本發(fā)明涉及一種β-欖香烯的制備,特別涉及一種紫莖澤蘭來源的倍半萜合酶、基因、載體、工程菌及其制備β-欖香烯的應用。
(二)
背景技術:
欖香烯(Elemene)是從姜科植物溫郁金中提取出來的具有抗癌作用的有效成分,是我國自主研發(fā)的一類新型倍半萜藥物。該藥在臨床運用時,高效、副作用少;能夠改善微循環(huán),有助于化療、放療藥物進入癌組織發(fā)揮作用;具有選擇性抑制腫瘤細胞增殖和提高免疫功能的雙重效應;還可直接作用于細胞膜,使腫瘤細胞破裂死亡。目前欖香烯正被廣泛應用于肺癌、胃癌、大腸癌等惡性腫瘤的治療。雖然欖香烯系列抗腫瘤植物藥的開發(fā)和臨床應用正如火如荼,市場份額也在不斷擴大,但是從天然植物溫郁金中提取分離欖香烯仍存在許多技術難點:第一,天然植株僅塊根中含有欖香烯,且含量極低,約占千分之一到千分之二;同時欖香烯的含量易受品種,根莖質量,種植環(huán)境等諸多因素影響。第二,揮發(fā)油中成分復雜,欖香烯與許多結構相似的倍半萜類化合物混雜在一起,必須通過精密分餾、分子蒸餾或超臨界二氧化碳法進行初分,再通過薄層色譜和柱層析,經過多次分離才能得到純品,因此欖香烯的提取工藝要求高難度大。另外,化學合成欖香烯的工藝十分復雜,反應步驟近10步,其中兩步反應需在-78℃低溫條件進行,且需要用到二氯甲烷、氰化鈉、甲苯等劇毒化合物,不利于環(huán)境保護;最終合成的產物為外消旋混合物,需要進行拆分才能獲得目標產物,產率只有50%,因此化學合成路線經濟性差,無法進行商業(yè)化生產。這使得欖香烯原料藥的生產成本較高,對其市場推廣和全球化營銷起到一定的阻礙作用。
紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum Spreng)是一種菊科澤蘭屬叢生型的半灌木草本植物,因其莖、葉柄為紫色,因此被稱為紫莖澤蘭。紫莖澤蘭原產于中美洲、墨西哥、牙買加一帶,并在1865年作為觀賞性植物引入夏威夷群島,1875年引入澳大利亞,但隨后在新西蘭、緬甸、越南、泰國等國家泛濫成災。紫莖澤蘭于20世紀50年代入侵我國,目前已在廣西、貴州、云南、四川等地蔓延成災。由于紫莖澤蘭具有較強的適應性、抗逆能力和強大的競爭力,因此一旦其侵入林地,草場等地,能夠很快形成單種優(yōu)勢群落,給生態(tài)環(huán)境造成極大危害。通過對紫莖澤蘭活性成分的研究,發(fā)現(xiàn)其共有49種化合物,包括甾體、倍半萜類、苯丙素酚類、黃酮類、三萜類等。韋會平等人在攀西地區(qū)的紫莖澤蘭中首次發(fā)現(xiàn)了較高含量的β-欖香烯,并且進行測定分析,對β-欖香烯在紫莖澤蘭的分布和變化規(guī)律有了一定的掌握。
目前國內外研究者通過合成生物學技術,對原料植物進行生物合成途徑的改造和優(yōu)化,或者利用細胞和微生物,探索一條新的生物合成途徑。在此領域最著名的例子就是青蒿素的生物合成研究。Keasling等人在大腸桿菌中引入了紫穗槐二烯合酶基因,其能夠表達并產生青蒿素合成途徑中的重要前體分子紫穗槐二烯(Amorphadiene)。此外,有文獻報導在宿主菌內引入了青蒿素天然合成途徑中的P450酶,能夠把紫穗槐二烯氧化為青蒿素更為直接的前體物質——青蒿酸(Artemisinic acid)。青蒿酸可通過簡單化學方法進行轉化,變成活性青蒿素衍生物,最終達成了青蒿素的半生物合成的目的。此生物半合成路線的形成,能夠使生產青蒿素的成本降低約10倍。
β-欖香烯屬倍半萜類化合物,其合成途徑同萜類化合物的合成途徑一樣,存在兩條合成途徑的,分別是甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和5-磷酸脫氧木酮糖/2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(DOXP/MEP途徑)。這兩個途徑大體上可分為3個階段,即中間體異戊烯基焦磷酸(IPP)及其雙鍵異構體二甲基烯丙基焦磷酸的生成(DMAPP)、直接前體物質的生成和萜類生成及其修飾階段。以萜類物質合成途徑中的前體物質FPP為底物,在吉碼烯A合酶的催化作用下可形成吉碼烯A,吉碼烯A可在高溫條件下碳原子重排形成形成β-欖香烯。此外,據(jù)相關文獻報導,紫莖澤蘭中的β-欖香烯的含量較溫郁金來說相對較高,推測紫莖澤蘭中的存在活性較好的吉碼烯A合成酶。研究萜類合酶基因的克隆、表達,有助于發(fā)掘萜類化合物的合成機制,從而能夠進一步的研究代謝調控以及蛋白工程的改造。因此,對紫莖澤蘭來源的倍半萜合酶研究具有重要的意義。
(三)
技術實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種紫莖澤蘭來源的倍半萜合酶、基因及其在催化FPP生成欖香烯中的應用。該倍半萜合酶屬于萜類合成酶,具有催化底物FPP生成β-欖香烯的活性。
為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術方案是:
本發(fā)明提供一種紫莖澤蘭來源的倍半萜合酶(即EaSQS),所述酶的氨基酸序列為SEQ.ID NO.2所示。經實驗證明,上述結構的蛋白質屬于萜類合成酶,能催化FPP生成一定量的欖香烯。不難想到的是,在不改變蛋白質特性的情況,適當改變氨基酸序列,仍具有本發(fā)明醇脫氫酶特性。比如,氨基酸序列SEQ ID NO.2的保守性變異多肽,或其活性片段、或其衍生物。
本發(fā)明提供一種紫莖澤蘭來源的倍半萜合酶編碼基因(即EaSQS基因),所述編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。
本發(fā)明提供一種由所述紫莖澤蘭倍半萜合酶編碼基因構建的重組載體。
進一步,所述重組載體按如下方法制備:將倍半萜合酶編碼基因與pET28a載體連接,獲得連接產物EaSQS-pET28a,即為含有紫莖澤蘭倍半萜合酶編碼基因的重組載體。將重組載體轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞中,在含有50mg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、180rpm下?lián)u床培養(yǎng)1h,離心取沉淀后涂布于含有50mg/mL卡那霉素的LB平板,過夜培養(yǎng)后挑取單克隆進行PCR和提取重組質粒,即獲得含有紫莖澤蘭倍半萜合酶編碼基因的重組質粒。
本發(fā)明還提供一種含有所述紫莖澤蘭倍半萜合酶編碼基因或重組載體的重組基因工程菌。
本發(fā)明提供一種所述紫莖澤蘭倍半萜合酶編碼基因在制備重組倍半萜合酶中的應用。具體所述的應用為:將含有所述紫莖澤蘭倍半萜合酶編碼基因的重組載體轉化至大腸桿菌中,獲得的重組基因工程菌在含50mg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12h至OD600=0.6,加入IPTG終濃度為0.2mM,25℃誘導表達15h,將誘導培養(yǎng)液分離純化,獲得含有重組倍半萜合酶基因的菌體細胞,采用鎳柱進行親和層析分離獲得倍半萜合酶。
本發(fā)明提供一種所述紫莖澤蘭來源的倍半萜合酶在制備β-欖香烯中的應用,所述的應用為:以含紫莖澤蘭來源的倍半萜合酶編碼基因工程菌誘導培養(yǎng)獲得的濕菌體超聲破碎后的上清液經純化得到的純酶為催化劑,以法尼基焦磷酸(FPP)為底物,在二硫蘇糖醇(DTT)、MgCl2和稀甘油(即1,2,3-丙三醇)的作用下,于pH為7.0的Tris-HCl緩沖液中構成反應體系,在30℃進行生物轉化反應,反應液分離純化,獲得β-欖香烯。所述反應體系中,催化劑的用量為0.1-1mg/L,優(yōu)選0.681mg/L,所述底物終濃度為1-5μg/mL,優(yōu)選2μg/mL,所述二硫蘇糖醇和MgCl2的終濃度分別為0.1-2mM(優(yōu)選1mM)和2-20mM(優(yōu)選10mM),1,2,3-丙三醇體積終濃度為5-20%,優(yōu)選10%。
進一步,所述催化劑按如下方法制備:將含紫莖澤蘭來源的倍半萜合酶編碼基因工程菌(優(yōu)選E.Coil BL21codon plus/pET 28a/EaSQS)接種在含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床過夜培養(yǎng);再將培養(yǎng)液以體積濃度1%的接種量接種至含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng),直到菌液OD600達到0.6-0.8時加入終濃度0.5mM的IPTG,28℃誘導16h后,離心收集濕菌體;將濕菌體用pH7.4磷酸緩沖液重懸,超聲破碎細胞,離心取上清,用0.22μm醋酸纖維素濾膜過濾,濾液用鎳柱親和層析,收集目標組分,獲得純酶。
與現(xiàn)有技術相比,本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:
本發(fā)明中的催化劑源自高產β-欖香烯的藥用植物紫莖澤蘭,體外活性證實,其可以催化底物FPP生成β-欖香烯,最終欖香烯的產量達到7.499μg/mL。
(四)附圖說明
圖1電泳分析EaSQS基因PCR擴增產物,泳道M為DNA marker,泳道1為EaSQS基因PCR產物。
圖2 SDS-PAGE分析重組EaSQS工程菌經IPTG誘導表達結果(1:marker;2,誘導前;3,誘導后;4,誘導后上清部分;5,6:EaSQS純化后)。
圖3β-欖香烯標準品(a)與EaSQS催化反應產物的GC-MS分析圖(b)。
(五)具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述,但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
實施例1
1、EaSQS基因全長的克隆
本發(fā)明首先以植物來源的倍半萜合酶基因的保守氨基酸序列,設計兼并引物,以紫莖澤蘭cDNA為模板,進行PCR擴增,獲得紫莖澤蘭倍半萜合酶的部分序列,繼而采用RACE技術擴增到全長序列。利用生物信息學手段進行比對分析,確定了紫莖澤蘭來源的倍半萜合酶EaSQS基因的核苷酸序列的編碼區(qū)。
采用Trizol法提取紫莖澤蘭嫩葉RNA,反轉錄后送上海捷瑞生物技術有限公司進行測序,采用生物信息學BLAST分析方法,與Genbank數(shù)據(jù)庫進行比對,獲得一條可能的倍半萜合酶基因,根據(jù)該基因的核苷酸序列,設計一對引物(上游引物:5`-ATGGGTTGTAACCAAGTACCT-3`;下游引物:5`-TATGGTCAAAGGATCAATGAA-3`),以cDNA為模板進行PCR,PCR反應參數(shù)為:首先95℃變性5min;其次,95℃變性30sec,60℃退火30sec,72℃衍生2min,30個循環(huán);最后72℃延伸10min;待PCR反應結束后將產物進行回收并亞克隆,測序分析,獲得SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的EaSQS基因,該基因編碼的酶EaSQS氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。
含目的基因的表達載體的構建,根據(jù)EaSQS基因編碼序列(SEQ ID NO.1),設計擴增出完整編碼閱讀框的引物,并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(上游為NdeI,下游為XhoI),具體地說,上游引物為:
5`-CATATGATGGGTTGTAACCAAGTACCT-3`,下游引物為:
5`-CTCGAGTATGGTCAAAGGATCAATGAA-3`。PCR反應參數(shù)為:首先95℃變性5min;其次,95℃變性30sec,60℃退火30sec,72℃衍生2min,30個循環(huán);最后72℃延伸10min。經PCR擴增后,將EaSQS克隆至中間載體(如pET28a),在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體,再將其轉入E.Coil BL21codon plus中,獲得工程菌E.Coil BL21codon plus/pET 28a/EaSQS。
2、EaSQS蛋白的誘導表達與純化。
將第1步中獲得的工程菌E.Coil BL21codon plus/pET 28a/EaSQS在含100mL50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床過夜培養(yǎng)。將10ml過夜培養(yǎng)后的菌液倒入1L含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng),直到菌液OD600達到0.6-0.8時加入IPTG終濃度為0.5mM,28℃誘導16h后,離心收集菌體,5g濕菌體用25ml、pH7.4磷酸緩沖液重懸,超聲破碎細胞。離心取上清,用0.22μm醋酸纖維素濾膜過濾,根據(jù)產品說明書,將濾液進行鎳柱(Qiagen,德國)親和層析純化獲得EaSQS重組酶液,電泳圖見圖1所示。重組EaSQS純酶在SDS-PAGE上條帶顯示約為65kDa,與預期的蛋白分子量63.1kDa相吻合,且以上清形式存在。采用BCA法進行蛋白濃度分析,純化后的EaSQS酶液濃度達到68.8mg/L(圖1)。
實施例2重組酶EaSQS的催化性質分析
1、酶量
以實施例1方法制備的EaSQS重組酶液(濃度為68.8mg/L,體積見表1)為催化劑,加入pH7.0Tris-HCL緩沖液、2μg FPP、500mM MgCl2溶液20μL、500mM DTT2μL、100μL稀甘油(1,2,3-丙三醇)構成反應體系1ml,在30℃下攪拌充分反應,同時采用頂空-固相微萃取技術吸附反應產物,在反應60min時將萃取頭取出注入氣相色譜儀,對產物進行定量和定性分析。以β-欖香烯標準品為對照,通過分析色譜峰面積的大小來判斷該實驗所研究的倍半萜酶的催化性質。色譜條件:選用GC-2010島津氣相色譜儀;色譜柱為HP-5;載氣:N2,吹掃流量為3mL/min,無分流;柱箱起始溫度40℃,保留2分鐘,然后以7℃/min的速度升溫至220℃,保留5分鐘;進樣口溫度為250℃;檢測器溫度為250℃。
標準曲線的制備方法為:吸取一定量的β-欖香烯標準品溶液,進行精密稱重,加入乙酸乙酯,配置成母液濃度375.2μg/mL;取一定量的β-欖香烯標準品母液,加入一定量的乙酸乙酯,進行4、50、100、200、500倍逐級稀釋,配置成186.25、14.9、7.45、3.725、1.863μg/mL的標準品濃度梯度;分別吸取1μL,按上述方法進行色譜分析,峰面積分別為6654519、884323、60439、28991、14002、11295mAu。根據(jù)β-欖香烯標準品的濃度(C)和峰面積(S)作出標準曲線:S=18032C+294.25,R2=0.99939。
結果表明:根據(jù)β-欖香烯和反應產物的GC-MS分析圖譜,確定反應產物是β-欖香烯,即獲得的重組酶EaSQS是一種專一性生成β-欖香烯的倍半萜合酶(圖2)。
2、反應時間
以實施例1方法制備的EaSQS重組酶液(濃度為68.8mg/L,體積為10μL)為催化劑,分別加入pH7.0Tris-HCL緩沖液、2μg FPP、500mM MgCl2溶液20μL、500mM DTT 2μL、100μL稀甘油構成反應體系1ml,分別在30℃下攪拌反應20min、30min、40min、50min、60min、120min,其它操作同步驟1。
從表1中可見酶量為10μL時,即濃度比在1:3至1:4之間時,產物濃度最大。酶量在5μL時,即反應比例在1:2以下時酶的含量不足,產物產量較少;而在15μL-20μL時,即反應比例大于1:5時,酶的濃度過大,可能對反應產生了抑制,使得反應產物產量下降。
從表2中可以明顯看出,產物(欖香烯)濃度隨著反應時間的增加而增加。當反應時間在50min以內時,產物含量隨著反應時間的增加,其增加的速率并不是很大,但是當反應時間超過50min,其產物增加的速率相對較大??赡茉?0min-60min或者60min-120min之間存在著一個反應速慮的突變點。
經過上述條件探索后,重組酶EaSQS在濃度為68.8mg/L,體積為10μL,pH7.0緩沖液、反應時間120min、溫度30℃的反應條件下,底物FPP與重組酶EaSQS進行反應,最后用GC檢測其產物的峰面積,按照上述標準曲線方程,經計算,得到最佳產量為0.75μg。
表1催化劑EaSQS的最佳酶量分析
表2EaSQS的最適反應時間
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州師范大學
<120> 一種紫莖澤蘭來源的倍半萜合酶、基因、載體、工程菌及其應用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1641
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
atgggttgta accaagtacc tttccggccc tttcgtagca cttctccaag tttttgggga 60
gacatccttc ttaactatga aaagaaagca gagctatctg atgctgaacg tttagttgaa 120
gacttgagag aagaagtgag gaaagctata gcaggagctt tagcaaatcc aaaagaacat 180
gtgaatttgc taaaattaat tgatgtaatc caacgccttg gtataccata ttattttgaa 240
gaagagatta caaatgcttt gcaacatgtt tatgacacat atggtgatga ctggaatttc 300
ggtagccctt ccatttggtt taggctccta cgacaacatg gcttctatgt ttcatgtgat 360
atttttaaca agtactttaa ggacgaacat ggagctttca aggaatcctt aaccaatgat 420
gctgaagaaa tgctcgagct gtacgaggca acatgcttga gggtacatgg agaagttgtc 480
ctagacaagg cacttgagtt tacaaaaagt catctggcta acatagctaa ggatcctcat 540
tgtagcaacg ccactttgtc gacctatata caggaggcat tagacacacc tttgtataaa 600
aggattccaa gattagcgac gttaagttac atacgtttct acgaaaaaca agcttctcat 660
gatgaaagtt tacttaaact ggcaaagtta gggttcaatt ggcttcagtc acaacacaag 720
agcgatctta accaaatttc caaatggtgg aaagatgttg acattcaaaa gaatttgcct 780
tatgtgagag atagagtagt tgaatgttac ttttgggcat gtggttcatg ctctgagcct 840
aaatattcac ttgggagagt tttttttgct aaagtgattc aagtggggac gataattgac 900
gacacttttg atgcttatgg tacttatgaa gaacttctaa cttttacaga tgcagttgaa 960
cggtggagca ttacatgctt agatgagctt ccagagtata tgaaattcgc gtaccaagtt 1020
ttactggatt tatacgtaga aatggaacca atcgtggaaa aggaaaaatt aacacctctt 1080
tttaattgtg caaaagcgta tatgaaacaa tttgttagag cctacatggt tgaagcaaaa 1140
tgtctacatg aggggcgcat accaacagtt gatgagcata gatcaattgc atacaaaaca 1200
ggtacttgtg gctttatgat gtcagcatgc tatcttggca tgggtgatat aatcacgaat 1260
gagtcgatca attggattag tggtgaacct cctattttca tagctgcatc taagattgga 1320
agactcctaa atgatattgc cggctataag aaagagcaag aaagagagca tttccaatct 1380
tttgttcaat gctacgagaa gcaatatgat gtgggtgagg aggatgccat taacttggtg 1440
cgcaaggata ttgaagacgt atggaaagat ataacccgag agtccctcat gtgtaaagat 1500
gttccaaggc ctctcataat ggttgtggtc aactatgcac gagcattgta ttgcttgtac 1560
aagtttaatg atagtttcac agaagttggg gaagacatca aagatcatat caaacgcttg 1620
ttcattgatc ctttgaccat a 1641
<210> 2
<211> 547
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
Met Gly Cys Asn Gln Val Pro Phe Arg Pro Phe Arg Ser Thr Ser Pro
1 5 10 15
Ser Phe Trp Gly Asp Ile Leu Leu Asn Tyr Glu Lys Lys Ala Glu Leu
20 25 30
Ser Asp Ala Glu Arg Leu Val Glu Asp Leu Arg Glu Glu Val Arg Lys
35 40 45
Ala Ile Ala Gly Ala Leu Ala Asn Pro Lys Glu His Val Asn Leu Leu
50 55 60
Lys Leu Ile Asp Val Ile Gln Arg Leu Gly Ile Pro Tyr Tyr Phe Glu
65 70 75 80
Glu Glu Ile Thr Asn Ala Leu Gln His Val Tyr Asp Thr Tyr Gly Asp
85 90 95
Asp Trp Asn Phe Gly Ser Pro Ser Ile Trp Phe Arg Leu Leu Arg Gln
100 105 110
His Gly Phe Tyr Val Ser Cys Asp Ile Phe Asn Lys Tyr Phe Lys Asp
115 120 125
Glu His Gly Ala Phe Lys Glu Ser Leu Thr Asn Asp Ala Glu Glu Met
130 135 140
Leu Glu Leu Tyr Glu Ala Thr Cys Leu Arg Val His Gly Glu Val Val
145 150 155 160
Leu Asp Lys Ala Leu Glu Phe Thr Lys Ser His Leu Ala Asn Ile Ala
165 170 175
Lys Asp Pro His Cys Ser Asn Ala Thr Leu Ser Thr Tyr Ile Gln Glu
180 185 190
Ala Leu Asp Thr Pro Leu Tyr Lys Arg Ile Pro Arg Leu Ala Thr Leu
195 200 205
Ser Tyr Ile Arg Phe Tyr Glu Lys Gln Ala Ser His Asp Glu Ser Leu
210 215 220
Leu Lys Leu Ala Lys Leu Gly Phe Asn Trp Leu Gln Ser Gln His Lys
225 230 235 240
Ser Asp Leu Asn Gln Ile Ser Lys Trp Trp Lys Asp Val Asp Ile Gln
245 250 255
Lys Asn Leu Pro Tyr Val Arg Asp Arg Val Val Glu Cys Tyr Phe Trp
260 265 270
Ala Cys Gly Ser Cys Ser Glu Pro Lys Tyr Ser Leu Gly Arg Val Phe
275 280 285
Phe Ala Lys Val Ile Gln Val Gly Thr Ile Ile Asp Asp Thr Phe Asp
290 295 300
Ala Tyr Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Leu Thr Phe Thr Asp Ala Val Glu
305 310 315 320
Arg Trp Ser Ile Thr Cys Leu Asp Glu Leu Pro Glu Tyr Met Lys Phe
325 330 335
Ala Tyr Gln Val Leu Leu Asp Leu Tyr Val Glu Met Glu Pro Ile Val
340 345 350
Glu Lys Glu Lys Leu Thr Pro Leu Phe Asn Cys Ala Lys Ala Tyr Met
355 360 365
Lys Gln Phe Val Arg Ala Tyr Met Val Glu Ala Lys Cys Leu His Glu
370 375 380
Gly Arg Ile Pro Thr Val Asp Glu His Arg Ser Ile Ala Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Gly Thr Cys Gly Phe Met Met Ser Ala Cys Tyr Leu Gly Met Gly Asp
405 410 415
Ile Ile Thr Asn Glu Ser Ile Asn Trp Ile Ser Gly Glu Pro Pro Ile
420 425 430
Phe Ile Ala Ala Ser Lys Ile Gly Arg Leu Leu Asn Asp Ile Ala Gly
435 440 445
Tyr Lys Lys Glu Gln Glu Arg Glu His Phe Gln Ser Phe Val Gln Cys
450 455 460
Tyr Glu Lys Gln Tyr Asp Val Gly Glu Glu Asp Ala Ile Asn Leu Val
465 470 475 480
Arg Lys Asp Ile Glu Asp Val Trp Lys Asp Ile Thr Arg Glu Ser Leu
485 490 495
Met Cys Lys Asp Val Pro Arg Pro Leu Ile Met Val Val Val Asn Tyr
500 505 510
Ala Arg Ala Leu Tyr Cys Leu Tyr Lys Phe Asn Asp Ser Phe Thr Glu
515 520 525
Val Gly Glu Asp Ile Lys Asp His Ile Lys Arg Leu Phe Ile Asp Pro
530 535 540
Leu Thr Ile
545