本發(fā)明涉及一種環(huán)境樣品特別是沉積物樣品中微生物胞外DNA的簡易提取方法，該方法借助生物技術(shù)手段，對(duì)沉積物樣品進(jìn)行處理，屬于環(huán)境科學(xué)與生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗生素抗性基因在自然環(huán)境中廣泛的存在和傳播擴(kuò)散引起了巨大的環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)，有必要對(duì)自然環(huán)境中抗性基因的數(shù)量進(jìn)行準(zhǔn)確地檢測(cè)。環(huán)境中的抗生素抗性基因通常位于一些可移動(dòng)遺傳元件上，如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等，這些抗性基因可以通過可移動(dòng)遺傳元件的水平轉(zhuǎn)移進(jìn)行傳播和擴(kuò)散。位于細(xì)菌內(nèi)的抗生素抗性基因通常可以通過結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入其他細(xì)菌，而位于細(xì)菌體外的基因則有可能通過轉(zhuǎn)化再次進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的抗生素抗性基因通過不同的方式對(duì)抗生素抗性基因的傳播和擴(kuò)散起到不同的作用，因此，對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA加以區(qū)分對(duì)于研究抗生素抗性基因在環(huán)境中的傳播擴(kuò)散尤為重要。
目前對(duì)于胞外DNA(eDNA)的提取方法主要有苯酚-氯仿抽提法、微柱吸附法、磁珠吸附法等，但這些方法主要針對(duì)組織和血漿中胞外DNA的提取。沉積物介質(zhì)基質(zhì)復(fù)雜，干擾嚴(yán)重，現(xiàn)有方法無法直接用于沉積物中eDNA的提取，因此建立一種高效的沉積物樣品DNA提取方法至關(guān)重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)于環(huán)境樣本中微生物胞外DNA的提取的方法，以解決目前環(huán)境樣本胞外DNA提取方法的欠缺。依據(jù)本發(fā)明方法可以對(duì)沉積物等環(huán)境樣本中的胞外DNA進(jìn)行快速有效地提取，能得到可直接用于后續(xù)分子生物學(xué)操作的高純度DNA，并且可以計(jì)算DNA的提取效率。本發(fā)明關(guān)于提取效率的創(chuàng)造性之處在于向未經(jīng)滅菌的土壤樣品中直接加入內(nèi)標(biāo)胞外DNA。
本發(fā)明提供的從沉積物樣品中高效提取胞外DNA的簡易方法，對(duì)于不同的土壤和水體沉積物樣品均具有較好的胞外DNA提取效果，并且該方法引入了DNA提取效率的指標(biāo)，該指標(biāo)是指通過在待提取的土壤樣品中加入已知數(shù)量的內(nèi)標(biāo)胞外DNA CESA9。CESA9是擬南芥中一段纖維素合成酶基因，在對(duì)環(huán)境樣本提取胞外DNA之后，對(duì)該基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定其拷貝數(shù)量，以此計(jì)算出DNA的提取效率。加入內(nèi)標(biāo)胞外DNA之前的沉積物樣品DNA經(jīng)過PCR反應(yīng)檢測(cè)不到目的基因CESA9的存在。
本發(fā)明提供的高效提取沉積物中胞外DNA方法的具體步驟為：
第1：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因的構(gòu)建；
第1.1：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因克隆載體的構(gòu)建；
CESA9是擬南芥中一段纖維素合成酶基因，該基因片段作為計(jì)算胞外DNA提取的內(nèi)標(biāo)基因，將這段基因用PCR擴(kuò)增之后進(jìn)行切膠回收，取0.5-4μl PCR與1μl pEASY-T1克隆載體輕輕混合，室溫反應(yīng)5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上；
第1.2：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增
加連接產(chǎn)物于50μl感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，42℃水浴熱激30秒，立即置于冰上2分鐘；加入250μl平衡至室溫的LB培養(yǎng)基，200rpm、37℃培養(yǎng)1小時(shí)；取8μl 500mM IPTG和40μl 20mg/ml X-gal混合，均勻地涂布在準(zhǔn)備好的平板上，37℃培養(yǎng)箱中放置30分鐘。待IPTG和X-gal被吸收后，取200μl菌液均勻地涂布在平板上，在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；挑選白色克隆接種于LB/AMP+或LB/Kan+的液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃培養(yǎng)6小時(shí)左右；用試劑盒小量提取質(zhì)粒；
第1.3：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因濃度的確定：
對(duì)第1.2步提取的質(zhì)粒用核酸濃度測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，確定內(nèi)標(biāo)基因濃度；
第2：沉積物樣品胞外DNA提??；
第2.1：沉積物樣品胞外DNA的分離；
稱取1g沉積物樣品于10mL無菌離心管中，取10μg第1.2步提取的內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒加入到樣品中，濃度為2.37×1013CFU/g沉積物；加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH2PO4溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，混合均勻，250rpm、25℃反應(yīng)10分鐘；然后在4℃條件下，10000×g離心10分鐘，取上清液，過0.22μm PVDF濾膜，將濾液存放于冰上；向離心管剩余沉淀中再次加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH2PO4溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，按上述過程操作，重復(fù)兩次之后，將三次所得濾液混合；將濾液在4℃條件下，10000×g離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌管中；
第2.2：胞外DNA溶液的獲得；
向第2.1得到的液體中加入1體積的混合溶液，包括50mM Tris-HCl、10mM EDTA和質(zhì)量濃度為1％的CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)，pH＝8.0，65℃水浴30分鐘，4℃條件下，5000×g離心10分鐘，棄上清液；再向離心管中加入1體積的高鹽度的TE緩沖液A重懸10分鐘，所述TE緩沖液A中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA和1M NaCl，pH＝8.0；加入0.6體積的冰異丙醇，在冰上反應(yīng)1小時(shí)，4℃、10000×g離心10分鐘；將沉淀再次重懸于1體積TE緩沖液B，所述TE緩沖液B中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA，pH＝8.0；加入等體積的體積比為苯酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1的混合液，上下顛倒混勻進(jìn)行抽提，在4℃下10000×g離心10分鐘，取上層液體置于新的2mL無菌離心管中，重復(fù)此操作一次；用體積比為氯仿：異戊醇＝24:1的混合液再抽提新獲得的上層液體一次，4℃下10000×g離心10分鐘，取出上層液體，置于1.5mL的無菌離心管中；
第2.3：粗DNA的純化溶解；
向第2.2步得到的液體中加入0.1倍體積的2M NaCl溶液和0.6倍體積的異丙醇，-20℃時(shí)靜置60分鐘，10000×g離心15分鐘，棄去上清液，用0.5mL體積比為70％的冷乙醇洗滌沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g離心2分鐘，重復(fù)洗滌一次，棄去乙醇后將DNA在真空中進(jìn)行干燥；用30μL的65℃預(yù)熱的TE緩沖液溶解DNA，TE緩沖液為pH＝8.0的10mM Tris-HCl和1mM EDTA混合溶液；
第3：內(nèi)標(biāo)基因的定量；
利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)提取的DNA中所含內(nèi)標(biāo)基因CESA9的拷貝數(shù)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列及退火溫度見實(shí)施例2。
用于計(jì)算DNA提取效率的內(nèi)標(biāo)基因CESA9是擬南芥中一段纖維素合成酶基因，在所要提取DNA的環(huán)境樣品中檢測(cè)不到。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
本發(fā)明所述方法可以將環(huán)境樣本中胞外DNA進(jìn)行分離與純化。通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，提取出的DNA的OD260/OD280可以達(dá)到1.57，OD260/OD230可以達(dá)到1.78，可以進(jìn)行后續(xù)的分子操作，實(shí)用性較強(qiáng)。通過DNA的提取效率分析，該方法的沉積物中胞外DNA提取率可以達(dá)到57％，表明該方法可靠性程度較高。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：沉積物樣品中胞外DNA的提?。?/p>
第1：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因的構(gòu)建；
第1.1：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因克隆載體的構(gòu)建；
將擬南芥中CESA9基因用PCR擴(kuò)增之后進(jìn)行切膠回收，取0.5-4μl PCR與1μl pEASY-T1克隆載體輕輕混合，室溫反應(yīng)5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上；
第1.2：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增
加連接產(chǎn)物于50μl感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，42℃水浴熱激30秒，立即置于冰上2分鐘；加入250μl平衡至室溫的LB培養(yǎng)基，200rpm、37℃培養(yǎng)1小時(shí)；取8μl 500mM IPTG和40μl 20mg/ml X-gal混合，均勻地涂布在準(zhǔn)備好的平板上，37℃培養(yǎng)箱中放置30分鐘。待IPTG和X-gal被吸收后，取200μl菌液均勻地涂布在平板上，在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；挑選白色克隆接種于LB/AMP+或LB/Kan+的液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃培養(yǎng)6小時(shí)左右；用試劑盒小量提取質(zhì)粒；
第1.3：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因濃度的確定：
對(duì)第1.2步提取的質(zhì)粒用核酸濃度測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，確定內(nèi)標(biāo)基因濃度；
第2：沉積物樣品胞外DNA提??；
第2.1：沉積物樣品胞外DNA的分離；
稱取1g沉積物樣品于10mL無菌離心管中，取10μg第1.2步提取的內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒加入到樣品中，濃度為2.37×1013CFU/g沉積物；加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH2PO4溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，混合均勻，250rpm、25℃反應(yīng)10分鐘；然后在4℃條件下，10000×g離心10分鐘，取上清液，過0.22μm PVDF濾膜，將濾液存放于冰上；向離心管剩余沉淀中再次加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH2PO4溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，按上述過程操作，重復(fù)兩次之后，將三次所得濾液混合；將濾液在4℃條件下，10000×g離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌管中；
第2.2：胞外DNA溶液的獲得；
向第2.1得到的液體中加入1體積的混合溶液，包括50mM Tris-HCl、10mM EDTA和質(zhì)量濃度為1％的CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)，pH＝8.0，65℃水浴30分鐘，4℃條件下，5000×g離心10分鐘，棄上清液；再向離心管中加入1體積的高鹽度的TE緩沖液A重懸10分鐘，所述TE緩沖液A中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA和1M NaCl，pH＝8.0；加入0.6體積的冰異丙醇，在冰上反應(yīng)1小時(shí)，4℃、10000×g離心10分鐘；將沉淀再次重懸于1體積TE緩沖液B，所述TE緩沖液B中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA，pH＝8.0；加入等體積的體積比為苯酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1的混合液，上下顛倒混勻進(jìn)行抽提，在4℃下10000×g離心10分鐘，取上層液體置于新的2mL無菌離心管中，重復(fù)此操作一次；用體積比為氯仿：異戊醇＝24:1的混合液再抽提新獲得的上層液體一次，4℃下10000×g離心10分鐘，取出上層液體，置于1.5mL的無菌離心管中；
第2.3：粗DNA的純化溶解；
向第2.2步得到的液體中加入0.1倍體積的2M NaCl溶液和0.6倍體積的異丙醇，-20℃時(shí)靜置60分鐘，10000×g離心15分鐘，棄去上清液，用0.5mL體積比為70％的冷乙醇洗滌沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g離心2分鐘，重復(fù)洗滌一次，棄去乙醇后將DNA在真空中進(jìn)行干燥；用30μL的65℃預(yù)熱的TE緩沖液溶解DNA，TE緩沖液為pH＝8.0的10mM Tris-HCl和1mM EDTA混合溶液；
第3：提取胞外DNA質(zhì)量檢測(cè)；
利用核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)所提取的DNA進(jìn)行OD260/OD280、OD260/OD230的測(cè)定。
利用實(shí)施例1所述方法提取來自沉積物樣品中的微生物胞外DNA。利用核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)所提取的DNA進(jìn)行OD260/OD280、OD260/OD230的測(cè)定，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示用本發(fā)明中的方法提取來自沉積物中的胞外DNA其OD260/OD280值接近1.30，說明提取樣品中蛋白質(zhì)殘留較少；其OD260/OD230值不低于1.60，說明腐殖酸類等的其它雜質(zhì)少；因此，本發(fā)明適合提取沉積物樣品中微生物胞外DNA。此外本發(fā)明的應(yīng)用范圍不僅包括沉積物，對(duì)于土壤等介質(zhì)提取的DNA質(zhì)量較高。
表1：提取沉積物樣品中微生物胞外DNA純度檢測(cè)
實(shí)施例2：PCR檢驗(yàn)沉積物中微生物胞外DNA提取效率；
(1)目的基因引物序列
(2)定性PCR反應(yīng)程序
(3)熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)
(4)定性PCR反應(yīng)體系
(5)定量PCR反應(yīng)體系
表2：提取沉積物樣品中微生物胞外DNA提取效率檢測(cè)
利用實(shí)施例2所述方法檢測(cè)可得對(duì)沉積物樣品中的微生物胞外DNA的提取效率均高于44％，最高可達(dá)57％。因此，本發(fā)明適合提取沉積物樣品中微生物胞外DNA。此外本發(fā)明的應(yīng)用范圍不僅包括沉積物，對(duì)于土壤等介質(zhì)提取的DNA質(zhì)量和提取效率也較高。