本發(fā)明關(guān)于一種核酸分離的技術(shù)，特別是指一種選擇性分離核酸的方法及其套組。
背景技術(shù)：
：隨著人類(lèi)以及其他物種的基因體逐漸被解碼，以核酸(包括DNA和RNA)作為檢測(cè)標(biāo)的的分子診斷技術(shù)成為近年來(lái)臨床檢測(cè)上的一大重點(diǎn)。無(wú)論是DNA或者是RNA，都是由四個(gè)核苷酸分子所組成，因此相較于復(fù)雜的臨床病理判讀，核酸的分子組成相對(duì)簡(jiǎn)單，也較為容易進(jìn)行檢測(cè)。以核酸為標(biāo)的進(jìn)行分子診斷的過(guò)程中，核酸片段大小的篩選扮演了相當(dāng)重要的角色。例如血液系統(tǒng)當(dāng)中的游離核酸(cell-freenucleicacids)，常被運(yùn)用作為胎兒產(chǎn)前檢測(cè)與癌癥檢測(cè)的主要核酸來(lái)源。但是，游離核酸多為短序列的片段，并且在樣本當(dāng)中的含量相對(duì)于其他大片段核酸較為微量。因此，如何取得足夠含量的短片段核酸，并且去除其他大片段核酸，是決定檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確的重要因素。另一方面，次世代定序(nextgenerationsequencing；NGS)技術(shù)由于其無(wú)需利用細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)體的復(fù)制、高通量以及時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛的使用在各種以核酸為標(biāo)的的分子診斷技術(shù)當(dāng)中，作為核酸定序的主要工具。以Illumina系統(tǒng)的NGS為例，其進(jìn)行主要是先將待測(cè)核酸片段化之后，對(duì)這些不同大小片段的核酸進(jìn)行篩選，再依照需求將特定的短序列片段進(jìn)行純化、回收濃縮或以聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerasechainreaction；PCR)來(lái)增幅并建構(gòu)核酸庫(kù)。再將核酸庫(kù)的核酸片段與接合序列連接，將連接后的片段注入到表面帶有接合片段互補(bǔ)序列的芯片上進(jìn)行橋式PCR以及熒光的標(biāo)記與偵測(cè)。核酸片段的篩選可以應(yīng)用在核酸庫(kù)建構(gòu)的前處理、去除為未接妥接合序列的核酸片段以及PCR增幅之后除去非目標(biāo)核酸片段等步驟，以提升定序過(guò)程中核酸的質(zhì)量與含量。針對(duì)前述核酸片段的篩選，實(shí)質(zhì)上回收的目標(biāo)核酸序列通常不長(zhǎng)，且在本領(lǐng)域中常慣稱(chēng)做「小片段核酸」(smallfragments)，因此，如何提升小片段核酸回收效果，以維護(hù)、強(qiáng)化定序質(zhì)量，目前已發(fā)展出數(shù)種方法因應(yīng)，其中常見(jiàn)的主要包括三種：(1)以洋菜膠(agarosegel)電泳區(qū)分出不同序列尺寸之核酸，再以切膠回收的方式，針對(duì)目標(biāo)片段(通常是小片段核酸)進(jìn)行分離回收，這種方式可精確回收特定片段的核酸，卻存有耗時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)。此外，因?yàn)樾∑魏怂崾芟抻诜肿恿枯^小，在洋菜膠上的顯像分辨率較差，尤其是在濃度低的時(shí)候，更容易妨礙切膠回收的效果；(2)利用披覆(coated)DNA分子與表面官能基改質(zhì)(例如帶有羧基)的磁珠(magneticbeads)，配合聚乙二醇(polyethyleneglycol；PEG)和鹽類(lèi)的濃度條件，吸附并結(jié)合待分離的小片段核酸，如同美國(guó)公告專(zhuān)利第6534262號(hào)所揭露。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于可輕易套用至自動(dòng)化系統(tǒng)，進(jìn)行大量的分離、篩選，但除了須選用特殊改質(zhì)的磁珠造成的額外成本與工序之外，這種方法經(jīng)證實(shí)顯然不適用于序列尺寸較長(zhǎng)(例如序列長(zhǎng)度大于約400bp以上)的核酸，明顯限制了此方法在NGS技術(shù)上的應(yīng)用；(3)可利用設(shè)計(jì)引子(primer)或誘引序列(bait)精確回收核酸，惟此法僅適用于已知待定序的目標(biāo)序列的狀況下，難以廣泛應(yīng)用。根據(jù)上述常用方法未能解決的問(wèn)題，目前仍持續(xù)有技術(shù)改良，但仍各有其限制，舉例說(shuō)明如下：美國(guó)發(fā)明專(zhuān)利公告第US6534262B1號(hào)提出一種方法，藉由調(diào)整PEG條件配合帶有官能基的固態(tài)載體，來(lái)調(diào)整反應(yīng)溶液中的離子強(qiáng)度(ionicstrength)及PEG的濃度，改善回收小片段核酸效果。此外，以美國(guó)發(fā)明公開(kāi)專(zhuān)利第US20060024701號(hào)及美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利第US20110060135號(hào)為例，可見(jiàn)其均采用調(diào)整PEG方法達(dá)成分離、回收小片段核酸，均須搭配官能基(羧基或胺基)改質(zhì)的固態(tài)載體(膜狀、微粒、磁珠)，勢(shì)必增加制造的成本與復(fù)雜度。世界專(zhuān)利第WO2013181651A1號(hào)提出了一種回收小片段核酸的方法，藉由調(diào)整胍鹽濃度及pH值調(diào)整小片段核酸黏附至(solidcarrier)的效果，藉以改善回收效果，但根據(jù)NGS序列尺寸篩選的應(yīng)用時(shí)機(jī)多元，回收核酸時(shí)，勢(shì)必面臨多元化且復(fù)雜的溶液環(huán)境，很可能引發(fā)pH值的變化，降低此方法之效果與可靠性；此外，在生產(chǎn)相關(guān)溶液試劑時(shí)，對(duì)于pH值的精準(zhǔn)度的要求標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)提高，甚至需要增加檢驗(yàn)工序，額外耗時(shí)且增加制造成本。美國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利第US20140243216號(hào)亦使用調(diào)節(jié)pH值的策略達(dá)成回收小片段核酸的目的，因此，根據(jù)其對(duì)pH的依賴(lài)程度，可預(yù)期該方法同樣存有不同的環(huán)境溶液對(duì)其效果可能產(chǎn)生的不利影響。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述先前技術(shù)之缺失，本發(fā)明的主要目的是利用一種選擇性分離核酸的方法來(lái)分離特定序列長(zhǎng)度的核酸。本發(fā)明的另一目的在于提供一種簡(jiǎn)單的反應(yīng)緩沖液，讓操作者可依照預(yù)定之核酸序列長(zhǎng)度需求，輕易地從含有序列長(zhǎng)度不一之核酸混合液中，分離出特定序列長(zhǎng)度之核酸。本發(fā)明的再一目的可以讓使用者選擇性分離出特定序列長(zhǎng)度之核酸并直接應(yīng)用至后續(xù)工序，不僅快速方便、節(jié)省成本，回收率(recovery)亦佳，亦能提高后續(xù)應(yīng)用之效能。本發(fā)明進(jìn)一步的目的在于提供的核酸分離方法所使用的溶液環(huán)境簡(jiǎn)單且穩(wěn)定，可排除pH值變化對(duì)純化、分離核酸效果的影響，亦無(wú)須倚賴(lài)特定聚合物溶質(zhì)或界面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)溶液系統(tǒng)，更無(wú)須使用官能基(例如表面羧基化、胺基化)改質(zhì)之載體，十分適合應(yīng)用于現(xiàn)有之自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行高通量之操作，同時(shí)滿(mǎn)足了分離核酸之精準(zhǔn)度、分離與純化效能、便利性等需求。本發(fā)明的更一目的是利用成分單純的鹽類(lèi)溶液和擁擠試劑配合硅基(silica-based)濾材使用，即可達(dá)成分離特定序列長(zhǎng)度的核酸。本發(fā)明的又一目的在于提出一種配方簡(jiǎn)易、不需使用聚合物溶劑、不需采用官能基改質(zhì)之濾材亦無(wú)需倚賴(lài)pH值的簡(jiǎn)單方法，尤其適用于分離特定范圍的核酸片段。為達(dá)成前述目的，本發(fā)明揭露一種選擇性分離核酸的方法，其步驟如下：混合樣本核酸與結(jié)合緩沖液以產(chǎn)生混合溶液，其中樣本核酸具有特定大小的核酸片段，混合溶液具有離液鹽，以及單價(jià)離子鹽或擁擠試劑至少其中之一；使混合溶液流過(guò)固相載體，藉由單價(jià)離子鹽濃度的高低來(lái)控制欲保留的特定大小的核酸片段結(jié)合于固相載體，其中當(dāng)單價(jià)離子鹽濃度愈高則保留愈大的核酸片段及當(dāng)單價(jià)離子鹽濃度愈低則保留大范圍的核酸片段,其中大范圍的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段；使沖洗緩沖液流過(guò)固相載體以清除未與固相載體結(jié)合的物質(zhì)；以及使水溶液流過(guò)固相載體以回收欲保留的特定片段大小的核酸片段。本發(fā)明另揭露一種選擇性分離核酸的方法，其步驟如下：混合樣本核酸與第一結(jié)合緩沖液以產(chǎn)生第一混合溶液，其中樣本核酸具有特定大小的核酸片段，第一混合溶液具有離液鹽，使第一混合溶液流過(guò)第一固相載體，以取得一次篩選液，其中，一次篩選液含有特定大小的核酸片段；混合一次篩選液與第二結(jié)合緩沖液以產(chǎn)生第二混合溶液，其中，第二混合溶液具有離液鹽以及單價(jià)離子鹽或擁擠試劑至少其中之一；使第二混合溶液流過(guò)第二固相載體，藉由所述單價(jià)離子鹽濃度的高低來(lái)控制將欲保留的特定大小的核酸片段結(jié)合于第二固相載體，其中當(dāng)單價(jià)離子鹽濃度愈高則保留愈大的核酸片段及當(dāng)單價(jià)離子鹽濃度愈低則保留大范圍的核酸片段,其中大范圍的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段；使沖洗緩沖液流過(guò)第二固相載體以清除未與第二固相載體結(jié)合的物質(zhì)；以及使水溶液流過(guò)第二固相載體以回收欲保留的特定片段大小的核酸片段。為達(dá)成前述目的，本發(fā)明另一種選擇性分離核酸之套組，包含有結(jié)合緩沖液以及固相載體。其中，結(jié)合緩沖液具有離液鹽，以及單價(jià)離子鹽或擁擠試劑至少其中之一，其特征在于：其中當(dāng)單價(jià)離子鹽濃度愈高則保留愈大的核酸片段及當(dāng)單價(jià)離子鹽濃度愈低則保留大范圍的核酸片段,其中大范圍的核酸片段包含大尺寸的核酸片段及小尺寸的核酸片段。有關(guān)本發(fā)明的詳細(xì)特點(diǎn)，將于后續(xù)的詳細(xì)說(shuō)明中予以描述。然而，在本發(fā)明領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者應(yīng)能了解，該等詳細(xì)說(shuō)明以及實(shí)施本發(fā)明所列舉的特定實(shí)施例，僅用于說(shuō)明本發(fā)明，并非用以限制本發(fā)明的專(zhuān)利申請(qǐng)范圍。附圖說(shuō)明圖1(a)至圖1(c)是根據(jù)本發(fā)明所揭露的技術(shù)，表示以不同濃度與種類(lèi)的離液鹽處理DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液后，核酸片段的分離情形。其中，圖1(a)的第1欄至第7欄分別為以表1-1中條件1至7處理的結(jié)果；圖1(b)的第8欄至第14欄分別為以表1-2條件8至14處理的結(jié)果；及圖1(c)的第15欄至第17欄分別為以表1-3條件15至17處理的結(jié)果，第18欄至第20欄分別為以表1-4條件18至20處理的結(jié)果；及圖1(a)至圖1(c)中的M欄為未處理的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。圖2(a)至圖2(e)是根據(jù)本發(fā)明所揭露的技術(shù)，表示離液鹽在相同濃度下加入不同濃度與種類(lèi)的單價(jià)離子鹽處理DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液后，核酸片段的分離情形。其中，圖2(a)中的第1欄至第7欄分別為以表2-1條件1至7處理的結(jié)果；圖2(b)至圖2(e)中的第1欄至第7欄分別為以表2-3條件1至7處理的結(jié)果；圖2(f)中的第1欄至第7欄分別為以表2-8條件1至7處理的結(jié)果；及圖2(a)至圖2(e)中的M欄為未處理的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。圖3(a)至圖3(c)是根據(jù)本發(fā)明所揭露的技術(shù)，表示相同離液鹽濃度下加入不同濃度的擁擠試劑處理DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液后，核酸片段的分離情形。其中，圖3(a)中的第1欄至第5欄分別為以表3-1條件1至5處理的結(jié)果；圖3(b)中的第1欄至第5欄分別為以表3-2條件6至10處理的結(jié)果；圖3(c)中的第1欄至第3欄分別為以表3-3條件1至3處理的結(jié)果，第4欄至第6欄分別為以表3-4條件4至6處理的結(jié)果；圖3(a)至圖3(c)中的M欄為未處理的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。圖4是根據(jù)本發(fā)明所揭露的技術(shù)，表示混合搭配離液鹽、單價(jià)離子鹽與擁擠試劑，以硅質(zhì)濾柱作為固相載體，在利用不同混合溶液的條件下，篩選一至三次，以觀察核酸片段的分離情形。其中，第AE1欄至第CE3欄分別為以表4-1中的混合溶液條件AM1至CM3處理的結(jié)果，M欄為未處理的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。圖5是根據(jù)本發(fā)明所揭露的技術(shù)，表示混合搭配離液鹽、單價(jià)離子鹽與擁擠試劑，以硅質(zhì)磁珠作為固相載體，在利用不同混合溶液的條件下，篩選一至三次，以觀察核酸片段的分離情形。其中，第DE1欄至第EE3欄分別為以表4-2中的混合溶液條件DM1至EM3處理的結(jié)果，M欄為未處理的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。具體實(shí)施方式本發(fā)明所揭露的選擇性分離核酸的方法及套組，讓操作者可依照預(yù)定的酸序列長(zhǎng)度需求，輕易地從含有序列長(zhǎng)度不一的核酸樣本中，分離出特定序列長(zhǎng)度的核酸。亦即，本發(fā)明提供的方法及套組可讓使用者選擇性分離出特定序列長(zhǎng)度的核酸并直接應(yīng)用至后續(xù)工序，能提高后續(xù)應(yīng)用的效能。此外，由于本發(fā)明提供之方法及套組所使用的溶液環(huán)境簡(jiǎn)單且穩(wěn)定，無(wú)需調(diào)控溶液環(huán)境中的酸堿值(pH值)，亦無(wú)須倚賴(lài)特定改質(zhì)官能基的載體(例如表面羧基化、胺基化)，適合應(yīng)用于現(xiàn)有的自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行高通量的操作。本發(fā)明所揭露的方法與套組僅利用離液鹽(chaotropicsalt)、單價(jià)離子鹽與擁擠試劑(crowdingagent)在不同濃度的環(huán)境下，直接影響核酸滯留性的特性，以分階段篩除或滯留的概念，發(fā)展出一種簡(jiǎn)易、好操作、應(yīng)用性廣泛且可輕易調(diào)整溶液條件的低成本選擇性核酸分離方法及套組。本發(fā)明所述的「核酸」包含但不限于人工合成、天然來(lái)源或人工合成與天然來(lái)源混摻的核酸。序列片段的大小、長(zhǎng)度或尺寸是指任何單股、雙股、互補(bǔ)序列的天然或人工合成核酸，包含DNA、RNA的單元體所組成的核酸序列，及其核酸單元體的數(shù)量。核酸單元體是指組成核酸序列的計(jì)數(shù)單元，常用的計(jì)數(shù)單元包含堿基、核苷酸等分子?！笁A基」表示核酸單元體；此外，為利于說(shuō)明，下文分別以大片段、小片段之用語(yǔ)僅用于描述在特定實(shí)施條件下，依技術(shù)常識(shí)區(qū)分為相對(duì)較長(zhǎng)或較短之核酸序列，并無(wú)意特定限制核酸序列的長(zhǎng)度，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知之慣用描述，不再贅述。此外，此方法中所使用之核酸純化之材料、技術(shù)之原理、特性、設(shè)備、基本操作流程，已為相關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
具有通常知識(shí)者所能明了，故下文不再作完整描述。本發(fā)明所稱(chēng)的離液鹽是指可影響水溶液水分子排列的物質(zhì)，可使如蛋白質(zhì)與核酸等大分子的分子間氫鍵強(qiáng)度改變。本發(fā)明所適用的離液鹽種類(lèi)包含但不限于：硫氰酸胍(Guanidinethiocyanate；GuSCN)、鹽酸胍(Guanidinehydrochloride；GuHCl)、碘化鈉(Sodiumiodide；NaI)、過(guò)氯酸鈉(Sodiumperchlorate；NaClO4)。本發(fā)明所適用的離液鹽在不同濃度下對(duì)于核酸片段尺寸的選擇性不同，具體而言，上述離液鹽濃度較低時(shí)，僅能保留較大片段的核酸在固相載體中，而濾除較小片段的核酸至濾液(flow-through)當(dāng)中，隨著濃度的增加，本發(fā)明所適用的離液鹽可以逐漸將較小片段的核酸保留在固相載體上。本發(fā)明所稱(chēng)的單價(jià)離子鹽是指由單價(jià)陽(yáng)離子與單價(jià)陰離子以離子鍵結(jié)合而成的化合物，而本發(fā)明所適用的單價(jià)離子鹽種類(lèi)包含：?jiǎn)蝺r(jià)陽(yáng)離子氯化鹽、單價(jià)陽(yáng)離子醋酸鹽。其中，單價(jià)陽(yáng)離子氯化鹽包含但不限于：氯化鋰(LiCl)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化銨(NH4Cl)，本實(shí)施例中以氯化鋰為一個(gè)較佳的實(shí)驗(yàn)例。而單價(jià)陽(yáng)離子醋酸鹽包含但不限于：醋酸鋰(LiOAc)、醋酸鈉(NaOAc)、醋酸鉀(KOAc)、醋酸銨(NH4OAc)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)，利用醋酸鋰、醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨測(cè)試單價(jià)離子鹽搭配離液鹽所達(dá)成核酸片段尺寸的選擇性。由實(shí)驗(yàn)可得知單價(jià)陽(yáng)離子鹽類(lèi)在不同濃度對(duì)于核酸片段尺寸的選擇性，具體而言，單價(jià)陽(yáng)離子鹽類(lèi)濃度較低時(shí)，能保留片段尺寸較小的核酸在固相載體中；隨著單價(jià)陽(yáng)離子鹽類(lèi)濃度的增加，逐漸喪失對(duì)較小片段核酸的保留能力，僅能將較大片段的核酸保留于固相載體中，濾除較大范圍(指核酸尺寸分布的范圍)的小片段核酸至濾液中。本發(fā)明所指稱(chēng)的擁擠試劑是指可占有溶液的大部分體積而造成使得其溶質(zhì)聚集或濃縮于較少水溶液中，包含單元醇類(lèi)、多元醇類(lèi)及大分子聚合物等。本發(fā)明所適用的擁擠試劑種類(lèi)包含但不限于：乙醇(Ethanol)、異丙醇(Isopropanol)、聚乙二醇(Polyethyleneglycol；PEG)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，分別以乙醇、異丙醇、聚乙二醇測(cè)試擁擠試劑搭配離液鹽所達(dá)成核酸片段尺寸的選擇性。當(dāng)擁擠試劑溶液濃度較低時(shí)，僅能保留較大片段的核酸在固相載體中，而濾除較小片段的核酸至濾液中；隨著濃度的增加，上述擁擠試劑可以逐漸將較小片段的核酸保留在固相載體中。以下將藉由所列舉的實(shí)驗(yàn)，配合隨附的圖式，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容及特征。實(shí)驗(yàn)一：不同種類(lèi)和不同濃度的離液鹽對(duì)于選擇核酸片段大小的影響將20μL1kbDNA標(biāo)準(zhǔn)品(SharpDNALadderMarkers1kb，ELPISBiotech，韓國(guó))與20μL100bpDNA標(biāo)準(zhǔn)品(SharpDNALadderMarkers100bp，ELPISBiotech，韓國(guó))混合作為測(cè)試用的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。如以下表1-1至表1-4所示，將前述40μLDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液與結(jié)合緩沖液混合之后，在混合溶液的最終體積200μL、濃度介于0.6M至4M之間的鹽酸胍(guanidinehydrochloride；GuHCl)、最終體積200μL、濃度介于0.6M至4M之間的異硫氰酸胍(guanidinethiocyanate；GuSCN)、最終體積200μL、濃度介于2.5M至3.5M之間的碘化鈉(sodiumiodide；NaI)以及最終體積200μL、濃度介于2.5M至3.5M之間的過(guò)氯酸鈉(sodiumperchlorate；NaClO4)等條件下，測(cè)得各條件下最終混合溶液內(nèi)的pH值分別介于5.44至5.84、5.59至5.73、6.25至6.40以及6.66至6.57，由此可知，混合溶液的pH值并不會(huì)隨著離液鹽的濃度的高低而有明顯的差異。接著，將混合溶液加入硅質(zhì)濾柱(SpinColumns,Qiagen)中，并以轉(zhuǎn)速為13000rpm進(jìn)行離心1分鐘，使DNA與硅質(zhì)濾柱中的固相載體結(jié)合。于離心之后，在硅質(zhì)濾柱內(nèi)加入60％酒精500μL作為清洗緩沖液，再次以轉(zhuǎn)速為13000rpm進(jìn)行離心1分鐘，以清除掉未與硅質(zhì)濾柱結(jié)合的DNA片段。接著，在硅質(zhì)濾柱內(nèi)加入40μL的水，以轉(zhuǎn)速為13000rpm離心1分鐘，使DNA與硅質(zhì)濾柱分離，取得最終產(chǎn)物。將在前述條件的濃度下進(jìn)行核酸篩選的產(chǎn)物進(jìn)行膠體電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(a)與表1-1至表1-4所示。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)可以得知，當(dāng)離液鹽濃度較低時(shí)，僅能滯留較大片段的核酸在硅質(zhì)濾柱中，而濾除較小片段的核酸至濾液(flow-through)中；隨著濃度的增加，上述離液鹽可以逐漸將較小片段的核酸滯留在硅質(zhì)濾柱中。圖1(a)顯示不同濃度的鹽酸胍下，核酸片段的分離情形，可以看到，在鹽酸胍濃度為0.6M時(shí)，會(huì)篩選出大于4000bp的核酸片段，亦即小于4000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在鹽酸胍濃度為0.7M時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在鹽酸胍濃度為0.8M時(shí)，會(huì)篩選出大于300bp的核酸片段，亦即小于300bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在鹽酸胍濃度為0.9M時(shí)，會(huì)篩選出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在鹽酸胍濃度為1M時(shí)，會(huì)篩選出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段都被篩選掉了；在鹽酸胍濃度為2M與4M時(shí)，會(huì)篩選出大于100bp的核酸片段，亦即小于100bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。上述鹽酸胍濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表1-1所示。表1-1:鹽酸胍濃度與所篩選的核酸片段大小關(guān)連性圖1(b)另顯示出不同濃度的異硫氰酸胍下，核酸片段的分離情形。在異硫氰酸胍濃度為0.6M時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在異硫氰酸胍濃度為0.7M時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在異硫氰酸胍濃度為0.8M、0.9M和1M時(shí)，會(huì)篩選出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在異硫氰酸胍濃度為1.5M和3M時(shí)，會(huì)篩選出大于100bp的核酸片段，亦即小于100bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。上述異硫氰酸胍濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表1-2所示。表1-2:異硫氰酸胍濃度與所篩選的核酸片段大小關(guān)連性表1-1、表1-2，列舉不同的離液鹽濃度與核酸片段尺寸大小的選擇性，其中所列的數(shù)據(jù)反映出上述胍在不同的濃度離液鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍)對(duì)于核酸片段尺寸的選擇性。圖1(c)顯示出不同濃度的碘化鈉下，核酸片段的分離情形。在碘化鈉濃度為2.5M時(shí)，并未明顯看到有核酸片段固相載體結(jié)合而被保留下來(lái)；在碘化鈉濃度為3M時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在碘化鈉濃度為3.5M時(shí)，會(huì)篩選出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。上述碘化鈉濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表1-3所示。表1-3:碘化鈉濃度與所篩選的核酸片段大小關(guān)連性圖1(c)另顯示出不同濃度的過(guò)氯酸鈉下，核酸片段的分離情形。在過(guò)氯酸鈉濃度為2.5M時(shí)，并未明顯看到有核酸片段與固相載體結(jié)合而被保留下來(lái)；在過(guò)氯酸鈉濃度為3M時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在過(guò)氯酸鈉濃度為3.5M時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。上述過(guò)氯酸鈉濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表1-4所示。表1-4:過(guò)氯酸鈉濃度與所篩選的核酸片段大小關(guān)連性透過(guò)實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果可以得知，不論是異硫氰酸胍、鹽酸胍、碘化鈉或是過(guò)氯酸鈉，隨著離液鹽濃度的增加，可以抓取到更小片段的核酸，反之亦然。再者，透過(guò)實(shí)際量測(cè)混合溶液內(nèi)的酸堿值，可以發(fā)現(xiàn)混合溶液內(nèi)的pH值變動(dòng)范圍非常小，顯示透過(guò)不同濃度的離液鹽能夠選擇性地分離不同片段大小的核酸，此一特性與混合溶液內(nèi)的pH值并無(wú)相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)二：相同離液鹽濃度下，不同濃度、不同種類(lèi)的單價(jià)離子鹽類(lèi)對(duì)于篩選核酸片段大小的影響1.異硫氰酸胍加上不同濃度的氯化鋰測(cè)試用之DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液依照實(shí)驗(yàn)一的方式加以配制。將40μLDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與不同條件的200μL結(jié)合緩沖液混合均勻之后，依照實(shí)驗(yàn)一的方式進(jìn)行核酸的篩選。其中，最終混合溶液的組成條件如表2-1所示，異硫氰酸胍最終濃度固定為0.833M，加上最終濃度分別為0.104M、0.208M、0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M的氯化鋰(LiCl)。表2-1:最終混合溶液內(nèi)的組成條件條件異硫氰酸胍濃度氯化鋰濃度10.833M0.104M20.833M0.208M30.833M0.3125M40.833M0.416M50.833M0.52M60.833M0.625M將加入前述組合條件1到6的結(jié)合緩沖溶液進(jìn)行核酸篩選的產(chǎn)物進(jìn)行膠體電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2(a)與表2-2所示。圖2(a)顯示異硫氰酸胍濃度0.833M加上不同濃度氯化鋰作為結(jié)合緩沖液，測(cè)得各條件下最終混合溶液內(nèi)的pH值介于5.82至5.88，篩選后產(chǎn)物的核酸片段分離情形。在氯化鋰濃度為0.104M、0.208M、0.3125M時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在氯化鋰濃度為0.416M和0.52M時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在氯化鋰濃度為0.625M時(shí)，會(huì)篩選出大于2000bp的核酸片段，亦即小于2000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉?；旌先芤褐新然嚌舛扰c核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表2-2所示。表2-2:氯化鋰濃度與所篩選的核酸片段大小因此，藉由上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知，當(dāng)離液鹽(異硫氰酸胍)的濃度固定時(shí)(0.833M)，利用濃度較低單價(jià)離子鹽(氯化鋰)，可以分離出較小的核酸片段；當(dāng)單價(jià)離子鹽的濃度愈來(lái)愈高時(shí)，可以分離出較大的核酸片段，因此，使用者可以依據(jù)欲分離的核酸片段的尺寸大小，來(lái)取用所需要的單價(jià)離子鹽的濃度。此外，具有離液鹽和單價(jià)離子鹽的混合溶液中的酸堿值(pH值)并不會(huì)因?yàn)閱蝺r(jià)離子鹽的濃度的高低而有所影響，因此在本發(fā)明所揭露的技術(shù)中，混合溶液的pH值不是造成核酸片段分離的因素。2.以醋酸根為陰離子測(cè)試四種不同的一價(jià)陽(yáng)離子測(cè)試用的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液依照實(shí)驗(yàn)一的方式加以配制。將40μLDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與不同條件的200μL結(jié)合緩沖液混合均勻之后，依照實(shí)驗(yàn)一的方式進(jìn)行核酸的篩選。其中，最終混合溶液的組成條件如表2-3所示，異硫氰酸胍最終濃度固定為0.833M，加上陰離子為醋酸根(OAc-)、陽(yáng)離子各為鋰(Li+)、鈉(Na+)、鉀(K+)和銨根(NH4+)的鹽類(lèi)，最終濃度分別為0.104M、0.208M、0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M。表2-3:本實(shí)驗(yàn)所使用的最終混合溶液的組成條件條件異硫氰酸胍濃度XOAc濃度10.833M0.104M20.833M0.208M30.833M0.3125M40.833M0.416M50.833M0.52M60.833M0.625M備注：X為L(zhǎng)i、Na、K或NH4將前述組合條件1到6的最終混合溶液進(jìn)行核酸篩選后的產(chǎn)物進(jìn)行膠體電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2(b)至圖2(e)與表2-4至表2-7所示。圖2(b)顯示異硫氰酸胍濃度0.833M加上不同濃度醋酸鋰(LiOAc)作為結(jié)合緩沖液，測(cè)得各條件下最終混合溶液內(nèi)的pH值介于7.77至7.90之間，篩選后產(chǎn)物的核酸片段分離情形。在醋酸鋰濃度為0.104M時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸鋰濃度為0.208M時(shí)，會(huì)篩選出大于5000bp的核酸片段，亦即小于5000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸鋰濃度為0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M時(shí)，沒(méi)有留下任何核酸片段，亦即沒(méi)有任何核酸片段與載體結(jié)合了。最終混合溶液中醋酸鋰濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表2-4所示。表2-4:醋酸鋰濃度與所篩選的核酸片段大小圖2(c)顯示最終混合溶液中含有異硫氰酸胍濃度0.833M加上不同濃度醋酸鈉(NaOAc)，且測(cè)得各條件下最終混合溶液內(nèi)的pH值介于7.76至8.03，篩選后產(chǎn)物的核酸片段分離情形。在醋酸鈉濃度為0.104M時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸鈉濃度為0.208M時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸鈉濃度為0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M時(shí)，沒(méi)有留下任何核酸片段，亦即所有核酸片段都與載體結(jié)合。結(jié)合緩沖液中醋酸鈉濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表2-5所示。表2-5:醋酸鈉濃度與所篩選的核酸片段大小圖2(d)顯示最終混合溶液中含有異硫氰酸胍濃度0.833M加上不同濃度醋酸鉀(KOAc)的條件下，測(cè)得各條件下混合溶液之pH值介于7.88至8.03之間，篩選后產(chǎn)物的核酸片段分離情形。在醋酸鉀濃度為0.104M時(shí)，會(huì)篩選出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸鉀濃度為0.208M時(shí)，會(huì)篩選出大于300bp的核酸片段，亦即小于300bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸鉀濃度為0.3125M時(shí)，會(huì)篩選出大于400bp的核酸片段，亦即小于400bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸鉀濃度為0.416M和0.52M時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸鉀濃度為0.625M時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。最終混合溶液中醋酸鉀濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表2-6所示。表2-6:醋酸鉀濃度與所篩選的核酸片段大小圖2(e)顯示最終混合溶液中含有異硫氰酸胍濃度0.833M加上不同濃度醋酸銨(NH4OAc)的條件下，測(cè)得最終混合溶液內(nèi)的pH值介于6.58至6.68之間，篩選后產(chǎn)物的核酸片段分離情形。在醋酸銨濃度為0.104M時(shí)，會(huì)篩選出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸銨濃度為0.208M時(shí)，會(huì)篩選出大于300bp的核酸片段，亦即小于300bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸銨濃度為0.3125M時(shí)，會(huì)篩選出大于400bp的核酸片段，亦即小于400bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸銨濃度為0.416M時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸銨濃度為0.52M時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在醋酸銨濃度為0.625M時(shí)，會(huì)篩選出大于2000bp的核酸片段，亦即小于2000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。最終混合溶液中醋酸銨濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表2-7所示。表2-7:醋酸銨濃度與所篩選的核酸片段大小圖2(b)至圖2(e)與表2-4至表2-7所顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來(lái)，在以醋酸根為陰離子的條件之下，不同濃度的四種鹽類(lèi)醋酸鋰、醋酸鈉、醋酸鉀和醋酸銨對(duì)于核酸片段大小的篩選上均有所不同。也能夠很明顯的看出，四種不同的一價(jià)陽(yáng)離子對(duì)于不同大小的核酸片段具有顯著的篩選差異。3.以碘化鈉作為單離子鹽測(cè)試醋酸銨濃度對(duì)于選擇核酸片段大小的影響測(cè)試用的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液依照實(shí)驗(yàn)一的方式加以配制。將40μLDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與不同條件的200μL結(jié)合緩沖液混合均勻之后，依照實(shí)驗(yàn)一的方式進(jìn)行核酸的篩選。其中，最終混合溶液的組成條件如表2-8所示，碘化鈉最終濃度固定為3M，加上醋酸銨最終濃度分別為0.104M、0.208M、0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M。圖2(f)顯示最終混合溶液含有碘化鈉濃度3M加上不同濃度醋酸銨作為結(jié)合緩沖液，測(cè)得各條件下最終混合溶液內(nèi)的pH值介于6.70至6.88，篩選后產(chǎn)物的核酸片段分離情形。在醋酸鈉濃度為0.104M、0.208M時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；醋酸鈉濃度為0.3125M、0.416M、0.52M和0.625M時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。最終混合溶液中加入碘化鈉作為離液鹽時(shí)，醋酸鈉濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表2-8所示。表2-8:最終混合溶液中加入碘化鈉作為離液鹽時(shí)醋酸銨濃度與所篩選的核酸片段大小圖2(f)與表2-8所顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來(lái)，在最終混合溶液中含有碘化鈉作為離液鹽的條件下，不同濃度的醋酸銨對(duì)于核酸片段大小的選擇上均有所不同。透過(guò)實(shí)驗(yàn)二的結(jié)果可以得知，在相同的離液鹽濃度下，隨著特定單價(jià)離子鹽的濃度增加，小片段核酸與固相載體之結(jié)合能力隨之降低，即當(dāng)特定的單價(jià)陽(yáng)離子鹽類(lèi)濃度較低時(shí)，能將片段尺寸較小的核酸滯留于固相載體中，隨著濃度的增加，特定單價(jià)陽(yáng)離子鹽類(lèi)逐漸喪失對(duì)較小片段核酸的滯留，僅能將較大片段的核酸滯留在固相載體中，并且將較小片段核酸篩除至濾液中。不管是以氯化鋰，或是醋酸根離子為固定的陰離子種類(lèi)，搭配四種不同的一價(jià)陽(yáng)離子(鋰、鈉、鉀、銨)，都相同趨勢(shì)，其中又以醋酸根離子為陰離子的鹽類(lèi)最為顯著，而不同的單價(jià)陽(yáng)離子對(duì)于核酸大小篩選亦具有差異性。再者，透過(guò)實(shí)際量測(cè)混合溶液內(nèi)的酸堿值，可以發(fā)現(xiàn)混合溶液內(nèi)的pH值變動(dòng)范圍非常小，顯示透過(guò)離液鹽與單價(jià)離子鹽的搭配，能夠選擇性地分離不同片段大小的核酸，此一特性與混合溶液內(nèi)的pH值并無(wú)相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)三：相同離液鹽濃度搭配不同濃度、種類(lèi)的擁擠試劑對(duì)于篩選核酸片段大小的影響1.不同濃度、種類(lèi)的擁擠試劑對(duì)于篩選核酸片段大小的影響測(cè)試用DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液依照實(shí)驗(yàn)一的方式加以配制。將40μLDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與不同條件的200μL結(jié)合緩沖液混合均勻之后，依照實(shí)驗(yàn)一的方式進(jìn)行核酸的篩選。其中，最終混合溶液的組成條件分別如表3-1、表3-2所示，異硫氰酸胍最終濃度固定為0.52M，加上最終濃度分別為2.5％、5％、10％、15％、20％的乙醇(ethanol)，或是最終濃度分別為2.5％、5％、10％、15％、20％的異丙醇(isopropanol)。將條件1到11的最終混合溶液進(jìn)行核酸篩選的產(chǎn)物進(jìn)行膠體電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(a)、圖3(b)與表3-1、表3-2所示。圖3(a)顯示最終混合溶液中含有異硫氰酸胍濃度0.52M加上不同濃度乙醇，測(cè)得最終混合溶液內(nèi)的pH值介于6.04至6.22之間，篩選后產(chǎn)物的核酸片段分離情形。在乙醇濃度為2.5％時(shí)，會(huì)篩選出大于3000bp的核酸片段，亦即小于3000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在乙醇濃度為5％時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在乙醇濃度為10％時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在乙醇濃度為15％時(shí)，會(huì)篩選出大于300bp的核酸片段，亦即小于300bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在乙醇濃度為20％時(shí)，會(huì)篩選出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。最終混合溶液中乙醇濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表3-1所示。表3-1:乙醇濃度與所篩選的核酸片段大小關(guān)連性圖3(b)顯示最終混合溶液含有異硫氰酸胍濃度0.52M加上不同濃度異丙醇的條件下，測(cè)得最終混合溶液內(nèi)的pH值介于5.79至6.01之間，篩選后產(chǎn)物的核酸片段分離情形。在異丙醇濃度為2.5％時(shí)，會(huì)篩選出大于2000bp的核酸片段，亦即小于2000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在異丙醇濃度為5％時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在異丙醇濃度為10％時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在異丙醇濃度為15％時(shí)，會(huì)篩選出大于300bp的核酸片段，亦即小于300bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在異丙醇濃度為20％時(shí)，會(huì)篩選出大于200bp的核酸片段，亦即小于200bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。最終混合溶液中異丙醇濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表3-2所示。表3-2:異丙醇類(lèi)濃度與所篩選的核酸片段大小關(guān)連性圖3(a)、圖3(b)與表3-1、表3-2所顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來(lái)，不同濃度的乙醇和異丙醇對(duì)于核酸片段大小的篩選上均有所不同，隨著醇類(lèi)的濃度增加，小片段的核酸越能夠被抓取，反之亦然。2.不同濃度、分子量的聚二乙醇對(duì)于篩選核酸片段大小的影響測(cè)試用DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液依照實(shí)驗(yàn)一的方式加以配制。將40μLDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與不同條件的200μL結(jié)合緩沖液混合均勻之后，依照實(shí)驗(yàn)一的方式進(jìn)行核酸的篩選。其中，最終混合溶液內(nèi)的組成條件分別如表3-3、表3-4所示，異硫氰酸胍最終濃度固定為0.6M，加上最終濃度分別為10％、15％、20％的聚乙二醇(PEG4000)，或是最終濃度分別為10％、15％、20％的聚乙二醇(PEG8000)。將條件12到17的最終混合溶液進(jìn)行核酸篩選的產(chǎn)物進(jìn)行膠體電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(c)與表3-3、表3-4所示。圖3(c)顯示最終混合溶液含有異硫氰酸胍濃度0.6M加上不同濃度聚乙二醇(PEG4000)作為結(jié)合緩沖液，測(cè)得各條件下最終混合溶液內(nèi)的pH值介于5.83to5.92，篩選后產(chǎn)物的核酸片段分離情形。在聚乙二醇(PEG4000)濃度為10％時(shí)，會(huì)篩選出大于1000bp的核酸片段，亦即小于1000bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在聚乙二醇(PEG4000)濃度為15％、20％時(shí)，會(huì)篩選出大于100bp的核酸片段，亦即小于100bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。最終混合溶液中聚乙二醇(PEG4000)濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理表3-3所示。表3-3:聚乙二醇(PEG4000)濃度與所篩選的核酸片段大小關(guān)連性圖3(c)另顯示最終混合溶液中含有異硫氰酸胍濃度0.6M加上不同濃度聚乙二醇(PEG8000)作為結(jié)合緩沖液，測(cè)得各條件下最終混合溶液內(nèi)的pH值介于5.83至5.98，篩選后產(chǎn)物的核酸片段分離情形。在聚乙二醇(PEG8000)濃度為10％時(shí)，會(huì)篩選出大于500bp的核酸片段，亦即小于500bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉；在聚乙二醇(PEG8000)濃度為15％、20％時(shí)，會(huì)篩選出大于100bp的核酸片段，亦即小于100bp的核酸片段不會(huì)與固相載體結(jié)合而被剔除掉。最終混合溶液中聚乙二醇(PEG8000)濃度與核酸片段篩選的關(guān)連性，整理如表3-4所示。表3-4:高分子量聚乙二醇濃度與所篩選的核酸片段大小關(guān)連性圖3(c)與表3-3、表3-4所顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來(lái)，不同濃度與分子量大小的聚二乙醇對(duì)于核酸片段大小的選擇上還是稍有不同，在相同的離液鹽(異硫氰酸胍)濃度的條件下，隨著聚二乙醇的濃度增加，小片段的核酸越能夠被抓取，反之亦然。另外，針對(duì)分子量大小的聚乙二醇來(lái)說(shuō)，較大的聚二乙醇，越能夠抓取小片段的核酸。從實(shí)驗(yàn)三所顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來(lái)，不同濃度的乙醇和異丙醇，或是不同濃度與分子量的聚乙二醇對(duì)于核酸片段大小的篩選上均有所不同，隨著擁擠試劑的濃度增加，或是分子量的增加，小片段的核酸越能夠被抓取，反之亦然。再者，透過(guò)實(shí)際量測(cè)混合溶液內(nèi)的酸堿值，可以發(fā)現(xiàn)混合溶液內(nèi)的pH值變動(dòng)范圍非常小，顯示透過(guò)不同濃度的離液鹽與擁擠試劑的搭配，能夠選擇性地分離不同片段大小的核酸，此一特性與混合溶液內(nèi)的pH值并無(wú)相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)四：混合搭配離液鹽、單價(jià)離子鹽與擁擠試劑以分離特定核酸片段1.以硅質(zhì)濾柱作為固相載體測(cè)試用的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液依照實(shí)驗(yàn)一的方式加以配制。將40μLDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與60μL結(jié)合緩沖液A1、B1、C1混合均勻，形成混合溶液AM1、BM1、CM1，混合均勻后測(cè)得AM1、BM1、CM1的pH值分別為6.66、6.63、6.62。將AM1、BM1、CM1分別加入第一硅質(zhì)濾柱，以轉(zhuǎn)速為13000rpm離心1分鐘，取得第一次篩選后的濾液AF1、BF1、CF1。將AF1、BF1、CF1加入100μL、0.9M的異硫氰酸胍，形成混合溶液AM2、BM2、CM2，混合均勻后測(cè)得AM2、BM2、CM2的pH值分別為6.54、6.61、6.53。將AM2、BM2、CM2分別加入第二硅質(zhì)濾柱，以轉(zhuǎn)速為13000rpm離心1分鐘，取得第二次篩選后的濾液AF2、BF2、CF2。在AF2、BF2、CF2分別加入40μL、20μL、10μL、100％異丙醇，形成混合溶液AM3、BM3、CM3，混合均勻后測(cè)得AM3、BM3、CM3的pH值分別為6.60、6.56、6.55。將AM3、BM3、CM3分別加入第三硅質(zhì)濾柱，以轉(zhuǎn)速為13000rpm離心1分鐘后，丟棄第三次篩選后的濾液。各混合溶液內(nèi)各成分的最終濃度及其pH值整理如表4-1所示。表4-1:各混合溶液內(nèi)各成分的最終濃度與pH值分別在第一、二、三硅質(zhì)濾柱中加入60％的乙醇沖洗，以轉(zhuǎn)速為13000rpm離心1分鐘后，加入40μL純水再次以轉(zhuǎn)速為13000rpm離心1分鐘，分別取得第一次篩選的產(chǎn)物AE1、BE1、CE1，第二次篩選的產(chǎn)物AE2、BE2、CE2，和第三次篩選的產(chǎn)物AE3、BE3、CE3，將這些產(chǎn)物進(jìn)行膠體電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4與表4-2所示。表4-2:各混合溶液所篩選的核酸片段大小根據(jù)表4-1、表4-2以及上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AM1、AM2、BM1、BM2、CM1、CM2在相同的離液鹽(異硫氰酸胍)的濃度條件下，不同濃度的單價(jià)離子鹽可保留之核酸片段大小也不同，即如同先前所述，單價(jià)離子鹽濃度愈高可保留之核酸片段較小，較低的單價(jià)離子鹽濃度，可保留之核酸片段范圍較大，即大范圍的核酸片段指的是包含有大尺寸的核酸片段、中尺寸及/或小尺寸的核酸片段。2.以硅質(zhì)磁珠作為固相載體測(cè)試用的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液依照實(shí)驗(yàn)一的方式加以配制。將40μLDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與60μL結(jié)合緩沖液D1(1.5M異硫氰酸胍、0.8M醋酸銨)與E1(2.5M異硫氰酸胍、2.5M醋酸銨)混合均勻，形成混合溶液DM1、EM1，混合均勻后測(cè)得DM1、EM1的pH值分別為6.53、6.60。將DM1、EM1分別與第一硅質(zhì)磁珠(MagneticbeadsMF-SIL-5024，磁量生技，中國(guó)臺(tái)灣新北市)混合，以震蕩器震蕩5分鐘后，放置于磁座上吸附磁珠1分鐘，取得第一次篩選后的上清液DS1、ES1。將DS1加入20μL、100％的異丙醇、ES1加入100μL、2.5M的異硫氰酸胍，形成混合溶液DM2、EM2，混合均勻后測(cè)得DM2、EM2的pH值分別為6.60、6.54。將DM2、EM2分別與第二硅質(zhì)磁珠混合，以震蕩器震蕩5分鐘后，放置于磁座上吸附磁珠1分鐘，取得第二次篩選后的上清液DS2、ES2。將DS2加入120μL、2.5M的異硫氰酸胍，ES2加入200μL、100％的異丙醇，形成混合溶液DM3、EM3，混合均勻后測(cè)得DM3、EM3的pH值分別為6.51、6.61。各混合溶液內(nèi)各成分的最終濃度及其pH值整理如表4-3所示。表4-3:各混合溶液內(nèi)各成分的最終濃度與pH值分別在第一、二、三硅質(zhì)磁珠中加入60％的乙醇沖洗，震蕩30秒后置放在磁座上1分鐘，移除上清液，室溫風(fēng)干5分鐘后，再加入40μL純水，再次震蕩1分鐘后置放在磁座上1分鐘，分別抽出上清液，取得第一次篩選的產(chǎn)物DE1、EE1，第二次篩選的產(chǎn)物DE2、EE2，和第三次篩選的產(chǎn)物DE3、EE3，將這些產(chǎn)物進(jìn)行膠體電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5與表4-4所示。表4-4:各混合溶液所篩選的核酸片段大小產(chǎn)物代號(hào)所篩選的核酸片段大小DE1大於1000bpDE21000至200bpDE3100bpEE1大於1000bpEE21000至200bpEE3100bp根據(jù)表4-3、表4-4以及上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，DM2與DM3是當(dāng)離液鹽濃度增加、單價(jià)離子鹽濃度降低而擁擠試劑濃度降低時(shí)，所篩選的核酸片段大小愈來(lái)愈?。挥蒃M1、EM2可知，當(dāng)離液鹽濃度增加、單價(jià)離子鹽濃度降低，所篩選的核酸片段大小愈來(lái)愈小。由圖4與圖5的結(jié)果可知，經(jīng)由上述篩選步驟，不論是使用硅質(zhì)濾柱或是硅質(zhì)磁珠，只要配合最適的混合溶液條件，即離液鹽濃度、單價(jià)離子鹽濃度及/或擁劑試劑的濃度便可將不同大小的核酸片段進(jìn)行分離，更可成功取得所需要的大片段或是小片段核酸，而選取片段大小的區(qū)間，也可透過(guò)如本發(fā)明所揭露的四個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)方式:如實(shí)驗(yàn)一所述的不同濃度的離液鹽、如實(shí)驗(yàn)二所述的相同的離液鹽濃度搭配不同濃度的單價(jià)離子鹽、如實(shí)驗(yàn)三所述的相同的離液鹽濃度搭配不同濃度的擁劑試劑及如實(shí)驗(yàn)四所述的使用離液鹽、單價(jià)離子鹽及擁擠試劑組合而成的混合溶液來(lái)達(dá)成核酸片段的篩選的目的，因此可按照操作環(huán)境的需求根據(jù)本發(fā)明所揭露的各種實(shí)驗(yàn)方式來(lái)進(jìn)行各種組合的調(diào)整。依照各個(gè)電泳圖中篩選后的核酸片段與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的核酸片段所顯示的亮度比較顯示，本發(fā)明的回收率理想，而適合應(yīng)用于各片段核酸的分離、純化及回收。再者，透過(guò)實(shí)際量測(cè)混合溶液內(nèi)的酸堿值，可以發(fā)現(xiàn)混合溶液內(nèi)的pH值變動(dòng)范圍非常小，顯示透過(guò)不同濃度的離液鹽、單價(jià)離子鹽及擁擠試劑的組合，能夠選擇性地分離不同片段大小的核酸，此一特性與混合溶液內(nèi)的pH值并無(wú)相關(guān)性。換句話說(shuō)，透過(guò)上述三種不同因素的調(diào)控，經(jīng)過(guò)一次、二次或是三次的篩選，便可以將所需要的小片段或是特定片段大小的核酸從樣本當(dāng)中篩選出來(lái)，而能夠快速且有效率的進(jìn)行核酸大小的純化和篩選。另一方面，本發(fā)明所提供的篩選方法，完全不需要改質(zhì)化的固相載體，而且可以針對(duì)100至5000個(gè)片段大小間的堿基對(duì)進(jìn)行篩選，大幅增加了核酸篩選時(shí)候的選擇性和可運(yùn)用性。在此必須說(shuō)明者為，以上配合圖式所做的詳細(xì)描述，僅是為了說(shuō)明本發(fā)明之技術(shù)內(nèi)容及特征而提供的實(shí)施方式，凡在本發(fā)明領(lǐng)域中具有一般通常知識(shí)的人，在了解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容及特征之后，于不違背本發(fā)明之精神下，所做的種種簡(jiǎn)單的修飾、替換或構(gòu)件之減省，皆應(yīng)屬于以下所揭示的申請(qǐng)專(zhuān)利范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3