本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體以及包括該表達(dá)載體的重組細(xì)胞，特別地，本發(fā)明尤其涉及IDS基因過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
：慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的基因的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的基因治療效果。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因的長期、穩(wěn)定表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究中，慢病毒已經(jīng)成為表達(dá)外源基因的常用載體形式之一，并且正在獲得越來越廣泛的應(yīng)用。在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。粘多糖貯積癥II型(Mucopo1ysaccharidosistypeII，MPSII，MIM309900)，又稱Hunter綜合征，是一種X連鎖隱性遺傳病，在人群中的發(fā)病率極低，屬于一種“罕見病”。由于基因突變導(dǎo)致溶酶體酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)缺乏，以致粘多糖(mucop01ysaccharides，MPS)在體內(nèi)大量沉積，尿中大量排出硫酸皮膚素(dermatinsulfateB，DS)、硫酸已酰肝素(heparitinsulfate，HS)。患者出生時(shí)表現(xiàn)一般正常，但隨著越來越多的粘多糖貯積在體內(nèi)，MPSII病程進(jìn)行性加重，癥狀典型，預(yù)后甚差。IDS基因定位于Xq27.3-Xq28，MPSII與IDS基因發(fā)生突變高度相關(guān)。因此，開發(fā)一種可攜帶IDS基因的慢病毒載體，對于研究IDS基因的功能提供了良好的工具，且為Hunter綜合征的慢病毒基因治療提供了一種較為理想的手段，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種可攜帶IDS基因的慢病毒表達(dá)載體以及包括該表達(dá)載體的重組細(xì)胞。一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括EF1α-IDS序列。前述的表達(dá)載體，所述EF1α-IDS序列包括：強(qiáng)啟動子EF1α或者其功能片段或序列變體；IDS基因；和增強(qiáng)子Kozak或者其功能片段或序列變體；其中，增強(qiáng)子Kozak或者其功能片段或序列變體插入到強(qiáng)啟動子EF1α或者其功能片段或序列變體與IDS基因之間。前述的表達(dá)載體，所述EF1α-IDS序列包括：強(qiáng)啟動子EF1α，IDS基因，和插入到強(qiáng)啟動子EF1α與IDS基因之間的增強(qiáng)子Kozak。前述的表達(dá)載體，所述增強(qiáng)子Kozak的序列是CGCCACC。前述的表達(dá)載體，所述EF1α-IDS序列是SEQIDNo:1所示的序列。前述的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體以慢病毒載體pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE為骨架載體，將PGK-GFP序列替換為EF1α-IDS序列。另一方面，本發(fā)明還提供了包括上述表達(dá)載體的重組細(xì)胞。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)方案至少具有如下有益效果：(1)本發(fā)明提供了一種IDS基因過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體，為研究IDS基因的功能提供了良好的工具。(2)本發(fā)明所述的啟動子EF1α，是一種強(qiáng)表達(dá)的啟動子，可使外源基因在哺乳動物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，甚至可在原代細(xì)胞和干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。(3)本發(fā)明所述的增強(qiáng)子Kozak，是用來增強(qiáng)真核基因的翻譯效率的，是最優(yōu)化的ATG環(huán)境，避免核糖體出現(xiàn)leakyscan。附圖說明圖1是pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE載體圖譜。圖2是pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE載體酶切結(jié)果。其中，1#:10kbMarker(條帶自上而下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)2#:載體酶切產(chǎn)物3#:未酶切載體(從細(xì)菌中提取的質(zhì)粒因可能存在超螺旋，開環(huán)，線性等不同的構(gòu)象而具有不同的遷移速率，在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)大小不同的條帶，故此時(shí)質(zhì)粒的電泳條帶只能作為質(zhì)粒分子量大小判斷的參考，不可作為準(zhǔn)確判斷依據(jù)。質(zhì)粒經(jīng)單酶切消化后，會呈現(xiàn)均一的電泳條帶，此時(shí)可與Marker對比判斷其分子量大小)。圖3是EF1α片段膠回收電泳結(jié)果。其中，Marker自上而下依次為：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。圖4是IDS片段膠回收電泳結(jié)果。其中，Marker自上而下依次為：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。圖5是EF1α-IDS片段膠回收電泳結(jié)果。其中，Marker自上而下依次為：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp圖6是轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，1#：陰性對照(ddH2O)；2#：陰性對照(空載自連對照組)；3#：陽性對照(GAPDH)；4#：Marker自上而下依次為5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp；5#-12#：IDS1-8號轉(zhuǎn)化子。圖7是陽性克隆測序結(jié)果。圖8是質(zhì)粒表達(dá)檢測流程圖。圖9是Real-timePCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。具體實(shí)施方式為充分了解本發(fā)明之目的、特征及功效，借由下述具體的實(shí)施方式，對本發(fā)明做詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不僅僅限于此。下述具體實(shí)施方式中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。下述具體實(shí)施方式中所涉及的物質(zhì)均為常規(guī)市購得到。在此應(yīng)當(dāng)說明的是，除非另有說明，否則本發(fā)明中所涉及的術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人通常理解的含義。I.表達(dá)載體本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體是IDS基因過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括EF1α-IDS序列。其中，EF1α-IDS序列包括：強(qiáng)啟動子EF1α或者其功能片段或序列變體；IDS基因；和增強(qiáng)子Kozak或者其功能片段或序列變體；其中，增強(qiáng)子Kozak或者其功能片段或序列變體插入到強(qiáng)啟動子EF1α或者其功能片段或序列變體與IDS基因之間。在一種具體實(shí)施方式中，EF1α-IDS序列包括強(qiáng)啟動子EF1α，IDS基因，和插入到強(qiáng)啟動子EF1α與IDS基因之間的增強(qiáng)子Kozak。其中增強(qiáng)子Kozak的序列是CGCCACC。在另一種具體實(shí)施方式中，EF1α-IDS序列是序列表中SEQIDNo:1所示的序列：在一種特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的表達(dá)載體是IDS基因過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE，如圖1所示，其是以慢病毒載體pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE為骨架載體，將PGK-GFP序列替換為EF1α-IDS序列(序列表中SEQIDNo:1所示的序列)，即pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中原有的PGK啟動子替換為強(qiáng)啟動子EF1α，將原有的GFP基因替換為IDS基因，并在強(qiáng)啟動子EF1α和目的基因IDS之間插入增強(qiáng)子Kozak(CGCCACC)。II.表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明表達(dá)載體的構(gòu)建方法主要包括骨架載體線性化、EF1α-IDS的獲取和重組載體的構(gòu)建。具體如下：1.pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE載體線性化使用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRV和SalI，對pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE載體進(jìn)行雙酶切，隨后膠回收約6Kb的酶切產(chǎn)物。2.EF1α-IDS片段的獲取EF1α片段的獲?。涸O(shè)計(jì)一對引物，以pMD18-EF1α載體為模板，PCR擴(kuò)增EF1α片段并膠回收。IDS片段的獲?。涸O(shè)計(jì)一對引物，以pMD18-IDS載體為模板，PCR擴(kuò)增IDS片段并膠回收。EF1α-IDS片段的拼接：以膠回收的EF1α片段和IDS片段為模板，設(shè)計(jì)一對引物，進(jìn)行兩個(gè)片段的重疊PCR，拼接獲得EF1α-IDS片段。3.pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE重組質(zhì)粒的構(gòu)建EF1α-IDS片段通過同源重組構(gòu)建到線性化骨架載體。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的IDS基因過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE的構(gòu)建方法如下：1.pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE載體線性化將慢病毒載體pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(購自美國Addgege公司)進(jìn)行EcoRV和SalI雙酶切，并膠回收約6Kb酶切產(chǎn)物，酶切體系(ThermoScientific公司)如下：將上述混合液于37℃，反應(yīng)30min。酶切結(jié)果如圖2所示。2.EF1α-IDS片段的獲取A、EF1α片段的獲取以pMD18-EF1α(序列是SEQIDNo:2所示的序列)為模板，PCR擴(kuò)增EF1α片段，膠回收約1301bp片段。采用IDS-P1和IDS-P2引物對，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下表：ID序列IDS-P1GCCTCGAGAAGCTTGATATCAAGCTTTGCAAAGATGGATAAAGIDS-P2TGGCGGCATGGTGGCGTCACGACACCTGAAATGGAAGPCR反應(yīng)體系如下：PCR反應(yīng)體系50μL(PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購自天根生化科技(北京)有限公司)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；(95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s)，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；產(chǎn)物在4℃保存。擴(kuò)增片段大小1301bp。用PCR純化試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)純化PCR產(chǎn)物。PCR瓊脂糖電泳結(jié)果如圖3所示。B、IDS片段的獲取以pMD18-IDS(序列是SEQIDNo:3所示的序列)為模板，PCR擴(kuò)增IDS片段，膠回收約1697bp片段。采用IDS-P3和IDS-P4引物對，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下表：ID序列IDS-P3CTTCCATTTCAGGTGTCGTGACGCCACCATGCCGCCAIDS-P4TCCAGAGGTTGATTGTCGACGCGGCCGCTTTAAGGCATCAACAACTGGAAAAGATCPCR反應(yīng)體系如下：PCR反應(yīng)體系50μL(PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購自天根生化科技(北京)有限公司)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；(95℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s)，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；產(chǎn)物在4℃保存。擴(kuò)增片段大小1697bp。用PCR純化試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)純化PCR產(chǎn)物。PCR瓊脂糖電泳結(jié)果如圖4所示。C、EF1α-IDS片段的拼接以膠回收的EF1α片段和IDS片段為模板，以IDS-P1和IDS-P4為引物進(jìn)行兩個(gè)片段的重疊PCR，PCR反應(yīng)體系如下：PCR反應(yīng)體系50μL(PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購自天根生化科技(北京)有限公司)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；(95℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s)，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；產(chǎn)物在4℃保存。擴(kuò)增片段大小2947bp。用PCR純化試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)純化PCR產(chǎn)物。PCR瓊脂糖電泳結(jié)果如圖5所示。3.pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE重組質(zhì)粒的構(gòu)建EF1α-IDS片段通過同源重組構(gòu)建到線性化載體，重組反應(yīng)體系(購自天根生化科技(北京)有限公司)如下：EF1α-IDS片段2ul線性化載體2ul2×EasyGenoAssemblyMix5ulH2O1ul將上述混合液于50℃，反應(yīng)15min。然后42℃熱擊轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素的LB平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定(結(jié)果如圖6所示)，鑒定引物如下：ID序列IDS-P5CTTGAGTGCTTTGGACGATIDS-P6AGCGTAAAAGGAGCAACATAG陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小約為798bp，將陽性克隆進(jìn)行測序(測序結(jié)果如圖7所示)，通過陽性克隆測序結(jié)果及結(jié)果分析，證明獲得pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE重組質(zhì)粒(質(zhì)粒圖譜如圖1所示)。III.表達(dá)檢測以293T為目的細(xì)胞(293細(xì)胞是轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人腎上皮細(xì)胞系，293T細(xì)胞由293細(xì)胞派生，同時(shí)表達(dá)SV40大T抗原，含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)與啟動子區(qū)的質(zhì)粒可以復(fù)制)，以DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)為培養(yǎng)基，具體操作過程參考《質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞操作手冊》和《RealtimePCR操作手冊》(上海吉?jiǎng)P基因生物科技有限公司)，其流程如圖8所示。引物序列如下：Real-timePCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：實(shí)驗(yàn)分組內(nèi)參基因Ct值目的基因Ct值ΔCt-ΔΔCt2-ΔΔCtCON14.2620.536.270.0831.059CON14.1820.516.330.0231.016CON14.1220.586.46-0.1070.929OE14.1410.88-3.269.613783.252OE13.9910.91-3.089.433691.379OE14.0110.85-3.169.513730.800Real-timePCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下(如圖9所示)：注：1、CON：為293T細(xì)胞樣品(對照組)OE：為目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T后樣品2、2-ΔΔCt法計(jì)算說明：ΔCt＝目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，-ΔΔCt＝NC組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值。2-ΔΔCt反映各樣品相對對照組樣品目的基因的相對表達(dá)水平結(jié)論：經(jīng)RealtimePCR檢測，結(jié)果說明：從定量PCR結(jié)果可以看出，293T細(xì)胞中，OE組IDS表達(dá)豐度是CON組的735.144倍(p<0.05)。當(dāng)前第1頁1 2 3