本發(fā)明涉及一種單質(zhì)粒系統(tǒng)的CRISPRi載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：基因沉默技術(shù)通過降低基因表達(dá)水平改變表型，從而驗(yàn)證基因的功能，是目前基因功能驗(yàn)證的重要方法之一。目前，最常用的基因沉默手段主要是RNA干擾(RNAinterference，RNAi)和反義嗎啉代寡核苷酸干擾(Morpholino)。Morpholino是嗎啡啉類似物修飾的反義寡核苷酸，與mRNA前體或與剪切處結(jié)合，通過空間位阻特異性抑制翻譯或RNA剪切，實(shí)現(xiàn)基因沉默。但該法效應(yīng)短暫且對成體表型幾乎無影響，只適于生物發(fā)育初期基因功能研究。RNAi是生物體的一種在進(jìn)化上保持高度保守的、能抵御外源基因或外來病毒侵犯的重要防御機(jī)制，是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默現(xiàn)象，廣泛存在于動(dòng)、植物等各種生物體內(nèi)，主要用于基因功能分析、基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、抗病毒、抗腫瘤、發(fā)育機(jī)制、發(fā)病機(jī)理等的研究。RNAi技術(shù)能夠持久的抑制基因的表達(dá)，該技術(shù)是介導(dǎo)mRNA降解來抑制基因表達(dá)，克服了反義嗎啉代寡核苷酸干擾的缺陷，但是該法阻滯效率及準(zhǔn)確度較低，阻礙了其發(fā)展。隨著研究的進(jìn)一步深入，人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)外源基因侵入細(xì)菌時(shí)，一種成簇而規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)會(huì)將基因片段整合保存，待相同基因片段再次入侵時(shí)，CRISPR及其相關(guān)蛋白會(huì)將該外源基因剪切破壞，這種現(xiàn)象在細(xì)菌和古細(xì)菌中普遍存在。在細(xì)菌和古細(xì)菌中，CRISPR是其適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要部分。Cas蛋白與crRNA形成復(fù)合體，后者以堿基互補(bǔ)配對方式特異性識(shí)別外源基因，Cas蛋白發(fā)揮酶活性將其切斷；CRISPR干擾(CRISPRinference,CRISPRi)系統(tǒng)作用機(jī)制完全不同于RNAi技術(shù)，將Cas9蛋白酶活性去除，復(fù)合體僅與目的基因結(jié)合而非剪切，直接阻斷編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄。與常用的基因沉默技術(shù)相比，CRISPRi技術(shù)具有以下突出優(yōu)點(diǎn):1)與RNAi介導(dǎo)mRNA降解相比，CRISPRi技術(shù)直接阻滯DNA轉(zhuǎn)錄，抑制RNA合成，阻滯級(jí)別更高、更準(zhǔn)確；2)可對多個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)編輯；3)實(shí)現(xiàn)可逆性基因沉默；4)沉默效率較高，載體構(gòu)建簡單，只需設(shè)計(jì)目的基因的sgRNA。因此，對CRISPRi技術(shù)的研究開發(fā)成為功能基因組學(xué)領(lǐng)域的研發(fā)熱點(diǎn)，其將給基因功能研究、基因編輯、建立基因病動(dòng)物模型、基因治療的發(fā)展帶來新的曙光。麻省理工合成生物學(xué)中心的SaraCleto團(tuán)隊(duì)利用CRISPRi技術(shù)抑制了谷氨酸棒狀桿菌中的pck與pyk基因表達(dá)，減少非目標(biāo)產(chǎn)物的合成從而提高了目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸與L-谷氨酸在產(chǎn)物中的比例。威斯康辛大學(xué)的GinaC.Gordon團(tuán)隊(duì)通過CRISPRi技術(shù)抑制藍(lán)藻中羧基體相關(guān)基因的表達(dá)提高了藍(lán)藻從大氣中固定二氧化碳的能力，從而提高了藍(lán)藻的光合作用效率。上述兩個(gè)方案均是采用CRISPRi技術(shù)抑制基因的表達(dá)，但是其由兩個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建而成，將sgRNA與dCas9蛋白在兩個(gè)質(zhì)粒系統(tǒng)分開表達(dá)，需要2次轉(zhuǎn)化才能完成基因的表達(dá)，具有構(gòu)建過程繁瑣、時(shí)間長、效率低的缺陷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠在一個(gè)CRISPR質(zhì)粒系統(tǒng)中同時(shí)表達(dá)dCas9和sgRNA，僅需一次轉(zhuǎn)化即可完成sgRNAscaffold與dCas9蛋白的表達(dá)的單質(zhì)粒系統(tǒng)的CRISPRi載體及其制備方法，該CRISPRi載體構(gòu)建過程簡單、快速，可大大提高效率。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種dCas9載體，所述的dCas9載體的序列如SEQIDNO.6所示，圖譜如附圖2所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種單質(zhì)粒系統(tǒng)的CRISPRi載體，所述的CRISPRi載體通過將含有sgRNA啟動(dòng)子和sgRNAscaffold的基因片段重組到經(jīng)酶切的dCas9載體中獲得。具體地，所述的基因片段還包括酶切位點(diǎn)和重組臂。優(yōu)選地，所述的酶切位點(diǎn)為SpeI酶切位點(diǎn)。具體地，所述的基因片段的序列如SEQIDNO.1所示。具體地，所述的dCas9載體采用SpeI酶進(jìn)行酶切。具體地，所述的CRISPRi載體的序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述的單質(zhì)粒系統(tǒng)的CRISPRi載體的制備方法，其包括如下步驟：步驟(1)、設(shè)計(jì)并合成基因片段；步驟(2)、將dCas9載體進(jìn)行酶切，酶切后，采用瓊脂糖凝膠電泳回收酶切過的dCas9載體；步驟(3)、將所述的基因片段和所述的酶切過的dCas9載體在45～55℃下進(jìn)行重組反應(yīng)50～70min得到所述的CRISPRi載體。具體地，步驟(3)中，進(jìn)行所述的重組反應(yīng)的反應(yīng)體系為：本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種單質(zhì)粒系統(tǒng)的制備方法，其通過將所述的CRISPRi載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞中，然后經(jīng)培養(yǎng)抽取質(zhì)粒得到所述的單質(zhì)粒系統(tǒng)。具體地，將所述的CRISPRi載體冷加入到于冰上融化的大腸桿菌TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴放置20～40min，然后于40～44℃熱激80～100秒，冰浴1～3min，加入LB培養(yǎng)基，36～38℃恢復(fù)培養(yǎng)50～70min，離心后棄去上清，沉淀重懸后均勻涂布氯霉素篩選平板上，于36～38℃培養(yǎng)11～13h，然后挑選單菌落于LB培養(yǎng)基中，放入36～38℃搖床1～2h后，取菌液進(jìn)行菌檢PCR擴(kuò)增并測序，將測序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列進(jìn)行比對，確定正確克隆，將正確克隆的菌液抽取質(zhì)粒，即所述的單質(zhì)粒系統(tǒng)。由于上述技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明利用CRISPRi技術(shù)，將dCas9蛋白和sgRNAscaffold構(gòu)建到一個(gè)質(zhì)粒系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)在一個(gè)質(zhì)粒中同時(shí)表達(dá)sgRNA和dCas9蛋白。該系統(tǒng)僅需要一次構(gòu)建、一次轉(zhuǎn)化即可實(shí)現(xiàn)sgRNA和dCas9蛋白的表達(dá)，該法過程簡單、高效、快捷，大大簡化質(zhì)粒構(gòu)建流程，縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高工作效率。附圖說明附圖1為平板上的菌落圖，其中，左圖的平板含氯霉素和不含無水四環(huán)素，菌落呈藍(lán)色；右圖的平板含氯霉素和含無水四環(huán)素，菌落呈白色；附圖2為dCas9載體的圖譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。本發(fā)明中若無特別說明，原料均可市購獲得，方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。本發(fā)明中的Gibson組裝預(yù)混液購自NEB公司的貨號(hào)：#E2611S。實(shí)施例1：dCas9載體的合成(1)、用常規(guī)基因合成方法合成如SEQIDNO.7～9所示的三個(gè)片段；(2)、將這三個(gè)片段放到PCR管中，按以下體系加入試劑，并反應(yīng)；50℃1h4℃∞(3)、然后將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化到stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，然后經(jīng)后處理得到dCas9載體，其序列如SEQIDNO.6所示，圖譜如附圖2所示。實(shí)施例2：1、根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)目標(biāo)序列：“sgRNA啟動(dòng)子+酶切位點(diǎn)+sgRNAscaffold表達(dá)框”片段，采用常規(guī)基因合成方法合成目標(biāo)序列。目標(biāo)序列如SEQIDNO.1所示；其中，重組臂的序列為ACGATATAAGTTGTTGAATTCTAAAGATCT和TTTTTTTGAAGCTTGGGCCCACGAGAGAGA，sgRNA啟動(dòng)子的序列為TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAAT，酶切位點(diǎn)的序列為ACTAGT，sgRNAscaffold表達(dá)框的序列為GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC。2、SpeI酶切dCas9載體，反應(yīng)體系如表1所示，酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切過的dCas9載體。表1組分用量dCas9載體1μgSpeI酶1μl10×SpeIbuffer5μlddH2O補(bǔ)足50μl總體積50μl3、于50℃下反應(yīng)60min，將合成的“sgRNA啟動(dòng)子+酶切位點(diǎn)+sgRNAscaffold表達(dá)框”片段重組到SpeI內(nèi)切酶切開的dCas9載體上，并于4℃保存，CRISPRi載體的序列如SEQIDNO.2所示。重組反應(yīng)體系如表2所示。表24、轉(zhuǎn)化與涂板將上述重組產(chǎn)物冷加入到于冰上融化的大腸桿菌TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，冰浴放置30min。42℃熱激90秒，冰浴2min。加入400～500μLLB培養(yǎng)基，37℃恢復(fù)培養(yǎng)60min。5000rpm離心5min后棄去上清，沉淀重懸后均勻涂布氯霉素篩選平板上。于37℃培養(yǎng)12h。5、克隆鑒定：用無菌牙簽挑選單菌落于200μl的LB培養(yǎng)基中，放入37℃搖床1～2h后，取菌液進(jìn)行菌檢PCR擴(kuò)增(菌檢與測序引物序列為：F:TCAAAGAGTTGGTAGCTCAG(SEQIDNO.3)；R:ACTCCTGTTGATAGATCCAG(SEQIDNO.4))，菌檢PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如表3所示，擴(kuò)增程序如表4所示，剩余菌液繼續(xù)放入搖床。6h后將檢到目標(biāo)大小條帶的菌液送測序4個(gè)。測序引物即菌檢引物。將測序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列進(jìn)行比對，確定正確克隆。表3組分用量(μl)菌液3μlF引物1μlR引物1μltaq酶1μl10×taqbuffer3μlddH2O20μldNTPs1μl總體積30μl表46、將正確克隆的菌液抽取質(zhì)粒，即目標(biāo)質(zhì)粒。7、實(shí)施例中以LacZ為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA序列，重組到目標(biāo)質(zhì)粒上，LacZ-sgRNA序列為(SEQIDNO.5)：AGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTAGCGGATAACAATTTCACACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT(其中傾斜部分為重組臂；sgRNA的重組方法同第三步)。8、轉(zhuǎn)化涂板轉(zhuǎn)化涂板方法同第四步，平板為氯霉素抗性并添加無水四環(huán)素。9、克隆鑒定克隆鑒定方法同第五步，挑取藍(lán)色單克隆菌檢并測序。菌檢與測序引物同第五步。10、將測序鑒定正確的菌液在含氯霉素，+/-無水四環(huán)素的平板上劃線：可見在不含無水四環(huán)素的平板上菌落呈藍(lán)色，在含有無水四環(huán)素的平板上菌落呈白色，說明LacZ基因被CRISPRi系統(tǒng)抑制。以上對本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，且本發(fā)明不限于上述的實(shí)施例，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3