本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及鹿茸多肽在促腎上皮細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鹿茸——?dú)w肝、腎經(jīng)，補(bǔ)腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨。屬于傳統(tǒng)中藥之一。中華人民共和國藥典(2005年版一部)將鹿茸功能與主治敘述為：壯腎陽，益精血，強(qiáng)筋骨，調(diào)沖任，托瘡毒。用于陽痿滑精，冷宮不孕，贏瘦，神疲，畏寒，眩暈耳鳴耳聾，腰膝冷痛，筋骨冷軟，崩漏帶下，陰疽不斂。

鹿茸是隸屬于脊索動(dòng)物門哺乳綱鹿科的動(dòng)物，它是梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化并且密生絨毛的幼角。鹿茸史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，指出：“鹿茸專入命門、督，兼入肝。甘咸氣溫，稟純陽之質(zhì)，含發(fā)生之氣”，屬中品。李時(shí)珍曰:“龜、鹿皆靈而有壽。鹿鼻常反向尾，能通督脈，故取其角，以補(bǔ)命、補(bǔ)精、補(bǔ)氣，皆以養(yǎng)陽也。乃物理之玄微，神工之能事”。而且，現(xiàn)代藥理研究亦表明，鹿茸有抗炎作用，可抑制和清除自由基，延緩衰老，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等作用，鹿茸中提取的鹿茸多肽能夠促進(jìn)體外軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制軟骨細(xì)胞調(diào)亡，同時(shí)，文獻(xiàn)研究也提示，以鹿茸等為代表的歸肝、腎經(jīng)藥物在治療“痹癥”的方劑中使用頻率占到39.3％。

鹿茸中含有比較復(fù)雜的化學(xué)成分，氨基酸的種類有19種以上，其中包括人體自身不能合成的必需氨基酸，10種磷脂成分，9種脂肪酸(生物活性最強(qiáng)的油酸、亞油酸、亞麻酸含量較高)、糖脂、糖，固醇類、激素樣物質(zhì)、前列腺素、腦素、核糖核酸、去氧核糖核酸、三磷酸腺苷、硫酸軟骨素、多胺、肽類、脂蛋白、維生素、酶類及各種微量元素等。

本發(fā)明所用鹿茸多肽為利用離子交換層析、凝膠過濾層析及反相高效液相色譜層析等生物化學(xué)技術(shù)，從梅花鹿茸中分離得到的1個(gè)新多肽，SDS-PAGE電泳顯示為一條帶，HPLC圖譜為單一峰，MALDI-TOF MS給出該多肽的精確分子量為3263.4，其等電點(diǎn)pI＝8.15.一級(jí)結(jié)構(gòu)研究表明，該多肽是由32個(gè)氨基酸殘基組成的直鏈多肽，不含半胱氨酸，富含纈氨酸、賴氨酸、亮氨酸和甘氨酸。(張鄭瑤等."梅花鹿茸多肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性."高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)33.9(2012):2000-2004.)

腎損傷有以下特點(diǎn)；①合并傷多見，特別是肝、脾、胃腸道及胸部；②傷情重、休克發(fā)生率高；③多有血尿、腰痛、腹部包塊等癥狀；④并發(fā)癥多且較嚴(yán)重，如尿外滲、感染、高血壓或腎功能不全等。腎損傷患者經(jīng)常出現(xiàn).血尿、休克等癥狀。表現(xiàn)有創(chuàng)傷性休克和出血性休克，甚至危及生命。而且大多數(shù)患者表現(xiàn)為疼痛及腹部包塊，有時(shí)還可因輸尿管血塊阻塞引起腎絞痛。當(dāng)腎周圍血腫和尿外滲形成時(shí)，局部發(fā)生腫脹而形成腫塊。高熱及傷口流血也是腎損傷并發(fā)的癥狀。腎損傷后并發(fā)癥分為早期和晚期兩類。所謂早期并發(fā)癥是指損傷后6周之內(nèi)所發(fā)生的那些威脅病人生命，或者使損傷的腎臟喪失的情況，如繼發(fā)性出血、尿外滲、腎周圍膿腫、急性腎小管壞死、尿瘺等。晚期并發(fā)癥包括高血壓、腎積水、結(jié)石、慢性腎盂腎炎、慢性腎功衰竭、動(dòng)靜脈瘺等。這兩類并發(fā)癥大都發(fā)生于嚴(yán)重腎損傷之后，個(gè)別例外。高血壓是晚期并發(fā)癥中最常見者，發(fā)病率為0.7％～33％。主要原因是由于腎缺血引起腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增加，如腎蒂周圍血腫、腎周圍血腫、腎被膜下血腫機(jī)化、腎實(shí)質(zhì)廣泛瘢痕形成、腎內(nèi)假性動(dòng)脈瘤等對(duì)腎實(shí)質(zhì)壓迫造成供血不足，導(dǎo)致近球細(xì)胞及顆粒斑分泌腎素增多而繼發(fā)腎素性高血壓。腎損傷分為閉合性損傷和開放性損傷兩種類型，主要由閉合性腎損傷及開放性腎損傷引起。腎損傷嚴(yán)重危機(jī)人的生命，因而，尋找到能夠治療腎損傷的藥物，受到廣泛的關(guān)注。本次實(shí)驗(yàn)所用鹿茸多肽，可以通過促進(jìn)腎細(xì)胞的增殖來促進(jìn)腎損傷修復(fù)，對(duì)臨床治療腎損傷具有借鑒意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種鹿茸多肽在促腎上皮細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種鹿茸多肽的氨基酸序列，其序列

VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM。

上述的鹿茸多肽在促腎上皮細(xì)胞增殖中的應(yīng)用，包括如下步驟：

第一步，細(xì)胞培養(yǎng)；培養(yǎng)細(xì)胞為腎上皮細(xì)胞，使用高糖型培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

第二步，細(xì)胞消化；取處于對(duì)數(shù)生長期的腎上皮細(xì)胞，進(jìn)行常規(guī)消化，得到單細(xì)胞懸液。

第三步，離心；將單細(xì)胞懸液放入離心管中進(jìn)行離心；吸去上清液，加入培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，使細(xì)胞分散均勻。

第四步，細(xì)胞計(jì)數(shù)；調(diào)節(jié)細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×10⁴～10×10⁴/ml。

第五步，種板；將分散均勻的細(xì)胞接種于孔板；孔板每列設(shè)置3～6個(gè)復(fù)孔；在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

第六步，加入該氨基酸序列的鹿茸多肽；當(dāng)腎上皮細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，向孔板中加入0～500ug/ml的鹿茸多肽；在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。

第七步：采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值情況。

上述的腎上皮細(xì)胞為轉(zhuǎn)染腺病毒基因的人腎上皮細(xì)胞派生得到。

上述的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。

上述第五步在接種細(xì)胞的周圍孔中加入含有雙抗的PBS溶液。

本發(fā)明的有益效果為，具有該種氨基酸結(jié)構(gòu)的鹿茸多肽具有促進(jìn)293T細(xì)胞增值的作用，在濃度為500ug/ml，作用時(shí)間為48h時(shí)效果最為顯著，有助于促進(jìn)腎損傷修復(fù)。

附圖說明

圖1表示不同濃度鹿茸多肽作用于293T細(xì)胞24h后，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2表示不同濃度鹿茸多肽作用于293T細(xì)胞48h后，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

實(shí)施例1

通過MTT法檢測(cè)不同濃度鹿茸多肽作用于細(xì)胞24h后，對(duì)細(xì)胞增值的影響。

第一步：細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)使用高糖型DMEM培養(yǎng)基，血清含量為10％，使用75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

第二步：細(xì)胞消化。取處于對(duì)數(shù)生長期的生長狀況良好的腎上皮細(xì)胞(293T)，常規(guī)消化。消化時(shí)，先加入4ml PBS對(duì)腎上皮細(xì)胞(293T)進(jìn)行清洗，清洗兩次，洗去殘留的培養(yǎng)基，防止殘留培養(yǎng)基與胰酶發(fā)生中和作用。然后加入4ml胰酶，放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中消化1min。細(xì)胞皺縮時(shí)加入等量培養(yǎng)基終止消化。用一次性無菌塑料管吹打細(xì)胞瓶壁，將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，制成單細(xì)胞懸液。

第三步：離心。將單細(xì)胞懸液放入離心管中進(jìn)行離心，1000rpm/min離心5分鐘。吸去上清液，加入培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，使細(xì)胞分散均勻。

第四步：細(xì)胞計(jì)數(shù)。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞個(gè)數(shù)為10×10⁴/ml(每孔加100ul，相當(dāng)于每孔10000個(gè)細(xì)胞)。

第五步：種板。將分散均勻的細(xì)胞接種于96孔板，每孔加100ul，腎上皮細(xì)胞(293T)每列加5個(gè)孔，共需2.5ml，考慮到種板過程中細(xì)胞液的損失，需要配置3ml。四周孔中加入200ul含有雙抗的無菌PBS。在第二列至第六列加入腎上皮細(xì)胞(293T)，每列設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。

操作過程中需要注意的是：1.每次加入細(xì)胞都使槍頭貼著孔壁(最好相同位置)，緩慢加入100ul細(xì)胞懸液。2.孔加入順序：可從上到下，從右到左依次加入。3.為了保證細(xì)胞密度均勻，最好每加1列細(xì)胞混勻一下細(xì)胞懸液，避免因重力沉降導(dǎo)致細(xì)胞密度不均。4.每塊96孔板加完細(xì)胞后，靜置30min，使細(xì)胞貼壁。

第六步：加入鹿茸多肽。向孔板中分別加入不同濃度的鹿茸多肽、地塞米松及DMEM培養(yǎng)基。第二列至第四列中鹿茸多肽濃度分別為20ug/ml、100ug/ml、500ug/ml，第五列加入1mg/ml地塞米松，第六列加入等量的培養(yǎng)基。37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

第七步：MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值情況。24h后取出孔板，每孔加入20ulMTT溶液(MTT溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，也可以一次性配好后放于-20℃冰箱中長期凍存)，繼續(xù)孵育4h后終止。快速、輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，棄上清，注意不能把結(jié)晶移走。每孔加入150ul DMSO，震蕩10分鐘，使MTT藍(lán)紫色結(jié)晶逐漸溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處各孔OD值(吸光值)，求每列平均值，只加入培養(yǎng)基孔的OD值為對(duì)照。最后，以時(shí)間為橫軸，以O(shè)D值為縱軸繪制柱狀圖。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

所得結(jié)果如圖1所示，24h后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組OD值明顯大于對(duì)照組，呈現(xiàn)差異顯著性，說明鹿茸多肽作用24h后顯著促進(jìn)細(xì)胞增值。

實(shí)施例2

通過MTT法檢測(cè)不同濃度鹿茸多肽作用于細(xì)胞48h后，對(duì)細(xì)胞增值的影響。

第一步：細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)使用高糖型DMEM培養(yǎng)基，血清含量為10％，使用75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

第二步：細(xì)胞消化。取處于對(duì)數(shù)生長期的生長狀況良好的腎上皮細(xì)胞(293T)，常規(guī)消化。消化時(shí)，先加入4ml PBS對(duì)腎上皮細(xì)胞(293T)進(jìn)行清洗，清洗兩次，洗去殘留的培養(yǎng)基，防止殘留培養(yǎng)基與胰酶發(fā)生中和作用。然后加入4ml胰酶，放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中消化1min。細(xì)胞皺縮時(shí)加入等量培養(yǎng)基終止消化。用一次性無菌塑料管吹打細(xì)胞瓶壁，將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，制成單細(xì)胞懸液。

第三步：離心。將單細(xì)胞懸液放入離心管中進(jìn)行離心，1000rpm/min離心5分鐘。吸去上清液，加入培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，使細(xì)胞分散均勻。

第四步：細(xì)胞計(jì)數(shù)。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞個(gè)數(shù)為10×10⁴/ml(每孔加100ul，相當(dāng)于每孔10000個(gè)細(xì)胞)。

第五步：種板。將分散均勻的細(xì)胞接種于96孔板，每孔加100ul，腎上皮細(xì)胞(293T)每列加5個(gè)孔，共需2.5ml，考慮到種板過程中細(xì)胞液的損失，需要配置3ml。四周孔中加入200ul含有雙抗的無菌PBS。在第二列至第六列加入腎上皮細(xì)胞(293T)，每列設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。

操作過程中需要注意的是：1.每次加入細(xì)胞都使槍頭貼著孔壁(最好相同位置)，緩慢加入100ul細(xì)胞懸液。2.孔加入順序：可從上到下，從右到左依次加入。3.為了保證細(xì)胞密度均勻，最好每加1列細(xì)胞混勻一下細(xì)胞懸液，避免因重力沉降導(dǎo)致細(xì)胞密度不均。4.每塊96孔板加完細(xì)胞后，靜置30min，使細(xì)胞貼壁。

第六步：加入鹿茸多肽。向孔板中分別加入不同濃度的鹿茸多肽、地塞米松及DMEM培養(yǎng)基。第二列至第四列中鹿茸多肽濃度分別為20ug/ml、100ug/ml、500ug/ml，第五列加入1mg/ml地塞米松，第六列加入等量的培養(yǎng)基。37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

第七步：MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值情況。48h后取出孔板，每孔加入20ulMTT溶液(MTT溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，也可以一次性配好后放于-20℃冰箱中長期凍存)，繼續(xù)孵育4h后終止?？焖?、輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，棄上清，注意不能把結(jié)晶移走。每孔加入150ul DMSO，震蕩10分鐘，使MTT藍(lán)紫色結(jié)晶逐漸溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處各孔OD值(吸光值)，求每列平均值，只加入培養(yǎng)基孔的OD值為對(duì)照。最后，以時(shí)間為橫軸，以O(shè)D值為縱軸繪制柱狀圖。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

所得結(jié)果如圖2所示，48h后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，OD值具有明顯的差別，說明鹿茸多肽作用48h后可以明顯促進(jìn)細(xì)胞增值，并且鹿茸多肽濃度為500ug/ml時(shí)促增值作用最為顯著。

鹿茸多肽的氨基酸序列為：

VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM