本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種丹參遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)：

丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，主要以其干燥根以及根莖入藥，因其色紅且形狀似參而得名“丹參”。丹參味苦，性微寒，歸心、肝二經(jīng)，具有活血祛痰、養(yǎng)血安神、消腫止痛、涼血消癰等功能，廣泛用于治療心腦血管疾病，是一種臨床需求量巨大的常用藥用植物。此外，丹參植物染色體數(shù)目少、基因組小、生命力強(qiáng)，世代周期短，是藥用植物研究中的模式生物，其基因組、轉(zhuǎn)錄組的研究也取得了一定進(jìn)展。通過對丹參有效藥用成分生物合成途徑中的功能基因進(jìn)行研究，揭示藥用植物活性成分合成的分子機(jī)制有重要意義。同時(shí)，采用分子育種手段提高丹參中有效藥用成分的含量也逐漸成為研究熱點(diǎn)，而一種高效、快速、方便、簡單實(shí)用的遺傳轉(zhuǎn)化方法是以上研究工作的基礎(chǔ)。

目前，丹參的遺傳轉(zhuǎn)化研究也得到了大家的廣泛關(guān)注，主要是利用發(fā)根農(nóng)桿菌獲得轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根法、利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法。葉盤轉(zhuǎn)化法是將健康的帶傷口的無菌葉片在農(nóng)桿菌菌液中浸泡后，共培養(yǎng)2-3天，轉(zhuǎn)移到含抑制劑的培養(yǎng)基上去除農(nóng)桿菌，同時(shí)加入抗生素進(jìn)行選擇培養(yǎng)最終獲得再生植株。葉盤法操作簡單，重復(fù)性高，是丹參遺傳轉(zhuǎn)化的常用方法。目前文獻(xiàn)報(bào)道中丹參的葉盤轉(zhuǎn)化法多采用卡那霉素進(jìn)行篩選，卡那霉素作為篩選抗性基因NPTII的常用抗生素，主要是通過與30S核糖體結(jié)合，影響mRNA密碼的讀取，從而導(dǎo)致蛋白翻譯受阻。選用30mg/L、50mg/L、60mg/L的卡那霉素進(jìn)行丹參的遺傳轉(zhuǎn)化篩選獲得陽性轉(zhuǎn)基因丹參植株的研究均有報(bào)道。

但是，技術(shù)人員的后續(xù)研究表明，選用30mg/L的卡那霉素對丹參進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)丹參葉片對卡那霉素敏感，用它做篩選抗生素時(shí)葉片生長容易停止，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性差，不易獲得轉(zhuǎn)基因丹參植株。雖然也有報(bào)道用潮霉素(Hygromycin B,縮寫為Hyg)進(jìn)行丹參的遺傳轉(zhuǎn)化篩選，并且認(rèn)為適宜選用2.5mg/L的Hyg進(jìn)行篩選，因?yàn)?0mg/L、15mg/L、10mg/L、5mg/L的篩選培養(yǎng)基上丹參外植體全部褐化死亡。最近還有研究人員前期用10mg/L的Hyg進(jìn)行丹參轉(zhuǎn)基因植株的篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)10mg/L的Hyg篩選濃度下丹參外植體并不容易褐化死亡，而且容易獲得丹參再生植株，但對丹參再生植株進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)陽性率不高，后期剔除假陽性苗費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此有必要尋找一種獲得高陽性率的丹參遺傳轉(zhuǎn)化方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于此，有必要針對傳統(tǒng)技術(shù)存在的問題，提供一種操作簡便、重復(fù)性高且轉(zhuǎn)化效率高的丹參遺傳轉(zhuǎn)化方法。

本發(fā)明的丹參遺傳轉(zhuǎn)方法，包括：步驟1：取丹參組培苗的葉片，將葉片去除葉片邊緣后剪切成葉盤；步驟2：將葉盤放置于不含潮霉素的第一固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1-2天；步驟3：將帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-1.0；步驟4：取2mL農(nóng)桿菌菌液離心，去除上清液，收集菌體后用Murashige&Skoog BASAL MEDIUM液體培養(yǎng)基重懸用于侵染；步驟5：將預(yù)培養(yǎng)過后的葉片放入含有農(nóng)桿菌的Murashige&Skoog BASAL MEDIUM液體培養(yǎng)基中侵染10-20min，中間輕輕晃動以使菌液充分接觸葉片；步驟6：取出侵染后的葉盤，置于無菌濾紙上以吸干表面殘余的菌液；步驟7：將去除表面菌液的葉盤置于新的第一固體培養(yǎng)基上，在25℃，黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天；步驟8：將共培養(yǎng)過后的葉片轉(zhuǎn)移至含有潮霉素的第二固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，每隔10-15天更換一次第二固體培養(yǎng)基以免抗生素失效；步驟9：將分化出的小芽轉(zhuǎn)移至含有潮霉素的第三固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待葉片長得較大時(shí)再轉(zhuǎn)移至含有潮霉素和吲哚丁酸的第四固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；步驟10：將生根后的丹參組培苗轉(zhuǎn)移至中高瓶進(jìn)行培養(yǎng)，促進(jìn)植株生長，初期在含有潮霉素的第五固體培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行篩選培養(yǎng)，后期繼代培養(yǎng)時(shí)采用不含抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

在其中一個實(shí)施例中，所述第二固體培養(yǎng)基、第三固體培養(yǎng)基和第四固體培養(yǎng)基中的潮霉素濃度均為30-60mg/L。

在其中一個實(shí)施例中，所述第一固體培養(yǎng)基的成分為：MS+0.8-1.2mg/L6-BA+0.08-0.12mg/L NAA。

在其中一個實(shí)施例中，所述第二固體培養(yǎng)基的成分為：MS+0.8-1.2mg/L6-BA+0.08-0.12mg/L NAA+30-60mg/L Hyg+200-400mg/L Cef。

在其中一個實(shí)施例中，所述第三固體培養(yǎng)基的成分為：MS+30-60mg/L Hyg+200-400mg/L Cef。

在其中一個實(shí)施例中，所述第四固體培養(yǎng)基的成分為：1/2MS+0.3-0.4mg/L IBA+30-60mg/L Hyg+200-400mg/L Cef。

在其中一個實(shí)施例中，所述第五固體培養(yǎng)基中的潮霉素濃度均為30-60mg/L。

在其中一個實(shí)施例中，步驟1中采用生長4-7周的健碩的丹參99-3株系的丹參組培苗的葉片。

在其中一個實(shí)施例中，步驟3中的農(nóng)桿菌采用GV3101農(nóng)桿菌菌株。

在其中一個實(shí)施例中，步驟3中的農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒含有pri-miR828序列。

本發(fā)明的丹參遺傳轉(zhuǎn)化方法中，將潮霉素Hyg的濃度提高到較高濃度(30-60mg/L)，最終建立起陽性率接近100％的效率，高效可靠的丹參植株遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)改良丹參品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例的丹參遺傳轉(zhuǎn)化方法的主要步驟的示意圖。

圖2為運(yùn)用了本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行的99-3丹參遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明丹參遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解，先將一些術(shù)語解釋如下。

卡那霉素，英文名為Kanamycin，縮寫為Kan。

潮霉素，英文名為Hygromycin B，縮寫為Hyg。

頭孢霉素，英文名為Cefotaxime，縮寫為Cef。

6芐氨基嘌呤，英文名為6-Benzyl Aminopurine，縮寫為6-BA。

吲哚丁酸，英文名為indole-3-Butytric acid，縮寫為IBA。

萘乙酸，英文名為1-Naphthylacetic acid，縮寫為NAA。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例的丹參轉(zhuǎn)基因方法。它包括以下步驟：

a)取生長4-7周的丹參組培苗的葉片，去除葉片邊緣后剪切成約1cm²大小的葉盤，剪切過程應(yīng)當(dāng)快速。

b)將剪切好的葉盤放置于第一固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1-2天。培養(yǎng)條件優(yōu)選為25℃，光照16h/黑暗8h的2/3光照條件。

c)將帶含有pri-miR828序列的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101接種于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-1.0。

d)取2mL農(nóng)桿菌菌液離心(例如在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心操作10min)，去除上清液(該清液主要成分是LB培養(yǎng)基)，收集沉底的菌體后用Murashige&Skoog BASAL MEDIUM(縮寫為MS)液體培養(yǎng)基重懸(例如重懸至30-40mL)用于侵染。

e)將預(yù)培養(yǎng)過后的丹參葉片放入含有農(nóng)桿菌的MS液體培養(yǎng)基中侵染10-20min，中間輕輕晃動以使菌液充分接觸葉片。

f)取出侵染后的葉盤，置于無菌濾紙上以吸干表面殘余的菌液。

g)將去除表面菌液的葉盤置于新的第一固體培養(yǎng)基上，25℃，黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天。

h)將共培養(yǎng)過后的葉片轉(zhuǎn)移至第二固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，10-15天更換一次SmT2培養(yǎng)基以免抗生素失效。

i)將成功分化出的小芽轉(zhuǎn)移至第三固體培養(yǎng)基上，待葉片長得較大時(shí)再轉(zhuǎn)移至含IBA的第四固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根和促進(jìn)植株生長。

j)將生根后的丹參組培苗轉(zhuǎn)移至中高瓶進(jìn)行培養(yǎng)，促進(jìn)植株生長，初期添加Hyg的第五固體培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行篩選培養(yǎng)，后期繼代培養(yǎng)采用不含抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

上面過程中所用的培養(yǎng)基具體如下：

第一固體培養(yǎng)基的成分為MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.08-0.12mg/L NAA。

第二固體培養(yǎng)基的成分為MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.08-0.12mg/L NAA+30-60mg/L Hyg+200-400mg/L Cef。

第三固體培養(yǎng)基的成分為MS+30-60mg/L Hyg+200-400mg/L Cef。

第四固體培養(yǎng)基的成分為1/2MS+0.3-0.4mg/L IBA+30-60mg/L Hyg+200-400mg/L Cef。

第五固體培養(yǎng)基中潮霉素濃度為30-60mg/L。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基的具體濃度如下：

第一固體培養(yǎng)基為SmT1(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)；

第二固體培養(yǎng)基為SmT2(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+50mg/L Hyg+300mg/L Cef)；

第三固體培養(yǎng)基為SmT3(MS+50mg/L Hyg+300mg/L Cef)；

第四固體培養(yǎng)基為SmT4(1/2MS+0.2mg/L IBA+50mg/L Hyg+300mg/L Cef)

第五固體培養(yǎng)基中潮霉素的濃度為50mg/L。

圖2示出了該實(shí)施例的99-3丹參遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果示意圖。圖2中的上排三張小圖分別為：第一張是暗培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行篩選培養(yǎng)半個月左右時(shí)期，愈傷開始啟動時(shí)的照片；第二張是愈傷開始長大時(shí)的照片，第三張是愈傷組織開始萌發(fā)長大時(shí)的照片。圖2中的下排三張小圖分別為：第一張和第二張是愈傷開始分化成苗的成功的照片，第三張是愈傷最終分化成的幼苗照片。

本發(fā)明所應(yīng)用的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，具有操作簡便、重復(fù)性高、能快速、有效地獲得轉(zhuǎn)基因丹參植株的特點(diǎn)。本發(fā)明采用30-60mg/L Hyg進(jìn)行篩選時(shí)，不僅獲得了陽性轉(zhuǎn)基因植株，而且陽性率極高，接近100％。綜上所述，本發(fā)明建立了一種以丹參葉片作為外植體的高效可靠、操作簡便的丹參植株遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將攜帶外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入丹參，獲得陽性轉(zhuǎn)基因丹參植株。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。