技術(shù)特征：

1.多發(fā)性肉芽腫血管炎及微小動(dòng)脈炎的基因分型診斷試劑盒，其特征在于，包括肉芽腫性多血管炎基因和微小動(dòng)脈炎基因SNP檢測(cè)探針、多重PCR引物（序列見(jiàn)表1）、多重PCR反應(yīng)液及雜交液與洗脫液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多發(fā)性肉芽腫血管炎及微小動(dòng)脈炎的基因分型診斷試劑盒，其特征在于，包括四個(gè)小試劑盒，分別用于檢測(cè)位于HLA-DPB1基因上rs1042169_F、rs141520233_F和rs386699872_F的SNP位點(diǎn)以及HLA-DQA2基因上rs3998158_F的SNP位點(diǎn)，每個(gè)小試劑盒內(nèi)裝有DNA抽提、PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶酶切以及瓊脂糖凝膠電泳步驟的相關(guān)試劑。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多發(fā)性肉芽腫血管炎及微小動(dòng)脈炎的基因分型診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的HLA-DPB1和HLA-DQA2的擴(kuò)增引物序列以及對(duì)應(yīng)探針序列如下：

4.一種多發(fā)性肉芽腫血管炎及微小動(dòng)脈炎的基因分型診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，分別通過(guò)以下兩種方案多個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)：

方案一：經(jīng)典的Sanger法

1）擴(kuò)增反應(yīng)體系為：每50 ul中含5 ul的10倍擴(kuò)增緩沖液、2 ul濃度為25mM的 Mg2+、2 ul濃度為I0mM的dNIPs、l.5 ul濃度為10 uM的正向引物、1.5 ul濃度為10 uM的反向引物、0. 5 ul的HotStarTaq DNA聚合酶、2 ul 濃度為10 - 20 ng/ul 的DNA模板、余量為35.5 ul 的加雙蒸水；

2）擴(kuò)增反應(yīng)步驟為：先95°C反應(yīng)15min，進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)中先94°C反應(yīng)0. 5min，然后 56°C反應(yīng)0. 5min，然后72°C反應(yīng)1min為一個(gè)循環(huán)，共反應(yīng)35個(gè)循環(huán)然后72°C反應(yīng)7min， 最后4 °C保存；

3）測(cè)序反應(yīng)體系為：4ul的BigdyeV3. 1終結(jié)反應(yīng)混合物、3ul的雙蒸水、1ul濃度為10μΜ 的測(cè)序引物、, 2ul的 PCR 產(chǎn)物；

4）測(cè)序反應(yīng)步驟為：先94°C反應(yīng) 0. 5min，然后50°C反應(yīng)0. 5min，然后60°C反應(yīng)2.0min為一個(gè)循環(huán)，共反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；

5）Sanger測(cè)序PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

6）Sanger測(cè)序結(jié)果分析；

方案二：ARMS-PCR法

在多重PCR中同時(shí)擴(kuò)增多達(dá)4個(gè)含SNP的DNA片段；在單堿基延伸過(guò)程中，對(duì)多重PCR的純化產(chǎn)物進(jìn)行多重單堿基延伸，延伸引物在4個(gè)SNP處分別延伸一個(gè)核苷酸，使得所延伸的核苷酸類型，分別與SNP處的基因型相關(guān)；單堿基延伸產(chǎn)生由延伸引物和延伸產(chǎn)物組成的待檢混合物，以質(zhì)譜對(duì)待檢混合物進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)質(zhì)譜峰確定待檢混合物中各物質(zhì)分子量，并與預(yù)先計(jì)算的各延伸引物和延伸產(chǎn)物的理論分子量進(jìn)行比對(duì)，從而確定待檢混合物是否包含特定的物質(zhì)，進(jìn)而確定各SNP處的基因型；

聯(lián)合多重PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸包括：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種多發(fā)性肉芽腫血管炎及微小動(dòng)脈炎的基因分型診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：

a.PCR 擴(kuò)增和延伸反應(yīng)

1) 通過(guò)多重 PCR 擴(kuò)增，獲得靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物：分別在 384 孔里加入 1μl 基因組 DNA(5 ng/μl), 4μl PCR 反應(yīng)混合液；

反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 20 sec, 56 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 min, 45 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min；

2) 使用蝦堿性磷酸酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物，除去擴(kuò)增產(chǎn)物中的 dNTPs：在 384 孔中加入 2μl SAP 反應(yīng)混合液，進(jìn)行 SAP 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37 ℃ 40 min, 85 ℃ 10min；

反應(yīng)完成后降至室溫并 4 ℃保存；

3) 加入延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，在延伸引物 3’端連接一個(gè)與突變位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基，獲得小片段單鏈延伸產(chǎn)物；

在 384 孔中加入 2μl 單堿基延伸反應(yīng)液及適量引物，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94 ℃15 min;94 ℃20 sec, 56 ℃30 sec, 72 ℃1 min, 72 ℃3 min; 4 ℃保存；

b. 產(chǎn)物純化和質(zhì)譜上機(jī)

1） 使用陽(yáng)離子交換樹脂純化延伸產(chǎn)物，除去延伸產(chǎn)物的陽(yáng)離子；

在 384 孔中加入 16 μl 去離子水與 6 mg樹脂進(jìn)行脫鹽處理；

2）用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）對(duì)純化后的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)；

c. 數(shù)據(jù)分析：使用 MassARRAY Typer 系統(tǒng)對(duì)HLA-DPB1三等位基因和HLA-DQA2等位基因信息進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。