
采用上述方法，1000g藻體中提取得到10.9g富里酸，富里酸中的灰分質(zhì)量含量為0.4％。
本實(shí)施例中，最終得到富里酸，利用元素分析法和13C-NMR光譜分析法對(duì)富里酸進(jìn)行定量-半定量分析；利用FT-IR進(jìn)行定性分析，結(jié)果如下：
元素分析結(jié)果顯示，該方法提取的藻體富里酸中氫碳原子比為1.6和氧碳原子比0.7，符合國(guó)際富里酸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)富里酸元素含量要求。
13C-NMR光譜分析顯示，該方法提取的藻體富里酸包含飽和脂肪碳峰25％、芳香碳31％和羧基碳23％，這與國(guó)際富里酸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)富里酸一致。
FT-IR光譜分析顯示，該方法提取的藻體富里酸均包含羥基、烷基和羧基等官能團(tuán)，這與國(guó)際富里酸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)富里酸紅外光譜結(jié)論一致。
以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專(zhuān)利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍內(nèi)。