本申請涉及惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域，尤其涉及一種定位目標(biāo)表型癌細胞中表型基因的方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤己成為嚴重威脅人類生命與健康的疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界死于惡性腫瘤的人約每年700萬，我國每年死于惡性腫瘤的人約150萬，目前我國國內(nèi)新增腫瘤患者每年高達180萬以上，癌癥治療技術(shù)的研究已經(jīng)迫在眉睫。經(jīng)研究表明，腫瘤的發(fā)生既與外源性致癌因素的性質(zhì)、強度和作用時間有關(guān)，同時也與人體的內(nèi)在因素有重要的關(guān)系。經(jīng)?？梢砸姷?，處于同樣條件下接觸同質(zhì)、同量致癌因素，有的人發(fā)病，而有的人不發(fā)病，可見外源性致癌因素雖然很重要，但人體的內(nèi)在因素才是癌細胞產(chǎn)生和發(fā)展的決定性因素。因此，從人體自身層面上研究癌癥發(fā)病機制具有重要意義。

在引起人體惡性腫瘤的眾多內(nèi)在因素中，與基因相關(guān)的因素占據(jù)極其重要的部分。分子生物學(xué)的研究己經(jīng)發(fā)現(xiàn)2.5萬多種癌癥與相關(guān)的基因變異和基因表達失調(diào)有關(guān)，這些與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因一般是編碼生長因子、生長因子受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、凋亡蛋白、細胞周期蛋白和DNA修復(fù)蛋白等的基因。

一方面癌細胞有許多共性，如生長和分裂失去控制，具有浸潤性和擴散性，細胞間粘著性下降，細胞分化程度較低，失去運動和分裂的接觸抑制等，癌細胞的每種細胞功能特點都有相對應(yīng)的基因所控制，如癌細胞中調(diào)控細胞增殖、凋亡、細胞間粘連等功能的基因往往出現(xiàn)異常。另一方面不同種類的癌細胞基因表達譜卻不盡相同，正是由于這些不同的基因表達決定了各式各樣癌細胞的 表型。因此，研究這些基因表達譜中不同的表達基因能夠?qū)Π┌Y的發(fā)病原因以及癌癥的治療提供重要幫助。

然而，人類的基因組數(shù)據(jù)庫過于復(fù)雜，從不同表型癌細胞的基因表達譜中篩選出決定其表型的基因需要花費大量的工作，并且有的時候癌癥病人的治療情況十分急迫，要檢測導(dǎo)致癌細胞表型的基因會耗費大量時間，從而不利于癌癥病人的及時治療。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的實施例提供了一種定位目標(biāo)表型癌細胞中表型基因的方法，用于定位目標(biāo)表型癌細胞的表型基因。

一種定位目標(biāo)表型癌細胞中表型基因的方法，其特征在于，該方法包括：

對目標(biāo)表型癌細胞和對應(yīng)正常細胞分別進行總RNA提??；

將所提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

以得到的cDNA為模板，實時定量PCR計算目標(biāo)表型癌細胞中選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平；

根據(jù)目標(biāo)表型癌細胞中選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平的計算結(jié)果定位目標(biāo)表型癌細胞的表型基因。

優(yōu)選的，所述定位目標(biāo)表型癌細胞的表型基因具體為：比較目標(biāo)表型癌細胞各個基因mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平，以目標(biāo)表型癌細胞中mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平最高的基因作為目標(biāo)表型癌細胞表型基因。

優(yōu)選的，所述方法還包括：根據(jù)目標(biāo)表型癌細胞以及所定位的表型基因，構(gòu)建癌細胞表型、表型基因和它們對應(yīng)關(guān)系三者的文庫；所述文庫具體為癌細胞表型、表型基因以及對應(yīng)關(guān)系三者的數(shù)據(jù)表。

優(yōu)選的，其特征在于，當(dāng)獲知癌細胞表型時，能夠根據(jù)所述癌細胞表型在所述文庫中快速查詢表型基因，用于癌癥的基因治療。

優(yōu)選的，其特征在于，所述對目標(biāo)表型癌細胞和對應(yīng)正常細胞分別進行總 RNA提取具體為：使用TaKaRa Code D9108A RNAiso Plus試劑盒分別提取目標(biāo)表型癌細胞和對應(yīng)正常細胞中全部的RNA。

優(yōu)選的，所述目標(biāo)表型癌細胞具體指：包括人胰腺癌細胞在內(nèi)的不同表型的癌細胞；所述對應(yīng)正常細胞指：與目標(biāo)表型癌細胞相對應(yīng)的正常細胞，包括人胰腺細胞HPC-Y5。

優(yōu)選的，所述反轉(zhuǎn)錄具體為：用TaKaRa Primer Script RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取得到的目標(biāo)表型癌細胞和對應(yīng)正常細胞的總RNA分別進行反轉(zhuǎn)錄。

優(yōu)選的，所述目標(biāo)表型癌細胞中選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平計算方法為：將選定基因在對應(yīng)正常細胞中轉(zhuǎn)錄mRNA的量定為1個基本單位，并以此確定目標(biāo)表型癌細胞中相同基因的mRNA轉(zhuǎn)錄量；所述選定基因為人類基因組數(shù)據(jù)庫中任何一個基因。

優(yōu)選的，所述表型基因指通過精確協(xié)調(diào)的活動而維持細胞特定表型的基因，癌細胞表型基因的mRNA高相對轉(zhuǎn)錄水平造成了癌細胞與正常細胞的差別。

本發(fā)明所帶來的有益效果是，一方面本發(fā)明對目標(biāo)表型癌細胞中基因表達的實時定量PCR，通過比較癌細胞和對應(yīng)正常細胞之間不同基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平之間的比較，根據(jù)細胞表型的差異由表型基因的活動狀態(tài)決定的原理，篩選出決定癌細胞表型的表型基因，另一方面本發(fā)明提供了表型基因、癌細胞表型和表型基因及癌細胞表型對應(yīng)關(guān)系三者的文庫，當(dāng)獲知癌細胞表型時，能夠根據(jù)所述癌細胞表型在所述文庫中快速查詢表型基因，用于癌癥的基因治療。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1為本發(fā)明實施例一的流程圖

圖2為本發(fā)明實施例二的流程圖

圖3為本發(fā)明實施例二胸RNA提取具體操作步驟流程圖

圖4為本發(fā)明實施例三的流程圖

圖5為本發(fā)明實施例四的流程圖

圖6為PANC-1中4種基因mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平

圖7為本發(fā)明實施例五的流程圖

具體實施方式

為使本申請的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本申請具體實施例及相應(yīng)的附圖對本申請技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅是本申請一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒旧暾堉械膶嵤├绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本申請保護的范圍。

本發(fā)明的主要思想是細胞表型的差異(正常細胞和癌細胞之間以及不同癌細胞之間)與表型基因的活動狀態(tài)有關(guān)，表型基因是指通過精確協(xié)調(diào)的活動而維持細胞特定表型的基因，癌細胞表型基因的mRNA高相對轉(zhuǎn)錄水平造成了癌細胞與正常細胞的差別?？梢酝ㄟ^比較目標(biāo)表型癌細胞不同基因信使RNA(mRNA)的相對轉(zhuǎn)錄水平，相對轉(zhuǎn)錄水平最高的基因即為目標(biāo)表型癌細胞的表型基因，并且目標(biāo)表型癌細胞整個生命過程受到表型基因的調(diào)控。本發(fā)明通過比較PANC-1細胞內(nèi)不同基因mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平，篩選出決定PANC-1細胞表型的表型基因。并根據(jù)篩選的結(jié)果構(gòu)建癌細胞表型、表型基因和它們對應(yīng)關(guān)系三者的文庫。

根據(jù)上述總體過程，本發(fā)明篩選出的表型基因與癌細胞的增殖和/或凋亡和/或浸潤和/或轉(zhuǎn)移等細胞生命過程相關(guān)。

為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員能進一步了解本發(fā)明的特征及技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細描述。

實施例一

附圖1為本發(fā)明實施例一的流程圖。該實施例所述的一種定位目標(biāo)表型癌細胞中表型基因的方法包括以下步驟：

步驟101：對目標(biāo)表型癌細胞和對應(yīng)正常細胞分別進行總RNA提?。?/p>

步驟102：將步驟101中提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

所述總RNA進行反轉(zhuǎn)錄具體為用TaKaRa Primer Script RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取得到的目標(biāo)表型癌細胞和對應(yīng)正常細胞的總RNA分別進行反轉(zhuǎn)錄。

步驟103：以步驟102得到的cDNA為模板，實時定量PCR計算目標(biāo)表型癌細胞中選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平；

所述選定基因具體為人類基因組數(shù)據(jù)庫中任何單個基因，當(dāng)需要測量多個選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平時，分別測量每個選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平。

步驟104：根據(jù)步驟103的計算結(jié)果定位目標(biāo)表型癌細胞的表型基因；

本發(fā)明對目標(biāo)表型癌細胞中基因表達的實時定量PCR，通過比較癌細胞和對應(yīng)正常細胞之間不同基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平之間的比較，根據(jù)細胞表型的差異由表型基因的活動狀態(tài)決定的原理，篩選出決定癌細胞表型的表型基因。

實施例二

實施例一中步驟101提到對目標(biāo)表型癌細胞和對應(yīng)正常細胞分別進行總RNA提取，這種總RNA提取可以有多種具體實現(xiàn)方式，只要這些方式能夠分別提取細胞內(nèi)全部的RNA即不妨礙本發(fā)明的發(fā)明目的的實現(xiàn)。比如可以使用TaKaRa Code D9108A RNAiso Plus試劑盒對目標(biāo)表型癌細胞和對應(yīng)正常細胞分別進行總RNA提取。由此可構(gòu)成本發(fā)明的又一個實施例，參見附圖2和附圖3，本實施例二與實施例一相比，除步驟101外，其他步驟均相同。實施例一的步驟101在本實施例中變化為：

步驟201：使用TaKaRa Code D9108A RNAiso Plus試劑盒對目標(biāo)表型癌細胞和對應(yīng)正常細胞分別進行總RNA提取。

所述目標(biāo)表型癌細胞具體指包括人胰腺癌細胞(PANC-1)在內(nèi)的不同表型 的癌細胞；所述對應(yīng)正常細胞指與目標(biāo)表型癌細胞相對應(yīng)的正常細胞，包括人胰腺細胞(HPC-Y5)；所述總RNA提取指提取細胞內(nèi)的全部的RNA；所述RNAiso Plus用量為每10cm²的貼壁細胞1mL；所述步驟201具體為：

步驟2011：勻漿。倒出培養(yǎng)液，用杜氏磷酸緩沖液洗一次后，加入RNAiso Plus，水平放置片刻使細胞裂解，將裂解液移至無酶離心管中，反復(fù)吹吸至無明顯沉淀，室溫靜置5分鐘；

步驟2012：總RNA提取。向勻漿裂解液中加入氯仿(加入的量為RNAiso Plus體積的1/5)，用手劇烈震蕩15秒，室溫靜置5分鐘。然后在4℃的條件下離心15分鐘，離心機轉(zhuǎn)速為12000rpm。將離心后的無色上清液移至新的無酶離心管中，向其中加入等體積的異丙醇，混勻后靜置10分鐘，然后在4℃、12000rpm的條件下離心10分鐘，最后得到的下層沉淀物為總RNA；

步驟2013：總RNA清洗。使用75％的無水乙醇清洗總RNA；

步驟2014：總RNA溶解。將得到的總RNA在室溫干燥2-5分鐘，然后加入20uL的無酶水溶解總RNA。

實施例三

實施例一中步驟103提到以cDNA為模板，實時定量PCR計算目標(biāo)表型癌細胞中選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平，這種計算目標(biāo)表型癌細胞中選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平有多種方法，只要這些方法能計算選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平即不妨礙本發(fā)明發(fā)明目的的實現(xiàn)。實施例三與實施例一相比，除步驟103外，其他步驟均相同。參考附圖4，實施例一的步驟103在本實施例中變化為：

步驟403：以cDNA為模板，實時定量PCR，將選定基因在對應(yīng)正常細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄mRNA的量定為1個基本單位，確定目標(biāo)表型癌細胞中相同基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平。具體操作為：

分別以目標(biāo)表型癌細胞和對應(yīng)正常細胞的cDNA為模板，對內(nèi)參基因和選定基因進行實時定量PCR擴增，每組實驗重復(fù)測試3次，對目標(biāo)基因進行實時 定量PCR檢測表達量，計算目標(biāo)表型癌細胞中選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平。所述目標(biāo)表型癌細胞內(nèi)選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平計算方法為：將選定基因在對應(yīng)正常細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄mRNA的量定為1個基本單位，并以此確定目標(biāo)表型癌細胞中相同基因的mRNA轉(zhuǎn)錄量。

實施例四

實施例一中步驟104提到，根據(jù)步驟103的計算結(jié)果定位目標(biāo)表型癌細胞的表型基因，定位目標(biāo)表型癌細胞的表型基因有多種方法，只要這些方法能計算選定基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平即不妨礙本發(fā)明發(fā)明目的的實現(xiàn)。比如可以比較目標(biāo)表型癌細胞各個基因mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平，以目標(biāo)表型癌細胞中相對轉(zhuǎn)錄水平最高的基因作為目標(biāo)表型癌細胞表型基因。這樣就構(gòu)成了本發(fā)明的實施例四，參考附圖5。實施例四與實施例一相比，除步驟104外，其他步驟均相同。實施例四的步驟104在本實施例中變化為：

步驟504：比較目標(biāo)表型癌細胞各個基因mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平，以目標(biāo)表型癌細胞中相對轉(zhuǎn)錄水平最高的基因作為目標(biāo)表型癌細胞表型基因。

以PANC-1細胞為例，附圖6提供了PANC-1中表達量最高的四種不同基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平，通過比較四種不同基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平定，根據(jù)本實施例所提供的方法，篩選出了決定PANC-1細胞表型的表型基因為STAT5B基因。

STAT5B基因在PANC-1中mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平達到了正常HPC-Y5的54倍，而其它幾種基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平雖然較高，但是與STAT5B基因相比相對表達水平差距明顯，所以確定STAT5B基因為PANC-1的表型基因。STAT5B是一個轉(zhuǎn)錄因子，能夠?qū)υS多細胞因子、激素和生長因子產(chǎn)生影響，它通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的過程，影響細胞增殖的進程。

實施例五

實施例一的方法還可以包括構(gòu)建癌細胞表型、表型基因和表型基因及癌細胞表型對應(yīng)關(guān)系三者的文庫，這就構(gòu)成了本發(fā)明的實施例五。參考附圖7，實施例五與實施例一相比，除增加了步驟705外，其他步驟均相同實施例一相同。

步驟705：構(gòu)建癌細胞表型、表型基因和表型基因及癌細胞表型對應(yīng)關(guān)系三者的文庫。具體操作步驟為：

根據(jù)實施例一步驟104得到的目標(biāo)表型癌細胞和表型基因?qū)?yīng)的結(jié)果，構(gòu)建癌細胞表型、表型基因和它們對應(yīng)關(guān)系三者的文庫。所述文庫具體為癌細胞表型、表型基因以及對應(yīng)關(guān)系三者的數(shù)據(jù)表格。表1為根據(jù)實施例四的結(jié)果構(gòu)建的文庫，可以在文庫中根據(jù)癌細胞的表型快速地找到對應(yīng)的表型基因以及對應(yīng)關(guān)系，為癌細胞的針對性治療提供便利。

表1細胞表型、表型基因以及它們對應(yīng)關(guān)系三者的文庫

以上僅為本申請的實施例而已，并不用于限制本申請。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原理之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本申請的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。