1.一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法,其特征在于:包括原料油類的水解方法、槐糖脂的發(fā)酵方法和萃取分離方法,其中,所述原料油類的水解方法包括如下步驟:
步驟1:將搖瓶培養(yǎng)基原料置于燒杯中并利用純化水進(jìn)行溶解,溶解之后平均分裝至搖瓶,然后每個(gè)搖瓶中添加原料油類并調(diào)節(jié)pH為8-9,滅菌得到搖瓶培養(yǎng)基,其中搖瓶培養(yǎng)基原料按重量份由如下原料組成:葡萄糖28-32份、酵母提取物14-16份、KH2PO40.9-1.4份、CaCl20.1-0.4份、氯化鈉1-2份、硫酸鎂1.5-4份、氫氧化鉀2-5份,純化水的用量為搖瓶培養(yǎng)基原料重量的4-5倍,原料油類添加量為每個(gè)搖瓶裝瓶量的28-32%;
步驟2:將試管生物酶菌分離接入搖瓶培養(yǎng)基中,用透氣棉塞封口,放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中,轉(zhuǎn)速150rpm,培養(yǎng)溫度30℃,培養(yǎng)7天,得到水解油類粗品,將水解油類粗品常溫放置12h熟成,把搖瓶中的物料轉(zhuǎn)到分液漏斗里面分離,放下下層水層去除鹽分和其它營(yíng)養(yǎng)成分,上層即為水解油類;
步驟3:將水解油類經(jīng)水洗一次,加入乙醇,溶解水解油類,其中,乙醇的用量為發(fā)酵所投入原料油類質(zhì)量的0.3倍,然后,通過(guò)純化樹(shù)脂柱去除異味并調(diào)節(jié)pH至4.5-6.5,收集液體;
步驟4:將收集的液體,第一次加入活性炭,常溫?cái)嚢?2h后快速濾紙過(guò)濾,再用慢速濾紙過(guò)濾收集濾液,濾液第二次加入活性炭,常溫?cái)嚢?2h后先用快速濾紙過(guò)濾再用慢速濾紙過(guò)濾,再用1um濾紙過(guò)濾,再用0.45um濾紙過(guò)濾,再用0.22um濾紙過(guò)濾收集濾液,將收集的濾液經(jīng)50℃減壓濃縮完全并去除水分,用0.22um濾紙過(guò)濾除菌,得到水解油類成品;
所述槐糖脂的發(fā)酵方法包括如下步驟:
步驟5:在錐形瓶中加入純水,按2.1%加入YM Broth培養(yǎng)基,超聲震蕩溶解后,用透氣棉塞封口,用鋁箔包好,高壓蒸汽滅菌30min,溫度為121℃,在超凈臺(tái)中冷卻至27℃后接入3%冷藏酵母菌,塞上棉塞,放入搖床,轉(zhuǎn)速180rpm、27℃培養(yǎng)48h;
步驟6:配制產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中,準(zhǔn)備堿液和消泡劑,裝入堿液瓶與消泡劑瓶中,與發(fā)酵罐一起用鋁箔包好,溫度為121℃,高壓蒸汽滅菌30min,滅完菌后裝好發(fā)酵罐與堿液瓶、消泡劑瓶,待培養(yǎng)基冷卻后從接種口接入已搖床培養(yǎng)48h的酵母菌液,開(kāi)始發(fā)酵,發(fā)酵期間pH值控制在4,轉(zhuǎn)速300rpm,通風(fēng)0.5vvm;
步驟7:每天從取樣口取樣,對(duì)培養(yǎng)液的pH值、含糖量進(jìn)行測(cè)量,并通過(guò)吸光度的測(cè)試確定菌種生長(zhǎng)情況,當(dāng)菌種度過(guò)調(diào)整期進(jìn)入對(duì)數(shù)期后加入發(fā)酵原料——10%動(dòng)植物油類,不再進(jìn)行pH值控制,轉(zhuǎn)速450rpm,通風(fēng)0.75vvm,含糖量控制在3%--4%;
所述萃取分離階段包括以下步驟:
步驟8:在加入動(dòng)植物油類后,每天從取樣口取樣10ml,加入等體積正己烷震蕩分層,取上清液50℃濃縮至干,稱量得出重量即為樣品中動(dòng)植物油類含量,再向下層液中兩次加入等體積乙酸乙酯震蕩分層,將兩次所得上層液合并,50℃濃縮至干,稱量得出重量即為樣品中槐糖脂含量;
步驟9:發(fā)酵周期結(jié)束后,以兩種方法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生發(fā)用槐糖脂的分離,方法一:向一半發(fā)酵液內(nèi)加入等質(zhì)量95%的乙醇,攪拌均勻后過(guò)濾,濾液稱重,加入濾液質(zhì)量1%的活性炭,攪拌0.5h,用1μm濾紙過(guò)濾,所得濾液內(nèi)再加入1%質(zhì)量的活性炭,攪拌0.5h,用硅藻土助濾,濾液再用0.22μm濾膜過(guò)濾,之后70℃濃縮至干,所得濃縮產(chǎn)物即為終產(chǎn)品;方法二:向一半發(fā)酵液內(nèi)加入等質(zhì)量二氯甲烷,攪拌0.5h后靜置分層,二氯甲烷層保留,向水層內(nèi)再加入1/2質(zhì)量的二氯甲烷,攪拌分層,保留二氯甲烷層,將兩次所得的二氯甲烷匯集,加入1/3質(zhì)量的水,攪拌0.5h,靜置分層,取二氯甲烷層,再向所得二氯甲烷層加入1/3質(zhì)量的水,攪拌0.5h,靜置分層,取二氯甲烷層,向所得的二氯甲烷層加入1%質(zhì)量的活性炭,攪拌0.5h,用1μm濾紙過(guò)濾,所得活性炭加適量二氯甲烷攪拌0.5h,與先前所得的二氯甲烷濾液匯集后用硅藻土過(guò)濾,向?yàn)V液內(nèi)加入所加原料動(dòng)植物油質(zhì)量的0.01%質(zhì)量的TBHQ(特丁基對(duì)苯二酚),50℃濃縮至干,向濃縮產(chǎn)物內(nèi)加適量乙醇溶解,70℃濃縮至干,再向濃縮產(chǎn)物內(nèi)加適量乙醇,之后70℃濃縮至干,所得濃縮產(chǎn)物即為終產(chǎn)品;
步驟10:分別取適量的兩種方法分離得到的最終濃縮產(chǎn)物,以20倍質(zhì)量的水加熱溶解,加入等體積正己烷充分震蕩后靜置分層,取上層液50℃濃縮至干,稱量得出重量即為終產(chǎn)物中動(dòng)植物油類或水解油類的含量;再向下層液中兩次加入等體積乙酸乙酯充分震蕩后靜置分層,將兩次所得上層液合并,50℃濃縮至干,稱量得出重量即為終產(chǎn)物中生發(fā)用槐糖脂的含量,由此可計(jì)算出本次發(fā)酵生產(chǎn)所用原料動(dòng)植物油類或水解油類的轉(zhuǎn)化率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟1中,搖瓶培養(yǎng)基原料按重量份由如下原料組成:葡萄糖30份、酵母提取物15份、KH2PO41.2份、CaCl20.3份、氯化鈉1.5份、硫酸鎂3份、氫氧化鉀3份,所述原料油類添加量為每個(gè)搖瓶裝瓶量的30%,所述pH值通過(guò)5mol/L 氫氧化鉀調(diào)節(jié),所述搖瓶培養(yǎng)基滅菌采用蒸汽滅菌,該蒸汽滅菌步驟為:a.預(yù)熱:40分鐘內(nèi)升溫至100℃;
b.保溫滅菌:20-30分鐘內(nèi)升溫至121-123℃,保溫30分鐘;
c.一次降溫:30分鐘降溫到100℃;
d.二次降溫:120分鐘降溫至30℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟5中,所述冷藏酵母菌的獲取步驟:
a.富集:在YM Broth培養(yǎng)基中180rpm、27℃搖瓶培養(yǎng)24h;
b.保菌:向菌液內(nèi)加入等體積高壓蒸汽滅菌并冷卻的50%的甘油溶液,混合均勻,分裝入10ml離心管內(nèi);
c.藏菌:將離心管包好放入冰箱冷凍柜中,低溫保藏。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟4、9中活性炭為醫(yī)藥級(jí)粉末活性炭,所述步驟4中的水解油類成品采用無(wú)菌包裝。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟5中,培養(yǎng)基及接種菌液量的和值不超過(guò)錐形瓶裝瓶量的10%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟6中,利用6mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵中培養(yǎng)基的pH值,所述消泡劑為乳狀消泡劑,與水以1:5比例混合均勻后使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟7中測(cè)量樣品吸光度所用波長(zhǎng)為660nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟5、6中,冷卻后的培養(yǎng)基溫度應(yīng)維持在25-32℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟9中,所用95%的乙醇、二氯甲烷均可以在濃縮后回收再利用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟6中,培養(yǎng)基有以下三種配制方法:
方法一:Industrial Medium(產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)基):葡萄糖:10%、磷酸二氫鉀:0.1%、氯化鈉:0.01%、二水氯化鈣:0.01%、七水硫酸鎂:0.05%、蛋白胨:0.07%、酵母提取物:0.5%、純水:89.26%,混合溶解,葡萄糖在水中易結(jié)塊,因此需要邊攪拌邊加入;
方法二:Rice Bran Extract(TC)Medium(纖維素酶處理米糠提取物培養(yǎng)基):纖維素酶處理米糠提取物:5%、葡糖糖:10%、純水85%,混合,將純水加熱溶解,由于米糠提取物溶解緩慢,可使用超聲波震蕩儀加速溶解,
纖維素酶處理米糠提取物制作步驟:取適量米糠,加入20倍質(zhì)量的純水?dāng)嚢杈鶆?,取米糠質(zhì)量3%的纖維素酶(Cellulase),用少量純水溶解之后加入到米糠的懸浮液中,將上述溶液放入水浴鍋中,45℃攪拌12h,使其充分水解,之后將米糠懸浮液90℃水浴加熱30min對(duì)纖維素酶進(jìn)行滅活,待液體冷卻后加入等質(zhì)量95%的乙醇溶液,充分?jǐn)嚢韬笥?μm濾紙過(guò)濾,所得濾液70℃濃縮至干,得到的濃縮產(chǎn)物即為纖維素酶處理米糠提取物,
另外,濃縮得到的乙醇溶液濃度可達(dá)70%,可回收再利用,
方法三:Orange Peel Extract(TC)Medium(桔皮提取物培養(yǎng)基):纖維素酶處理桔皮提取物制作步驟:取適量新鮮桔皮,用刀切成細(xì)小碎塊,稱量重量,加入10倍質(zhì)量的純水?dāng)嚢杈鶆?,取新鮮桔皮質(zhì)量3%的纖維素酶(Cellulase),用少量純水溶解之后加入到新鮮桔皮的懸浮液中,將上述溶液裝入濃縮瓶,放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中,45℃旋轉(zhuǎn)加熱12h,使纖維素酶(Cellulase)充分發(fā)揮作用,之后將溫度升高到90℃旋轉(zhuǎn)加熱30min對(duì)纖維素酶進(jìn)行滅活,待液體冷卻后加入等質(zhì)量95%的乙醇溶液,充分?jǐn)嚢韬笥?μm濾紙過(guò)濾,所得濾液70℃濃縮至干,得到的濃縮產(chǎn)物即為纖維素酶處理桔皮提取物,另外,濃縮得到的乙醇溶液濃度可到85%,可回收再利用。