本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種腫瘤相關(guān)基因AKT1基因突變檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：近年來，PI3K/AKT通路受到很大關(guān)注，AKT1是該通路中的關(guān)鍵分子，其持續(xù)活化與細胞增殖密切相關(guān)，AKT1的多種底物均具有促進細胞生長增殖的作用。本研究結(jié)果顯示，AKT1在大腸腺癌中的表達率與正常大腸粘膜中的表達率相比差異有非常顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示在大腸腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，AKT1的高表達與腫瘤的演變過程中起著重要作用?？梢宰鳛榇竽c腺癌基因治療的一個良好靶點。某些人類癌癥中，AKT1激酶的plekstrin同源區(qū)（plekstrinhomologydomain，PHD）含有一個點突變，促進膜結(jié)合（membraneassociation）和腫瘤形成。AKT1/PKB激酶是PI3K信號傳遞途徑（在人類癌癥中常常失控）的一個下游靶標，依賴于膜結(jié)合和隨后的磷酸化而活化。AKT的PHD（plekstrin同源區(qū)）與PIP3或PIP2磷脂結(jié)合，調(diào)控膜定位。體外實驗中，AKT的膜結(jié)合突變會改變嚙齒類和人類的細胞。雖然磷酸化的AKT在幾種人類癌癥中都有上升，但至今未有關(guān)于AKT的致瘤性突變的報道。最近，JohnD.Carpten與其同事證實，幾種人類腫瘤樣本中AKT1的PHD中的點突變有一致性，促進膜結(jié)合和細胞轉(zhuǎn)化。研究人員對這些人類乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌樣本的基因組進行測序，未曾發(fā)現(xiàn)AKT1的催化區(qū)（catalyticdomain）有突變，但至少6％的腫瘤樣本中，AKT1PHD(AKT(E17K))的磷脂結(jié)合位點中，第17位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?。這種突變改變了PHD的構(gòu)造，提高了AKT激酶在體外的活性。沒有生長因子刺激時，PIP2和PIP3的細胞水平下降，AKT1仍停留在細胞質(zhì)中。活細胞成像結(jié)果顯示，AKT(E17K)即便在細胞饑餓時也能夠聯(lián)合質(zhì)膜，說明PHD突變的膜結(jié)合不需要PIP2或PIP3，或者PHD突變能夠結(jié)合低水平表達的磷脂。Rat1纖維原細胞表達AKT1，導致停泊和接觸－非依賴性（anchorage-andcontact-independent）生長；表達AKT(E17K)和造血干細胞中IgH增強子驅(qū)動的c-Myc的小鼠會發(fā)展出白血病。AKT1/2抑制劑VIII和LY294002分別阻斷AKT1(E17K)的膜結(jié)合和PI3K的活性，但這兩種試劑對AKT1(E17K)的定位和活性無影響——為發(fā)展基于阻斷致瘤性PI3K途徑信號傳遞的癌癥治療策略提供了重要參考。PI3K途徑通過促進磷酸化和膜結(jié)合，激活AKT。有趣的是，這些在人類腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)的AKT1突變與其它PI3K途徑突變不相符，證明AKT(E17K)即使在上游LI3K途徑?jīng)]有活性的情況下也能促進細胞轉(zhuǎn)化。這種在AKT1的PHD區(qū)種發(fā)現(xiàn)的致癌性突變研究PI3K在人類癌癥中的作用及發(fā)展PI3K抑制劑的重要進步。另外，68例Survivin表達陽性者中AKT1表達陽性者有61例，其表達強度也呈相同的變化趨勢，為明顯正相關(guān)，提示二者具有協(xié)同作用，說明在Survivin陽性組，AKT1一直處于激活狀態(tài)，即p-AKT1水平與Survivin密切相關(guān)。而Survivin與AKT1之間是否有直接的相互作用，具體通過哪種機制相互影響，尚有待進一步證實和研究。另外本研究結(jié)果顯示，AKT1與caspase-3、Survivin與caspase-3之間無明確相關(guān)性。在大腸腺癌中，AKT1、Survivin呈高表達，caspase-3呈低表達，提示AKT1、Survivin以及caspase-3在大腸癌癌變過程中發(fā)揮重要的作用，AKT1與Survivin之間呈正相關(guān)，它們相互協(xié)同，共同促進了大腸癌的發(fā)生發(fā)展。AKT1、Survivin在大腸腺癌中的表達明顯高于正常對照組，可以作為大腸癌早期診斷的篩選指標。AKT1基因突變的檢測主要有Sanger測序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技術(shù)采用等位基因特異性擴增法對樣本的基因突變進行區(qū)分，該方法成本較低，但檢測率較高，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；ARMS技術(shù)是目前國內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，但只能檢測已知的位點，且要將樣本分成多個管進行實驗才能實現(xiàn)分型，對樣本量要求高；而Sanger測序法是DNA序列分析的經(jīng)典方法，最直接的、可檢測已知和未知突變的一種方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認為是基因分型的金標準，其主要優(yōu)點是測序長度較長，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點，包括一些新的少見的突變形式及突變的確切類型，如點突變、片段缺失。所以探索一種可用于Sanger測序法檢測AKT1基因的技術(shù)具有重要的臨床意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供一種AKT1基因突變檢測試劑盒，可直接利用含人體某組織部位的石蠟包埋樣本通過Sanger測序法檢測出樣本中AKT1基因主要突變位點c.49G>A,p.E17K。本發(fā)明的AKT1基因突變檢測試劑盒具體包括：（1）用于擴增樣本中AKT1基因Exon3號外顯子的特異性引物，具體序列如下:名稱序列號Reverse5’-3’AKT1Ex3-FSEQIDNo.1GAGGGTCTGACGGGTAGAGTAKT1Ex3-RSEQIDNo.2TTACGCGCCACAGAGAAGTT（2）用于測序PCR的測序引物，用于對AKT1基因c.49G>A,p.E17K突變位點進行測序分析，具體序列如下：名稱序列號Reverse5’-3’SEQ-A3SEQIDNo.3TTACGCGCCACAGAGAAGTT（3）1個裝有AKT1野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按1:1質(zhì)量比例混合的陽性質(zhì)控品管和1個裝有PCR反應(yīng)預混液的試管；其中突變型質(zhì)粒為AKT1基因上的c.49G>A,p.E17K突變位點；PCR反應(yīng)預混液由以下組份組成：組份體積（μl）10PCRbuffer2.55Qsolution525mMMgCl21.525mMdNTPs0.4H2O10.35其中10×PCRbuffer中含有500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)，100mM(NH4)2SO4，和15mMMgCl2；5×Qsolution中含有1MTricine[pH8.7(withKOH)]，8%(v/v)Glycerol和5%(v/v)DMSO；25mMdNTPs中含有25mMdATPs、25mMdTTPs、25mMdCTPs和25mMdGTPs。本試劑盒主要是根據(jù)AKT1基因的Exon3號外顯子的保守序列分別設(shè)計AKT1基因c.49G>A,p.E17K突變位點的特異性引物，并純化回收擴增產(chǎn)物。本發(fā)明的各種引物長度在20-25個堿基之間，無特殊修飾。反應(yīng)液預混液采用獨特的配方及比例。能在樣本濃度較低時檢測到目的基因，結(jié)果無非特異性擴增。具體操作流程包括：（1）引物設(shè)計：利用引物設(shè)計軟件，如PrimerPremier5，從AKT1基因DNA序列中挑選特定的序列，然后根據(jù)堿基互補特點，設(shè)計AKT1基因Exon3號外顯子的特異性引物，用于擴增樣本中DNA。測序引物的設(shè)計與用于擴增樣本中DNA的特異性引物的設(shè)計類似，不過測序引物只需要一段即可，引物序列分別是SEQIDNOs：1-3。長度在20-25個堿基左右。（2）PCR擴增：利用試劑盒中含特定序列的引物PCR擴增臨床樣本中的DNA。（3）瓊脂糖凝膠電泳及膠回收：將擴增得到的目的基因AKT1的Exon3號外顯子片段回收用于測序。附圖說明以下是附圖的說明，以便于理解上述發(fā)明的目的和具體特征。圖1為AKT1基因的Exon3號外顯子的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖1中各標號的具體表示如下：1：1號樣本；2：2號樣本；3：3號樣本；4：4號樣本；5：5號樣本；6：6號樣本；M：DNAmaker，從上到下大小依次為2000、1000、750、500、250和100。圖2-1為AKT1基因的Exon3號外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為野生型。圖2-2為AKT1基因的Exon3號外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為突變體。具體實施方式1、引物設(shè)計根據(jù)AKT1基因在肺癌等疾病中的突變情況及個體化治療后產(chǎn)生的耐藥機制，利用引物設(shè)計軟件，如PrimerPremier5，從AKT1基因DNA序列中挑選特定的序列，然后根據(jù)堿基互補特點，設(shè)計AKT1基因Exon3號外顯子的特異性引物，用于擴增樣本中DNA。引物序列分別是SEQIDNos：1-2。測序引物的設(shè)計與用于擴增樣本中DNA的特異性引物的設(shè)計類似，不過測序引物只需要一段即可，引物序列是SEQIDNos：3。2、PCR擴增2.1、質(zhì)控品準備陽性質(zhì)控品為AKT1野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按質(zhì)量比1:1的比例混合，陰性質(zhì)控品為無菌水。使用前室溫融化，旋渦振蕩10秒，瞬時離心10秒。2.2、試劑配制提前將試劑取出，室溫融化，旋渦振蕩10秒，瞬時離心10秒。確定反應(yīng)數(shù)N，N=待檢樣本數(shù)（n）+質(zhì)控品數(shù)+1。計算加到反應(yīng)混合物中的各個試劑的量，計算如下：組分PCRmix3（即PCR反應(yīng)預混液）Taq酶體積（μl）19.75×N0.25×N取一個滅菌離心管配制上述反應(yīng)體系，試劑全部加入后旋渦振蕩10秒，瞬時離心。然后將上述混合液按20μl/管分裝至PCR反應(yīng)管中。2.3、加樣將AKT1陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和樣本DNA分別取2.5μl加入到PCR反應(yīng)管中，其中樣本要稀釋至20ng/μl；然后再將相應(yīng)的引物加入到對應(yīng)的PCR反應(yīng)管中，每個樣本需要引物各加1.25μl（引物用之前先稀釋1/10至10μM），同時作好標記，蓋緊管蓋后，瞬時離心15秒，將管壁上的液體全部甩至管底，消除氣泡，可重復離心至氣泡完全消除。然后立即進行PCR擴增反應(yīng)。2.4、PCR擴增配置完成后，將PCR管放入PCR儀進行反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序如下：3、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及回收由于PCR產(chǎn)物長度較短，配制2%（w/w）的瓊脂糖凝膠；電泳條件為120V，20min。電泳完成后，取出凝膠，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，并記錄擴增條帶情況。如果PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果良好，即可回收目的片段用于測序?；厥盏玫降漠a(chǎn)物即可用于測序。序列表<110>中山大學廣東凱普生物科技股份有限公司<120>AKT1基因突變檢測試劑盒<160>3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>AKT1Ex3-F<400>1gagggtctgacgggtagagt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>AKT1Ex3-R<400>2ttacgcgccacagagaagtt20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-A3<400>3ttacgcgccacagagaagtt20當前第1頁1 2 3