本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種可以快速測定滴度的桿狀病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)被廣泛使用的真核表達(dá)系統(tǒng)，它與其他蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)，如蛋白質(zhì)翻譯后修飾等等。現(xiàn)在有許多商業(yè)化的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在它們之中，Life公司的Bac-to-Bac系統(tǒng)是最為常用的一個(gè)，已成功地表達(dá)了數(shù)以千計(jì)的蛋白。

與傳統(tǒng)方法相比，利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)獲得重組桿狀病毒，能減少兩周的時(shí)間。但根據(jù)Bac-to-Bac系統(tǒng)操作手冊，測定生產(chǎn)重組桿狀病毒滴度也還需要近一個(gè)星期。測定病毒滴度是對病毒儲存和優(yōu)化重組蛋白表達(dá)一個(gè)非常重要的步驟，也是Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建重組桿狀病毒的耗時(shí)最長的步驟。目前，許多研究者已經(jīng)開始使用不同的策略來減少這一步驟的時(shí)間。Malde等使用熒光實(shí)驗(yàn)芯片與生物分析儀聯(lián)合檢測桿狀病毒滴度，從感染到最終檢測完成僅需48小時(shí)；Shen CF等使用流式細(xì)胞儀在24h內(nèi)，測定了桿狀病毒的滴度；Lo等采用熒光定量PCR檢測桿狀病毒中特定基因的表達(dá)量，可在1h內(nèi)完成對病毒滴度的檢測，且結(jié)果與終點(diǎn)稀釋法相關(guān)性良好；另外，Kwon等使用GP64抗體進(jìn)行染色免疫檢測，在24-48小時(shí)內(nèi)測定了桿狀病毒的滴度。Yahata等發(fā)現(xiàn)重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增期間產(chǎn)生gal量直接與病毒量成比例，通過測定gal的活性推算出了病毒滴度，其測定時(shí)間少于24h；等將綠色熒光蛋白克隆到含雙啟動(dòng)子(極晚期啟動(dòng)子p10和Ph)的表達(dá)轉(zhuǎn)移載體中，與目的蛋白同時(shí)表達(dá)，然后在顯微鏡下通過檢測綠色熒光蛋白表達(dá)間接測定病毒滴度，這種方法也將病毒滴度測定時(shí)間縮短到24小時(shí)。

然而，這些方法都有其不足之處。前三者需要專門的儀器，相應(yīng)的檢測試劑盒，成本較高，對操作人員也有一定的技術(shù)要求。Kwon的方法需要使用價(jià)格昂貴的GP64抗體，同時(shí)增加洗滌，染色等額外的實(shí)驗(yàn)操作。Yahata的方法在病毒液濃度很高時(shí)(大于3x10⁵pfu/mL)并不適用。與前者相比，的方法相對更方便經(jīng)濟(jì)，但它降低了蛋白的表達(dá)能力，因?yàn)樗加昧吮磉_(dá)轉(zhuǎn)移載體上其中一個(gè)表達(dá)盒的位置。

因此，目前迫切需要在現(xiàn)有的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)上，開發(fā)出一種可以快速測定滴度的桿狀病毒表達(dá)載體，并使重組病毒的滴度測定成本更經(jīng)濟(jì)、操作更方便。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決測定桿狀病毒滴度耗時(shí)較長的問題，提供一種更經(jīng)濟(jì)、操作更方便且不會影響病毒蛋白表達(dá)能力的桿狀病毒表達(dá)載體。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了一種可快速測定滴度的桿狀病毒表達(dá)載體，在桿狀病毒Bacmid bMON14272基因組上非必需基因處插入由桿狀病毒極早期啟動(dòng)子ie-1調(diào)控的綠色熒光蛋白基因獲得所述桿狀病毒表達(dá)載體，所述桿狀病毒表達(dá)載體命名為BacG，其生物保藏號為：GDMCC No.60060。

優(yōu)選的是，所述非必需基因?yàn)閜74基因。

優(yōu)選的是，所述增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因?yàn)樵鰪?qiáng)綠色熒光蛋白基因egfp。

一種可快速測定滴度的桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

S1：獲取桿狀病毒p74基因的下游片段L、ie-1啟動(dòng)子基因與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因融合片段E、氯霉素抗性基因片段C、桿狀病毒p74基因上游片段R，并將該四種基因片段依次連接到載體pFastBac1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFB-LECR；

S2：將pFB-LECR重組質(zhì)粒雙酶切后膠回收并純化得到LECR線性片段，然后將LECR線性片段電轉(zhuǎn)進(jìn)內(nèi)含表達(dá)同源重組酶的質(zhì)粒pBAD-gbaA的大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組，在Bacmid bMON14272的p74基因處插入ie-1啟動(dòng)子調(diào)控的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因及氯霉素抗性基因，再涂板通過抗性篩選獲得含成功重組的桿狀病毒表達(dá)載體的單克隆細(xì)菌；

S3：再通過抗性篩選S2中獲得的單克隆細(xì)菌，獲得丟失pBAD-gbaA質(zhì)粒的桿狀病毒表達(dá)載體細(xì)菌；

S4：將S3中獲得的桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞里，獲得重組桿狀病毒。

優(yōu)選的是，步驟S3中抗性篩選方法為將重組成功的含有桿狀病毒表達(dá)載體的單克隆細(xì)菌在不含氨芐抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

優(yōu)選的是，ie-1啟動(dòng)子基因與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因融合片段E是經(jīng)由引物從野生型苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒ACMNPV基因組的Bacmid上擴(kuò)增得到的ie-1啟動(dòng)子基因片段與由引物從質(zhì)粒pEGFP-C2上擴(kuò)增得到的增強(qiáng)型熒光蛋白基因片段融合獲得。

優(yōu)選的是，氯霉素抗性基因片段C是由引物從質(zhì)粒pLysS中擴(kuò)增獲得。

本發(fā)明還提供一種上述可快速測定滴度的桿狀病毒表達(dá)載體在快速測定桿狀病毒滴度中的應(yīng)用。

一種快速測定桿狀病毒滴度的方法，包括如下步驟：

(1)取對數(shù)生長期的昆蟲細(xì)胞懸濁液鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板上，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使昆蟲細(xì)胞貼于孔底；

(2)將所述桿狀病毒表達(dá)載體生產(chǎn)的重組桿狀病毒梯度稀釋后接種到昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)板中，再于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-24h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，出現(xiàn)熒光反應(yīng)孔即可直接判定細(xì)胞已被桿狀病毒感染；

(3)采用終點(diǎn)稀釋法計(jì)算重組桿狀病毒的TCID₅₀。

優(yōu)選的是，上述TCID₅₀的計(jì)算方法采用Reed-Muench法。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

(1)本發(fā)明的桿狀病毒表達(dá)載體生產(chǎn)的重組桿狀病毒依賴增強(qiáng)型綠色熒光蛋白熒光信號表達(dá)測定病毒滴度，相比利用終點(diǎn)稀釋法定量病毒滴度較傳統(tǒng)方法(比如空斑測定)更為直觀、準(zhǔn)確；

(2)本發(fā)明的桿狀病毒表達(dá)載體生產(chǎn)的重組桿狀病毒依賴由極早期啟動(dòng)子ie-1調(diào)控的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白熒光信號表達(dá)的終點(diǎn)稀釋法定量病毒滴度時(shí)，8-24h小時(shí)內(nèi)即可在熒光顯微鏡下觀察到病毒的感染情況，相比較其他檢測方法的周期(一般為6-8天)，縮短了檢測周期，使得終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度更加快捷；

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的桿狀病毒載體表達(dá)載體BacG結(jié)構(gòu)示意圖，其中Kan表示Bacmid本身具有卡那霉素抗性。

圖2為本發(fā)明測定的桿狀病毒滴度的操作流程圖；

圖3為顯微鏡下觀察應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)的桿狀病載體毒感染細(xì)胞的結(jié)果圖，A：可見光、100倍放大；B：488nm激發(fā)光、100倍放大。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。需要說明的是，下述實(shí)施方案中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

一種可快速測定滴度的桿狀病毒表達(dá)載體，在桿狀病毒基因組Bacmid上非必需基因處插入由桿狀病毒極早期啟動(dòng)子ie-1調(diào)控的綠色熒光蛋白基因獲得所述桿狀病毒表達(dá)載體。所述桿狀病毒表達(dá)載體以質(zhì)粒形式存在于大腸桿菌中，所述桿狀病毒表達(dá)載體命名為BacG，分類命名為Escherichia coli，于2016年8月9日在位于廣東省廣州市先烈中路100號大院的廣東省微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為：GDMCC No.60060。

其中，所述非必需基因?yàn)閜74基因。

其中，所述綠色熒光蛋白基因?yàn)樵鰪?qiáng)綠色熒光蛋白基因egfp。

一種可快速測定滴度的桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

S1：獲取桿狀病毒p74基因的下游片段L、ie-1啟動(dòng)子基因與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因融合片段E、氯霉素抗性基因片段C、桿狀病毒p74基因上游片段R，并將該四種基因片段依次連接到載體pFastBac1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFB-LECR；

S2：將pFB-LECR重組質(zhì)粒雙酶切后膠回收并純化得到LECR線性片段，然后將LECR線性片段電轉(zhuǎn)進(jìn)內(nèi)含表達(dá)同源重組酶的質(zhì)粒pBAD-gbaA的大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組，在Bacmid bMON14272的p74基因處插入ie-1啟動(dòng)子調(diào)控的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因及氯霉素抗性基因，再涂板通過抗性篩選獲得含成功重組的桿狀病毒表達(dá)載體的單克隆細(xì)菌；

S3：再通過抗性篩選S2中獲得的單克隆細(xì)菌，獲得丟失pBAD-gbaA質(zhì)粒的桿狀病毒表達(dá)載體細(xì)菌；

S4：將S3中獲得的桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞里，獲得重組桿狀病毒。

其中，步驟S3中抗性篩選方法為將重組成功的含有桿狀病毒表達(dá)載體的單克隆細(xì)菌在不含氨芐抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

其中，ie-1啟動(dòng)子基因與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因融合片段E是經(jīng)由引物從野生型苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒ACMNPV基因組的Bacmid上擴(kuò)增得到的ie-1啟動(dòng)子基因片段與由引物從質(zhì)粒pEGFP-C2上擴(kuò)增得到的增強(qiáng)型熒光蛋白基因片段融合獲得。

其中，氯霉素抗性基因片段C是由引物從質(zhì)粒pLysS中擴(kuò)增獲得。

本發(fā)明還提供一種上述可以快速測定滴度的桿狀病毒表達(dá)載體在快速測定桿狀病毒滴度中的應(yīng)用。

一種快速測定桿狀病毒滴度的方法，包括如下步驟：

1)取對數(shù)生長期的昆蟲細(xì)胞懸濁液鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板上，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使昆蟲細(xì)胞貼于孔底；

2)將所述重組桿狀病毒梯度稀釋后接種到昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)板中，再于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-24h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，出現(xiàn)熒光反應(yīng)孔即可直接判定細(xì)胞已被桿狀病毒感染；

3)采用終點(diǎn)稀釋法計(jì)算重組桿狀病毒的TCID50。

其中，上述TCID50的計(jì)算方法采用Reed-Muench法。

下面結(jié)合實(shí)施例具體說明：

實(shí)施例1

材料Sf9細(xì)胞為一種常用的昆蟲細(xì)胞，購自invitrogen公司；SF900Ⅱ無血清培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；含供體質(zhì)粒pFastBac1的Bac-to-Bac系統(tǒng)購自Invitrogen Life Science公司；大腸桿菌菌株(DH5α)有由實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌菌株DH10Bac(含親本Bacmid bMON14272和輔助質(zhì)粒pMON7124)購自Invitrogen Life Science公司；含有bMON14272質(zhì)粒和pBAD-gbaA質(zhì)粒的DH10B菌株(DH10B-pAcWt-gbaA菌株)由中山大學(xué)惠贈。plysS質(zhì)粒(含氯霉素抗性基因)、pEGFP-C2質(zhì)粒(含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因)由發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。

1)桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建，見圖1

構(gòu)建帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組線性片段，包括：桿狀病毒質(zhì)粒p74基因的下游片段L、ie-1啟動(dòng)子基因與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因融合片段E、氯霉素抗性基因片段C、桿狀病毒質(zhì)粒p74基因上游片段R，將該四種基因片段依次連接到載體pFastBac1上構(gòu)建重組質(zhì)粒pFB-LECR。該重組線性片段在細(xì)胞中翻譯表達(dá)順序如圖1中箭頭所示，其中上游同源序列和下游同源序列的位置固定。

下游同源序列L為苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒AcMNPV的118，729–119，269nt序列，下游同源序列L由引物p74L1、p74L2從含有野生型ACMNPV基因組的Bacmid上擴(kuò)增得到；

上游同源序列R為AcMNNPV的121，073–121，660nt序列，片段R分別由引物p74R1、p74R2從含有野生型ACMNPV基因組的Bacmid上擴(kuò)增得到；

ie-1啟動(dòng)子序列為AcMNPV的126，623–127，197nt序列，ie-1啟動(dòng)子與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合片段E，經(jīng)由引物ie1F和ie1R從含有野生型ACMNPV的Bacmid上擴(kuò)增得到的ie-1啟動(dòng)子基因片段和由引物EGFP-F和EGFP-R從pEGFP-C2上擴(kuò)增得到的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因egfp片段融合獲得；

氯霉素的抗性篩選基因C由引物Cm-F和Cm-R從質(zhì)粒pLysS中擴(kuò)增得到。

各對引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成，具體如表1所示：

表1

注：下劃線標(biāo)記序列為酶切位點(diǎn)序列

將上述重組質(zhì)粒pFB-LECR酶切獲得完整的重組線性片段LECR，將重組線性片段LECR電轉(zhuǎn)進(jìn)大腸桿菌DH10B(DH10B-pAcWt-gbaA，含有親本Bacmid bMON14272和編碼重組酶的質(zhì)粒pBAD-gbaA)的感受態(tài)細(xì)胞中，通過涂板經(jīng)抗性篩選獲得重組成功的含有桿狀病毒表達(dá)載體的單克隆細(xì)菌。

再次抗性篩選重組成功的含有桿狀病毒表達(dá)載體的單克隆細(xì)菌，獲得不含pBAD-gbaA質(zhì)粒的桿狀病毒表達(dá)載體細(xì)菌，該抗性篩選方法為將重組成功的含有桿狀病毒表達(dá)載體的單克隆細(xì)菌在不含氨芐抗生素的培養(yǎng)基中篩選，使pBAD-gbaA質(zhì)粒失去抗性壓力丟失，從而獲得不含pBAD-gbaA質(zhì)粒的桿狀病毒表達(dá)載體的細(xì)菌；

將上述步驟獲得的桿狀病毒表達(dá)載體細(xì)菌的基因組Bacmid轉(zhuǎn)染進(jìn)sf9細(xì)胞系，獲得重組后的桿狀病毒。

2)應(yīng)用實(shí)例，見圖2

細(xì)胞板的制備：Sf9細(xì)胞以SF900Ⅱ無血清培養(yǎng)基在搖瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100rpm，培養(yǎng)溫度27℃。處于對數(shù)生長期的、懸浮培養(yǎng)中的Sf9細(xì)胞，以SF900Ⅱ無血清培養(yǎng)基稀釋，稀釋后的細(xì)胞液以2×10⁴/mL的昆蟲細(xì)胞懸液鋪入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，置27℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使Sf9細(xì)胞貼于孔底，備用。

將重組桿狀病毒梯度稀釋后，取10^-1～10^-6共6個(gè)稀釋度的桿狀病毒液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl/孔，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)重復(fù)，細(xì)胞培養(yǎng)板置于27℃恒溫條件下培養(yǎng)8-24h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，出現(xiàn)熒光反應(yīng)孔即可直接判定細(xì)胞已被桿狀病毒感染。

采用終點(diǎn)稀釋法計(jì)算重組桿狀病毒的TCID₅₀。

結(jié)果：倒置熒光顯微鏡下觀察操作后的Sf9細(xì)胞，感染重組桿狀病毒的細(xì)胞膜有亮綠色熒光，沒有感染重組桿狀病毒的陰性細(xì)胞無任何熒光信號，容易區(qū)分感染細(xì)胞和非感染細(xì)胞孔。圖3(A)與圖3(B)為同一視野，不同光下的情況。其中，圖3(B)為488nm激發(fā)光下，感染細(xì)胞和非感染細(xì)胞清晰可辨，而在圖3(A)的可見光下，感染細(xì)胞和非感染細(xì)胞很難區(qū)分。所以倒置熒光顯微鏡下觀察經(jīng)IFA操作的測定方法，感染和非感染細(xì)胞的辨識度更高，檢測結(jié)果更為可信。根據(jù)Reed-Muench兩氏法計(jì)算

距離比例(PD)＝(高于50％感染率的百分?jǐn)?shù)-50％)/(高于50％感染率的百分?jǐn)?shù)-低于50％感染的百分?jǐn)?shù))

LogTCID50＝高于50％感染率的稀釋度的對數(shù)-距離比例

TCID50＝高于50％感染率的稀釋度+距離比例

根據(jù)公式計(jì)算，測得病毒滴度，TCID₅₀＝10^4.42

原病毒滴度為10^4.42/100μl＝10^7.42/ml

實(shí)施例2：

1、構(gòu)建含CD4基因的重組桿狀病毒：使用本專利構(gòu)建的桿狀病毒表達(dá)載體代替原invitrogen公司Bac to Bac系統(tǒng)親本Bacmid bMON14272，其余構(gòu)建步驟同Bac to Bac操作手冊。

2、細(xì)胞板的制備：Sf9細(xì)胞以SF900Ⅱ無血清培養(yǎng)基在搖瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100rpm，培養(yǎng)溫度27℃。處于對數(shù)生長期的、懸浮培養(yǎng)中的Sf9細(xì)胞，以SF900Ⅱ無血清培養(yǎng)基稀釋，稀釋后的細(xì)胞液以2×10⁴/mL的昆蟲細(xì)胞懸液鋪入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，置27℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使Sf9細(xì)胞貼于孔底，備用。

3、將重組桿狀病毒梯度稀釋后，取10^-1～10^-6共6個(gè)稀釋度的桿狀病毒液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl/孔，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)重復(fù)，細(xì)胞培養(yǎng)板置于27℃恒溫條件下培養(yǎng)8-24h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，出現(xiàn)熒光反應(yīng)孔即可直接判定細(xì)胞已被桿狀病毒感染。采用終點(diǎn)稀釋法計(jì)算重組桿狀病毒的滴度。

4、病毒滴度計(jì)算：顯微鏡下觀察步驟3)記錄細(xì)胞板上發(fā)熒光情況，采用終點(diǎn)稀釋法用Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID₅₀。

測得TCID₅₀＝10^4.68

原病毒滴度為10^4.68/100μl＝10^7.68/ml

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。