本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有同時(shí)高效脫硫脫氮活性的菌株篩選方法。

背景技術(shù)：

目前油田采出水處理回用主要對(duì)象為石油類、氨氮、硫化物：硫化物是造成油田注水系統(tǒng)和工業(yè)循環(huán)冷卻水中嚴(yán)重的腐蝕現(xiàn)象的主要因素之一；氨氮是引起水體富營(yíng)養(yǎng)化的物質(zhì)之一。

煉油廠汽提廢水中含有大量H₂S和NH₃，未經(jīng)處理直排入凈化水車間，勢(shì)必對(duì)常規(guī)生化系統(tǒng)造成沖擊，導(dǎo)致總排出水不合格排放；酸性水汽提裝置的水罐揮發(fā)氣體惡臭嚴(yán)重，且加劇了罐頂及附近設(shè)備的腐蝕。

生物脫硫工藝因去除率高、無需投加化學(xué)藥劑、可生成單質(zhì)硫回收礦質(zhì)資源、運(yùn)行費(fèi)用低、較少形成二次污染等優(yōu)點(diǎn)而日益受到關(guān)注，已成為國(guó)內(nèi)外去除硫化物及惡臭防治應(yīng)用中的主流方法；生物脫氮技術(shù)由于具有處理效果好，處理過程穩(wěn)定可靠，處理成本低，操作管理方便等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，為水體中氮的去除提供了有效手段。

目前的一些篩選方法得到的菌株可以實(shí)現(xiàn)對(duì)污水處理的脫硫或者脫氮，而針對(duì)同時(shí)含有硫和氮的廢水進(jìn)行脫硫和脫氮，目前，生物處理在水處理中的應(yīng)用主要集中在：1)好氧脫硫；2)厭氧脫硫；3)厭氧反硝。一方面增加了運(yùn)行成本，另一方面增加了設(shè)備以及原料投入，而同步脫硫脫氮成為一種全新的研究方向，還沒有關(guān)于利用生物處理同步脫氮脫硫，并將脫硫產(chǎn)物控制在單質(zhì)硫階段的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有同時(shí)高效脫硫脫氮活性的菌株篩選方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過如下措施實(shí)現(xiàn)的：一種具有同時(shí)高效脫硫脫氮活性的菌株篩選方法，包括以下步驟：第一步初篩、第二步純化分離、第三步生化培養(yǎng)和第四步增殖培養(yǎng)；

第一步初篩的程序?yàn)椋?/p>

取20-30g活性污泥放入盛有初篩培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入25-30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，保持恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為180-185轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)時(shí)間為4-5天；

初篩培養(yǎng)基由13-15g Na₂S₂O₃、7-9g KNO₃、5-6g (NH₄)₂HPO₄、20-1.5g MgCl2、5-6g NaHCO₃、1-1.5g半胱氨酸、25-30ml維生素營(yíng)養(yǎng)液和25-30ml微量元素營(yíng)養(yǎng)液混合，調(diào)節(jié)pH為7.0，并經(jīng)過120-121℃、18-20min的滅菌處理后得到；

第二步純化分離的程序?yàn)?

將第一步搖床培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿中的菌種接種至固體培養(yǎng)基，將接種菌種后的固體培養(yǎng)基放在25-30℃的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天；

固體培養(yǎng)基由12-15g Na₂S₂O₃、5-7g KNO₃、7-9g (NH₄)₂HPO₄、1-1.5g MgCl₂、6-7g NaHCO₃、1.3-1.5g半胱氨酸、10-12g瓊脂、0.1-0.15g活性炭、1.8-2g甘露糖、28-30ml維生素營(yíng)養(yǎng)液和28-30ml微量元素營(yíng)養(yǎng)液混合而成；

第三步生化培養(yǎng)的程序?yàn)椋?/p>

從經(jīng)過第二步的培養(yǎng)基中挑取劃線分離得到的單菌落分別放至初篩培養(yǎng)基中，在25-30℃、180-185轉(zhuǎn)/min的搖床培養(yǎng)8-10天，培養(yǎng)后取2ml菌液至放有100-150ml厭氧培養(yǎng)基的厭氧瓶中，然后將厭氧瓶放入25-30℃生化培養(yǎng)箱25-30天；再將厭氧瓶放至30℃厭氧培養(yǎng)罐中，培養(yǎng)25天，在培養(yǎng)的過程中充5min的N₂或持續(xù)沖N_2，得到菌株；

厭氧培養(yǎng)基由0.02-0.025g MnSO₄、10-12g Na₂S₂O₃、1-1.2g Na₂HPO₄、1.5-1.8g KH₂HPO₄、1-1.5g NaHCO₃、0.4-0.5g MgSO₄?7H₂O、0.5-0.6g NH₄Cl、0.05-0.1g CaCl₂、0.02-0.05g FeCl₃和5-5.5g KNO₃混合后煮沸晾涼，加0.5‰半胱氨酸后調(diào)pH至中性，然后加1-1.2ml指示劑，充N₂裝瓶，經(jīng)過120-121℃，20-25min的滅菌得到；

第四步增殖培養(yǎng)的程序?yàn)椋?/p>

將各菌株分別接種到裝有130-150ml的脫氮除硫培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，放入35-37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，得到有較高脫硫、降氮活性的菌株；

脫氮除硫培養(yǎng)基由10-12g蛋白胨、3-3.5g牛肉膏、5-6g NaCl、1-1.5g KNO₃、1-2mg環(huán)己六醇、3-6mg6-芐氨基嘌呤、0.5-0.8g半胱氨酸和20-25g瓊脂混合，并調(diào)pH至7.2得到。

其中，所述維生素營(yíng)養(yǎng)液中硫胺素為0.12-0.15ug/L、吡哆醇為0.13-0.15ug/L、泛酸鈣為0.15-0.2ug/L和煙酸為0.11-0.15ug/L。

其中，所述微量元素營(yíng)養(yǎng)液的成分為碘化鉀0.5-0.65mg/L、硫酸鋅5-7mg/L、氯化鈷0.02-0.05mg/L、硫酸銅0.02-0.05mg/L、生物素0.3-0.5mg/L、蛋氨酸0.2-0.5mg/L、蘇氨酸0.28-0.3mg/L的混合溶液。

其中，所述指示劑為美蘭厭氧指示劑。

所述活性污泥為油田采出水處理廠生化污泥、灰場(chǎng)生化污泥或者生活污水處理廠曝氣池。

本發(fā)明的有益效果為：本篩選方法得到的菌株厭氧條件下同時(shí)脫硫脫氮，具有較高持久的硫化物降解活性和氨氮降解活性，硫化物降解率達(dá)到99%以上，氨氮降解率達(dá)到70%以上；本篩選方法得到的菌株應(yīng)用于污水處理上無需對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行曝氣，可降低運(yùn)行成本；無需外加有機(jī)物作為電子受體，既降低成本又避免了增大反應(yīng)器的負(fù)荷；本篩選方法得到的菌株實(shí)現(xiàn)了硫化物轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硫可進(jìn)行資源回收，防止造成二次污染；并且本篩選方法得到的菌株，可以應(yīng)用于生活污水和石化污水的處理，取得良好的經(jīng)濟(jì)效益，具有很廣闊的市場(chǎng)。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明實(shí)施例1的關(guān)于氨氮、硫化物隨時(shí)間變化的降解效率圖。

圖2 為本發(fā)明實(shí)施例2的關(guān)于氨氮、硫化物隨時(shí)間變化的降解效率圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3的關(guān)于氨氮、硫化物隨時(shí)間變化的降解效率圖。

具體實(shí)施方式

為能清楚說明本方案的技術(shù)特點(diǎn)，下面通過具體實(shí)施方式，對(duì)本方案進(jìn)行闡述。

實(shí)施例1

第一步初篩的程序?yàn)椋?/p>

取20g電廠灰場(chǎng)的生化污泥放入盛有初篩培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，保持恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為185轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)時(shí)間為5天；

初篩培養(yǎng)基由15g Na₂S₂O₃、9g KNO₃、6g (NH₄)2HPO₄、1.5g MgCl₂、6g NaHCO₃、1.5g半胱氨酸、30ml維生素營(yíng)養(yǎng)液和30ml微量元素營(yíng)養(yǎng)液混合，調(diào)節(jié)pH為7.0，并經(jīng)過121℃、20min的滅菌處理后得到；

第二步純化分離的程序?yàn)?

將第一步搖床培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿中的菌種接種至固體培養(yǎng)基，將接種菌種后的固體培養(yǎng)基放在30℃的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天；

固體培養(yǎng)基由15g Na₂S₂O₃、9g KNO₃、6g (NH₄)₂HPO₄、1.5g MgCl₂、6g NaHCO₃、1.5g半胱氨酸、12g瓊脂、0.1g活性炭、2g甘露糖、30ml維生素營(yíng)養(yǎng)液和30ml微量元素營(yíng)養(yǎng)液混合而成；

第三步生化培養(yǎng)的程序?yàn)椋?/p>

從經(jīng)過第二步的培養(yǎng)基中挑取劃線分離得到的單菌落分別放至初篩培養(yǎng)基中，在30℃、185轉(zhuǎn)/min的搖床培養(yǎng)10天，培養(yǎng)后取2ml菌液至放有150ml厭氧培養(yǎng)基的厭氧瓶中，然后將厭氧瓶放入30℃生化培養(yǎng)箱30天；再將厭氧瓶放至30℃厭氧培養(yǎng)罐中，培養(yǎng)25天，在培養(yǎng)的過程中持續(xù)沖N2，得到菌株；

厭氧培養(yǎng)基由0.02g MnSO₄、10g Na₂S₂O₃、1.2g Na₂HPO₄、1.8g KH₂HPO₄、1g NaHCO₃、0.4g MgSO₄?7H₂O、0.5g NH₄Cl、0.05g CaCl₂、0.02g FeCl₃和5g KNO₃混合后煮沸晾涼，加0.5‰半胱氨酸后調(diào)pH至中性，然后加1ml美蘭厭氧指示劑，充N₂裝瓶，經(jīng)過121℃， 25min的滅菌得到；

第四步增殖培養(yǎng)的程序?yàn)椋?/p>

將各菌株分別接種到裝有150 ml的脫氮除硫培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，放入37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，得到有較高脫硫、降氮活性的菌株①；

脫氮除硫培養(yǎng)基由10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g NaCl、1g KNO₃、2mg環(huán)己六醇、4mg 6-芐氨基嘌呤、0.5g半胱氨酸和20g瓊脂混合，并調(diào)pH至7.2得到。

其中，所述維生素營(yíng)養(yǎng)液中硫胺素為0.12ug/L、吡哆醇為0.13ug/L、泛酸鈣為0.15ug/L和煙酸為0.11ug/L。

其中，所述微量元素營(yíng)養(yǎng)液的成分為碘化鉀0.65mg/L、硫酸鋅5mg/L、氯化鈷0.02mg/L、硫酸銅0.02mg/L、生物素0.3mg/L、蛋氨酸0.2mg/L、蘇氨酸0.28mg/L的混合溶液。

實(shí)施例2

第一步初篩的程序?yàn)椋?/p>

取20g沙營(yíng)污水處理廠生化活性污泥放入盛有初篩培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，保持恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為185轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)時(shí)間為5天；

初篩培養(yǎng)基由15g Na₂S₂O₃、9g KNO₃、6g (NH₄)₂HPO₄、1.5g MgCl₂、6g NaHCO₃、1.5g半胱氨酸、30ml維生素營(yíng)養(yǎng)液和30ml微量元素營(yíng)養(yǎng)液混合，調(diào)節(jié)pH為7.0，并經(jīng)過121℃、20min的滅菌處理后得到；

第二步純化分離的程序?yàn)?

將第一步搖床培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿中的菌種接種至固體培養(yǎng)基，將接種菌種后的固體培養(yǎng)基放在30℃的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天；

固體培養(yǎng)基由15g Na₂S₂O₃、9g KNO₃、6g (NH₄)₂HPO₄、1.5g MgCl₂、6g NaHCO₃、1.5g半胱氨酸、12g瓊脂、0.1g活性炭、2g甘露糖、30ml維生素營(yíng)養(yǎng)液和30ml微量元素營(yíng)養(yǎng)液混合而成；

第三步生化培養(yǎng)的程序?yàn)椋?/p>

從經(jīng)過第二步的培養(yǎng)基中挑取劃線分離得到的單菌落分別放至初篩培養(yǎng)基中，在30℃、185轉(zhuǎn)/min的搖床培養(yǎng)10天，培養(yǎng)后取2ml菌液至放有150ml厭氧培養(yǎng)基的厭氧瓶中，然后將厭氧瓶放入30℃生化培養(yǎng)箱30天；再將厭氧瓶放至30℃厭氧培養(yǎng)罐中，培養(yǎng)25天，在培養(yǎng)的過程中充5min的N2，得到菌株；

厭氧培養(yǎng)基由0.02g MnSO₄、10g Na₂S₂O₃、1.2g Na₂HPO₄、1.8g KH₂HPO₄、1g NaHCO₃、0.4g MgSO₄?7H₂O、0.5g NH₄Cl、0.05g CaCl₂、0.02g FeCl₃和5g KNO₃混合后煮沸晾涼，加0.5‰半胱氨酸后調(diào)pH至中性，然后加1ml美蘭厭氧指示劑，充N₂裝瓶，經(jīng)過121℃， 25min的滅菌得到；

第四步增殖培養(yǎng)的程序?yàn)椋?/p>

將各菌株分別接種到裝有150 ml的脫氮除硫培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，放入37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，得到有較高脫硫、降氮活性的菌株②；

脫氮除硫培養(yǎng)基由10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g NaCl、1g KNO₃、2mg環(huán)己六醇、4mg 6-芐氨基嘌呤、0.5g半胱氨酸和20g瓊脂混合，并調(diào)pH至7.2得到。

其中，所述維生素營(yíng)養(yǎng)液中硫胺素為0.12ug/L、吡哆醇為0.13ug/L、泛酸鈣為0.15ug/L和煙酸為0.11ug/L。

其中，所述微量元素營(yíng)養(yǎng)液的成分為碘化鉀0.65mg/L、硫酸鋅5mg/L、氯化鈷0.02mg/L、硫酸銅0.02mg/L、生物素0.3mg/L、蛋氨酸0.2mg/L、蘇氨酸0.28mg/L的混合溶液。

實(shí)施例3

第一步初篩的程序?yàn)椋?/p>

取30g樁西污水處理廠曝氣池的活性污泥放入盛有初篩培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，保持恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為185轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)時(shí)間為5天；

初篩培養(yǎng)基由15g Na₂S₂O₃、9g KNO₃、6g (NH₄)₂HPO₄、1.5g MgCl₂、6g NaHCO₃、1.5g半胱氨酸、30ml維生素營(yíng)養(yǎng)液和30ml微量元素營(yíng)養(yǎng)液混合，調(diào)節(jié)pH為7.0，并經(jīng)過121℃、20min的滅菌處理后得到；

第二步純化分離的程序?yàn)?

將第一步搖床培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿中的菌種接種至固體培養(yǎng)基，將接種菌種后的固體培養(yǎng)基放在30℃的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天；

固體培養(yǎng)基由15g Na₂S₂O₃、9g KNO₃、6g (NH₄)₂HPO₄、1.5g MgCl₂、6g NaHCO₃、1.5g半胱氨酸、12g瓊脂、0.1g活性炭、2g甘露糖、30ml維生素營(yíng)養(yǎng)液和30ml微量元素營(yíng)養(yǎng)液混合而成；

第三步生化培養(yǎng)的程序?yàn)椋?/p>

從經(jīng)過第二步的培養(yǎng)基中挑取劃線分離得到的單菌落分別放至初篩培養(yǎng)基中，在30℃、185轉(zhuǎn)/min的搖床培養(yǎng)10天，培養(yǎng)后取2ml菌液至放有150ml厭氧培養(yǎng)基的厭氧瓶中，然后將厭氧瓶放入30℃生化培養(yǎng)箱30天；再將厭氧瓶放至30℃厭氧培養(yǎng)罐中，培養(yǎng)25天，在培養(yǎng)的過程中充5min的N2或持續(xù)沖N2，得到菌株；

厭氧培養(yǎng)基由0.02g MnSO₄、10g Na₂S₂O₃、1.2g Na₂HPO₄、1.8g KH₂HPO₄、1g NaHCO₃、0.4g MgSO₄?7H₂O、0.5g NH₄Cl、0.05g CaCl₂、0.02g FeCl₃和5g KNO₃混合后煮沸晾涼，加0.5‰半胱氨酸后調(diào)pH至中性，然后加1ml美蘭厭氧指示劑，充N₂裝瓶，經(jīng)過121℃， 25min的滅菌得到；

第四步增殖培養(yǎng)的程序?yàn)椋?/p>

將各菌株分別接種到裝有150 ml的脫氮除硫培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，放入37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，得到有較高脫硫、降氮活性的菌株③；

脫氮除硫培養(yǎng)基由10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g NaCl、1g KNO₃、2mg環(huán)己六醇、4mg 6-芐氨基嘌呤、0.5g半胱氨酸和20g瓊脂混合，并調(diào)pH至7.2得到。

其中，所述維生素營(yíng)養(yǎng)液中硫胺素為0.12ug/L、吡哆醇為0.13ug/L、泛酸鈣為0.15ug/L和煙酸為0.11ug/L。

其中，所述微量元素營(yíng)養(yǎng)液的成分為碘化鉀0.65mg/L、硫酸鋅5mg/L、氯化鈷0.02mg/L、硫酸銅0.02mg/L、生物素0.3mg/L、蛋氨酸0.2mg/L、蘇氨酸0.28mg/L的混合溶液。

降解率實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象

本發(fā)明的實(shí)施例1-3得到的菌株①-③。

2.實(shí)驗(yàn)主要試劑

（1）硫酸銨[(NH₄)₂SO₄]、亞硝酸鈉（NaNO₂）、硝酸鉀（KNO₃）和蛋白胨分別購(gòu)于北京化工廠、北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司、北京紅星化工廠和北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

（2）格利斯試劑 A 液：

對(duì)氨基苯磺酸 0.5 g；稀醋酸（10%）150ml

B液：α-萘胺0.1 g，稀醋酸（10%）150ml，H2O 20ml

（3）二苯胺試劑：

二苯胺0.5g；濃硫酸 100ml；蒸餾水20ml

（4）革蘭氏染色劑：

①草酸銨結(jié)晶紫混合液

甲液：結(jié)晶紫2.0g、乙醇（95%）20ml

乙液：草酸銨0.8g 、蒸餾水 80ml

將甲、乙兩液相混，靜置48小時(shí)后過濾使用。

②盧格氏碘液(碘液)

碘 1.0g 、碘化鉀2.0g 、蒸餾水300ml，先用少量的蒸餾水 3-5ml 溶解碘化鉀，再投入碘片，待碘全部溶解后加水定容至 300ml。

③番紅復(fù)染液

番紅（Safranine O）、2.0g 蒸餾水100ml、

（5）甲基紅試劑（M-R 試驗(yàn)試劑）：

甲基紅0.1g、乙醇（95%）300ml、 H₂O200ml

3.試驗(yàn)主要儀器設(shè)備

離心機(jī)（1-14，德國(guó) Sigma），凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC，美國(guó) Bio-Rad），光學(xué)顯微鏡（BX51，日本 OLYMPUS），掃描電鏡（JSM-6700, 日本 JEOL），超凈工作臺(tái)（PCV，日本 HITACHI），紫外可見分光光度計(jì)（Cary，VARIAN），滅菌鍋（MLS-3750，日本 SANYO），培養(yǎng)箱（MLR-350HT，日本 SANYO），水質(zhì)分析儀(HACH,美國(guó) DR2800)

4.實(shí)驗(yàn)步驟

降氮、脫硫活性檢測(cè)

分別?、?③富集培養(yǎng)的菌液2ml至a、b、c三個(gè)15ml脫氮除硫試驗(yàn)培養(yǎng)基中，密塞30℃下培養(yǎng)兩天。

從某煉油廠汽提廢水取樣，測(cè)得該煉油廠汽提廢水中的硫化物含量為45mg/L，氨氮含量為80mg/L，將廢水分別放入三個(gè)瓶中，每瓶15ml。

三個(gè)瓶子內(nèi)分別接入2ml a、b、c的菌液，密塞室溫（26℃）放置，每隔24 h，離心取上清液測(cè)定培養(yǎng)前后廢水中氨氮及硫化物含量，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4d，計(jì)算各菌株氨氮及硫化物的脫除率。氨氮測(cè)定采用納氏試劑光度法；硫化物測(cè)定采用對(duì)氨基二甲基苯胺光度法。

5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表1

由表1和附圖1-3可以得知，本發(fā)明的篩選方法得到的菌株處理污水，處理時(shí)間較短，在48小時(shí)就達(dá)到比較好的脫氮脫硫降解效果，經(jīng)過處理，硫化物和氨氮化物的濃度大大降低，硫化物降解率達(dá)到99%以上，氨氮化物降解率達(dá)到70%以上，經(jīng)過本篩選方法得到的菌株的處理，污水的硫氮含量達(dá)到較低水平。

本發(fā)明未經(jīng)描述的技術(shù)特征可以通過或采用現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)，在此不再贅述，當(dāng)然，上述說明并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不僅限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)所做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。