本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種新型氟化的聚酰胺基因轉染試劑其制備方法及應用。

背景技術：

基因治療成為現(xiàn)在臨床應用的一種方法，即將特定的基因材料轉入到特定的細胞進而治療各種慢性性疾病和遺傳病。常用于基因治療的載體有兩種，病毒性載體和非病毒性載體。目前，由于病毒性載體具有低免疫原性，潛在的傳染性及致瘤性等一系列的嚴重缺陷，在應用上存在一定的局限性。因此，非病毒基因轉染載體的研究成為熱點，在這些非病毒基因轉染載體中，聚陽離子高分子由于存在較低的免疫原性，可塑性強，負載量大，易規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點而被廣泛應用。與此同時聚陽離子化合物的質(zhì)子海綿效應，使得其化學結構在生理條件下有1/6至1/5的胺基發(fā)生質(zhì)子化反應，從而使溶酶體破裂，從而起到質(zhì)子海綿作用，使聚陽離子高分子/dna復合物得以釋放入胞質(zhì)，很大程度上減少dna在吞噬泡內(nèi)富集并進而被降解的作用，因而提高轉染效率。

目前，現(xiàn)有技術中急需一種新型氟化的聚酰胺基因轉染試劑其制備方法及應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷，提供一種新型氟化的聚酰胺基因轉染試劑其制備方法及應用，打破以往采用只采用枝狀的聚乙烯亞胺合成一些基因轉染載體，采用一些低成本的易合成，結構相對穩(wěn)定的線狀的聚乙烯亞胺。采用不同碳鏈長度的含氟脂肪酸酐多種修飾劑修飾之后，降低與血液組織中的聚集，從而增加了基因轉染效率。

其具體技術方案為：

一種新型氟化的聚酰胺基因轉染試劑，polyamide聚酰胺分子式為：

(ch2ch2)n(nco)(c)mr1r2r3

結構式為：

r1，r2，r3＝f，chf2，cf3，ch2f，cf2cf3，cf2cf2cf3

一種本發(fā)明所述新型氟化的聚酰胺基因轉染試劑的制備方法，包括以下步驟：不同分子量的聚乙烯亞胺與脂肪類含氟酸酐在摩爾比為1∶1的情況下，于甲醇溶液中反應48h之后；分別在室溫條件下，于pbs緩沖溶液和蒸餾水中透析48h，經(jīng)過-80℃過夜，冷凍干燥后，即獲得白色絮狀的氟化的聚陽離子化合物。

本發(fā)明所述新型氟化的聚酰胺基因轉染試劑在基因治療藥物制備過程中的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明打破以往采用只采用枝狀的聚乙烯亞胺合成一些基因轉染載體，采用一些低成本的易合成，結構相對穩(wěn)定的線狀的聚乙烯亞胺。采用不同碳鏈長度的含氟脂肪酸酐多種修飾劑修飾之后，降低與血液組織中的聚集，從而增加了基因轉染效率。

附圖說明

圖1：pei和聚酰胺的紅外吸收光譜；

圖2：pei和聚酰胺的核磁譜圖；

圖3：pei和聚酰胺在pbs緩沖液的紫外光譜吸收圖；

圖4：pei，lipo2000和polyamide綠色熒光蛋白(gfp)基因轉染效率比較，其中，圖4(a)lipo2000；圖4(b)linearpei(10kd)；圖4(c)10kd-polyamidea；圖4(d)10kd-polyamideb；圖4(e)linearpei(25kd)；圖4(f)25kd-polyamidea；圖4(g)26kd-polyamidea；

圖5：pei，lipo2000和polyamide基因轉染效率比較；

圖6：pei和polyamide的細胞毒性分析。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細地說明。

該新型氟化試劑的理化表征，首先，對該材料進行紅外光譜分析，將合成的材料紅外光譜，核磁圖譜，uv圖譜分析及透視電鏡。

經(jīng)過對合成的高分子納米材料進行紅外光譜分析，相比沒有經(jīng)過任何修飾的聚乙烯亞胺，氟化后的聚乙烯亞胺于1681cm和1630cm出現(xiàn)酰胺基的c＝o特征吸收峰，證明酰胺基的形成。同時對其進行核磁圖譜分析，發(fā)現(xiàn)其氟化度幾乎達100％。

對其進行uv圖譜分析，現(xiàn)經(jīng)修飾后的pei透過率相比沒有修飾明顯增加，同時化學修飾過的聚乙烯亞胺在208nm有吸收，也證實了酰胺的形成，與之前紅外光譜結果相一致。

氟化的聚陽離子與dna復合物的理化特征：首先通過凝膠阻滯實驗檢測聚陽離子化合物與dna的結合能力，分子量分別是10kda與24kda的聚乙烯亞胺，分別經(jīng)過含氟酸酐a和含氟酸酐b修飾之后，形成四種新型的氟化轉染試劑，將四種氟化試劑與dna分別在n/p3.8、7.5、15、30的情況下，檢測該新型轉染試劑與dna的結合能力。

粒度分析實驗：檢測轉染試劑與dna結合之后的尺寸與電勢是如何變化的，其方法與前面方法一致，分別在n/p3.8、7.5、15、30的情況下，檢測新型轉染載體與dna于pbs緩沖溶液中結合30min之后的尺寸與電勢是如何變化的。

基因轉染：設計不同的濃度梯度，即n/p分別在3.8、7.5、15、30情況下，檢測轉染轉染試劑在不同濃度下的轉染效率，從而篩選出每種轉染試劑最優(yōu)化的轉染條件，本實驗是將hek293細胞平鋪6孔板中，每孔細胞數(shù)大約為7*104.于37℃.5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，聚乙烯亞胺與dna的結合體系，2ug的質(zhì)粒(pegfp)，在將pei/dna復合物加入到細胞之前，現(xiàn)將兩者在dmem中結合15-20min左右，于37℃.5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，在熒光顯微鏡觀測egfp的表達，轉染效率＝綠色熒光的細胞數(shù)目/總的細胞數(shù)目*100％。

檢測egfp的表達：實驗采用帶有綠色熒光標簽的egfp質(zhì)粒，將合成的新型轉染試劑轉入hek293細胞，lipo2000作為對照，檢測其轉染效率。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氟化的pei轉染效率比沒有氟化的pei轉染效率要高。對其進行定量分析，通過luciferase實驗，再次證實氟化后的pei相比沒有氟化的pei及商業(yè)上常用的轉染試劑lipo2000，其轉染效率明顯增加。

mtt實驗：通過mtt實驗，檢測hek293細胞的毒性。將hek293細胞平鋪96孔板中，沒孔細胞數(shù)是5000，于37℃.5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，pei/dna復合物(n/p的摩爾比為3.8、7.5、15、30)于dmem溶液中結合15-20min之后加入96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，將原培養(yǎng)基棄掉，按培養(yǎng)基/mtt(5mg/ml)10∶1的比例混合均勻加入新的培養(yǎng)基，孵育4h之后，棄培養(yǎng)基，每孔加入150ul的dmso溶液，振蕩15min，酶標儀檢測。細胞活性率＝樣本檢測的od值/對照樣品的od值*100％。

通過mtt細胞毒性分析實驗，對氟化的新型轉染試劑進行毒性檢測，發(fā)現(xiàn)其細胞毒性相比沒有修飾的pei及商業(yè)上常用的轉染試劑lipo200有輕微程度較低，由此說明氟化后的pei的細胞毒性相比沒有氟化的pei和lipo2000，細胞毒性較小。

熒光報告實驗：通過熒光報告實驗，對基因轉染效率進行定量分析。本實驗是將hek293細胞平鋪24孔板中，每孔細胞數(shù)4*104，培養(yǎng)24h，加入0.5ug的egfp質(zhì)粒，在最佳pei/dna于dmen溶液中結合15-20min，加入細胞中，培養(yǎng)48h后，檢測其熒光強度，lipo2000作為陽性對照。

細胞攝?。悍謩e將沒有氟化的聚乙烯亞胺與經(jīng)過氟化的聚酰胺在最優(yōu)化的轉染條件下，檢測細胞攝取情況。本實驗采用yoyo-1熒光染料標記renailla質(zhì)粒，lysotracker標記溶酶體，dapi標記細胞核，在將pei/dan復合之前，先dna與yoyo-1孵育10min，然后將轉染試劑(pei)與dna結合進行基因轉染。轉染4h之后，將細胞消化下來，采用流式細胞計數(shù)儀進行定量分析，另外也可以采用激光共聚焦直接觀察細胞攝取情況。

本發(fā)明采用的是線性的聚乙烯亞胺，之所以選用線狀的聚乙烯亞胺為基因轉染載體，最關鍵的一點是因為它的結構較枝狀的更為穩(wěn)定，在與修飾劑反應時可控性強。同時相對枝狀的聚乙烯亞胺，線狀的聚乙烯亞胺成本低，更易大規(guī)?；a(chǎn)。另外，有報道曾指出，氟化作用可以提高聚陽離子化合物改善細胞膜結構，穿過磷脂雙分子結構，促進內(nèi)含體逃逸能力進而提高轉染效率。研究表明，聚乙烯亞胺/dna復合物容易在肺部，肝臟，脾臟等組織發(fā)生聚集，此外該復合物亦容易吸收血液中的負性血清蛋白，導致復合物不穩(wěn)定，進而降低甚至失去傳遞活性，而本發(fā)明采用的采用不同碳鏈長度的含氟脂肪酸酐與聚乙烯亞胺結合之后，降低了聚陽離子化合物與血液組織的粘附作用，使其在基因轉染過程的該復合物的尺寸與電勢不會發(fā)生變化，從而增加了基因轉染效率。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，本發(fā)明的保護范圍不限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。