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一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法與流程

文檔序號:11809294閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法,其特征在于:所述方法包括以下步驟:

1)白地霉培養(yǎng)和孢子收集

在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種白地霉,培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面長滿白地霉孢子,洗下培養(yǎng)基表面的白地霉孢子,吸出孢子懸液并過濾去除菌絲,收集含有孢子的濾液,將濾液離心,收集沉淀的休眠孢子;

2)白地霉孢子預(yù)處理

用電擊緩沖液重懸孢子,離心并收集孢子沉淀,重復(fù)上述重懸和離心步驟3-4次后,將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中,得到孢子濃度為104-1011個(gè)/ml的白地霉孢子懸液;

所述電擊緩沖液由終濃度為0.01-100mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為0.5-5000mmol/L的甘露醇組成,電擊緩沖液的pH為3.0-9.5;

3)使用HDEN法電擊白地霉孢子

在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入上述步驟得到的白地霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化RNA,混勻,得到孢子與RNA混合物,將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min,然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行HDEN法電擊,將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與RNA混合物內(nèi)部,通電,使得孢子與RNA混合物內(nèi)部產(chǎn)生電場,電擊之后再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min,然后將孢子和RNA混合物吸出,得到導(dǎo)入外源RNA的休眠的白地霉孢子;

所述白地霉懸液與待轉(zhuǎn)化RNA的比例為:0.6-60000μl的白地霉孢子懸液:0.1-10000μg的待轉(zhuǎn)化RNA;

所述電擊參數(shù)如下:電壓1-6000V,脈寬2-2000000ms,重復(fù)1-100次,每次間隔5-50000ms。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法,其特征在于:所述步驟1)的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基或察氏培養(yǎng)基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法,其特征在于:所述步驟1,)白地霉的培養(yǎng)條件為:溫度16-40℃,濕度15-85%,培養(yǎng)3-15日。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法,其特征在于:所述步驟2)的白地霉孢子懸液在電擊前,于顯微鏡下觀察,確認(rèn)孢子懸液中無菌絲體混雜污染并且孢子均未萌發(fā),然后再進(jìn)行電擊。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法,其特征在于:所述步驟3),待轉(zhuǎn)化RNA為外源單鏈編碼蛋白質(zhì)的RNA,該RNA能在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法,其特征在于:所述外源單鏈編碼蛋白質(zhì)的RNA為綠色熒光蛋白的編碼RNA、紅色熒光蛋白的編碼RNA或黃色熒光蛋白的編碼RNA。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法,其特征在于:利用以下PCR引物擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因或黃色熒光蛋白基因:

F:5' AGATGACGTCGCTAGCATGGTGAGCAAGGGC 3' ;

R:5' ACGCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGT3';

引物F中靠近5’端的GCTAGC序列,用于促進(jìn)該DNA轉(zhuǎn)錄成RNA后,翻譯起始因子與RNA結(jié)合,該序列與所表達(dá)的目的基因的起始密碼子ATG緊鄰。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法,其特征在于:利用以下PCR引物擴(kuò)增紅色熒光蛋白基因:

上游引物:RFP-F: 5' CGGAATTCGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGACGT 3' ;

下游引物:RFP-R: 5' TCGAGCTCGTTAGGCGCCGGTGGAGTGG 3' ;

引物RFP-F中靠近5’端的GCCACC序列,用于促進(jìn)該DNA轉(zhuǎn)錄成RNA后,翻譯起始因子與RNA結(jié)合,該序列與所表達(dá)的目的基因的起始密碼子ATG緊鄰。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法,其特征在于:所述步驟3),白地霉懸液與待轉(zhuǎn)化RNA的比例為:60μl的白地霉孢子懸液:10μg的待轉(zhuǎn)化RNA。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在白地霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法,其特征在于: 所述步驟3),電擊參數(shù)如下:電壓520V,脈寬2000ms,重復(fù)4次,每次間隔300ms。

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