本發(fā)明涉及化妝品領(lǐng)域，尤其是涉及一種以動(dòng)植物提取及再加工油類為原料的槐糖脂的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
槐糖脂是一類可降解的生物表面活性劑，由科學(xué)家Spencer在1954年首次發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)際上對(duì)槐糖脂的理論研究及應(yīng)用開(kāi)發(fā)已開(kāi)展多年，而我國(guó)如今在該領(lǐng)域的發(fā)展仍處于起步階段。
生物表面活性劑是天然表面活性劑的一種，是微生物在一定培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的集親水性和親油性結(jié)構(gòu)于一體的代謝產(chǎn)物。生物表面活性劑不僅具有增溶、乳化、潤(rùn)濕、發(fā)泡、分散、降低表面張力等表面活性劑所共有的性能，還具有無(wú)毒、可生物降解、生態(tài)安全以及高表面活性等優(yōu)點(diǎn)，因此在工業(yè)生產(chǎn)中起著舉足輕重的作用。
槐糖脂為糖脂系生物表面活性劑，由于糖脂系生物表面活性劑具有天然無(wú)毒、生物可降解、環(huán)境友好的特點(diǎn)，使其在環(huán)境保護(hù)、食品、化妝品、洗滌劑及醫(yī)藥等方面顯示出了良好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。而其中槐糖脂結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高，可制得各種衍生物，在糖脂系生物表面活性劑中最具有應(yīng)用前景，目前已廣泛應(yīng)用于日化、食品工業(yè)、石油工業(yè)等領(lǐng)域。
槐糖脂由親水性的槐糖（2個(gè)葡萄糖分子以β-1，2糖苷鍵結(jié)合）和疏水性的飽和或不飽和的長(zhǎng)鏈ω-（或ω-1）羥基脂肪酸兩部分構(gòu)成。不同結(jié)構(gòu)的槐糖脂具有不同的理化性質(zhì)。已知槐糖脂主要有2種類型：內(nèi)酯型和酸型。內(nèi)酯型槐糖脂能較好的降低表面張力且抗菌活性較強(qiáng)；而酸型槐糖脂有較好的泡沫形成能力和溶解性，乙?；鶊F(tuán)能夠降低槐糖脂的親水性，增強(qiáng)其抗病毒能力。
槐糖脂的作用：作為表面活性劑的一種，槐糖脂具有一般表面活性劑所具有的作用：
(1)乳化作用
油脂在水中表面張力大，不溶于水，即使用力攪拌，靜置后又會(huì)重新分層。而如果向水中加入表面活性劑，攪拌靜置后卻不易分層，這就是乳化作用。
化妝品在生產(chǎn)膏霜、乳液時(shí)離不開(kāi)表面活性劑的乳化作用。
(2)增溶作用
表面活性劑在水溶液中形成膠束后能明顯提高不溶或微溶于水的有機(jī)化合物的溶解度，且形成的溶液呈透明狀，這種作用稱為增溶作用。
化妝品生產(chǎn)中化妝水、生發(fā)油、生發(fā)養(yǎng)發(fā)劑的生產(chǎn)增依賴于表面活性劑的增溶作用。
(3)分散作用
在水中的灰塵和污粒等固體粒子比較容易聚集在一起發(fā)生沉降，加入表面活性劑分子能使固體粒子聚集體分割成細(xì)小的微粒，使其分散懸浮在溶液中，起到促使固體粒子均勻分散的作用。
化妝品中的遮瑕和防曬產(chǎn)品需要表面活性劑的分散作用。
(4)泡沫作用
活性劑的定向吸附作用使氣液兩相間的表面張力降低從而形成泡沫。一般低分子活性劑容易發(fā)泡，高分子活性劑泡沫少。
(5)潤(rùn)濕作用
當(dāng)液體與固體表面接觸時(shí)，氣體被排斥，原來(lái)的固-氣界面消失，代之以固-液界面，這種現(xiàn)象稱為潤(rùn)濕。從普遍意義而言，潤(rùn)濕是一種流體被另一種流體自表面取代的過(guò)程。當(dāng)水溶液中加入表面活性劑時(shí)，被接觸面上的表面張力大大降低，從而達(dá)到潤(rùn)濕目的。
此外，槐糖脂還具有其它功效：
(6)抗菌作用
槐糖脂經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明對(duì)枯草芽孢桿菌、木糖葡萄球菌、變異鏈球菌有較好抗菌活性；對(duì)霉菌和腐霉菌有生長(zhǎng)抑制作用；對(duì)多種細(xì)菌和真菌有良好的生長(zhǎng)抑制作用。
(7)抗炎作用
實(shí)驗(yàn)研究表明槐糖脂通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮、粘附因子和炎癥細(xì)胞因子的生成，能減少實(shí)驗(yàn)鼠敗血性腹膜炎模型中膿毒癥的死亡率；槐糖脂作用于骨髓瘤細(xì)胞系U266，可以降低IgE失調(diào)疾病的產(chǎn)生。
(8)原材料
槐糖脂還可以作為ω和ω-1羥基脂肪酸和槐糖的原材料。在香水行業(yè)中，槐糖脂的疏水部分-羥基脂肪酸可通過(guò)內(nèi)酯化反應(yīng)合成大環(huán)脂類，或者作為多聚反應(yīng)中的單體，這些自然界難以得到的脂肪酸分子可以通過(guò)酸或者酶（比如柚苷酶）分解槐糖脂分子來(lái)獲得。槐糖脂還可以誘導(dǎo)紅褐肉座菌產(chǎn)
生纖維素酶。
槐糖脂作為天然表面活性劑的一種，不僅具有表面活性劑的一般作用，還有很多其他功效。此外，槐糖脂還可以刺激皮膚真皮層纖維細(xì)胞代謝和膠原重新合成，減少皮下脂肪儲(chǔ)存，適合用于化妝品中。然而，由于槐糖脂生產(chǎn)過(guò)程中存在轉(zhuǎn)化率低、分離難度大等問(wèn)題，大部分研究還停留在實(shí)驗(yàn)室階段。因此，需要對(duì)槐糖脂工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究探索，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，并最終應(yīng)用于日常生活。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法，包括原料油類的水解方法、槐糖脂的發(fā)酵方法和萃取分離方法，其中，所述原料油類的水解方法包括如下步驟：
步驟1：將搖瓶培養(yǎng)基原料置于燒杯中并利用純化水進(jìn)行溶解，溶解之后平均分裝至搖瓶，然后每個(gè)搖瓶中添加原料油類并調(diào)節(jié)pH為8-9，滅菌得到搖瓶培養(yǎng)基，其中搖瓶培養(yǎng)基原料按重量份由如下原料組成：葡萄糖28-32份、酵母提取物14-16份、KH2PO40.9-1.4份、CaCl20.1-0.4份、氯化鈉1-2份、硫酸鎂1.5-4份、氫氧化鉀2-5份，純化水的用量為搖瓶培養(yǎng)基原料重量的4-5倍，原料油類添加量為每個(gè)搖瓶裝瓶量的28-32%；
步驟2：將試管生物酶菌分離接入搖瓶培養(yǎng)基中，用透氣棉塞封口，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)7天，得到水解油類粗品，將水解油類粗品常溫放置12h熟成，把搖瓶中的物料轉(zhuǎn)到分液漏斗里面分離，放下下層水層去除鹽分和其它營(yíng)養(yǎng)成分，上層即為水解油類；
步驟3：將水解油類經(jīng)水洗一次，加入乙醇，溶解水解油類，其中，乙醇的用量為發(fā)酵所投入原料油類質(zhì)量的0.3倍，然后，通過(guò)純化樹(shù)脂柱去除異味并調(diào)節(jié)pH至4.5-6.5，收集液體；
步驟4：將收集的液體，第一次加入活性炭，常溫?cái)嚢?2h后快速濾紙過(guò)濾，再用慢速濾紙過(guò)濾收集濾液，濾液第二次加入活性炭，常溫?cái)嚢?2h后先用快速濾紙過(guò)濾再用慢速濾紙過(guò)濾，再用1um濾紙過(guò)濾，再用0.45um濾紙過(guò)濾，再用0.22um濾紙過(guò)濾收集濾液，將收集的濾液經(jīng)50℃減壓濃縮完全并去除水分，用0.22um濾紙過(guò)濾除菌，得到水解油類成品。
所述槐糖脂的發(fā)酵方法包括如下步驟：
步驟5：在錐形瓶中加入純水，按2.1%加入YM Broth培養(yǎng)基，超聲震蕩溶解后，用透氣棉塞封口，用鋁箔包好，高壓蒸汽滅菌30min，溫度為121℃，在超凈臺(tái)中冷卻至27℃后接入3%冷藏酵母菌，塞上棉塞，放入搖床，轉(zhuǎn)速180rpm、27℃培養(yǎng)48h；
步驟6：配制產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中，準(zhǔn)備堿液和消泡劑，裝入堿液瓶與消泡劑瓶中，與發(fā)酵罐一起用鋁箔包好，溫度為121℃，高壓蒸汽滅菌30min，滅完菌后裝好發(fā)酵罐與堿液瓶、消泡劑瓶，待培養(yǎng)基冷卻后從接種口接入已搖床培養(yǎng)48h的酵母菌液，開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵期間pH值控制在4,轉(zhuǎn)速300rpm，通風(fēng)0.5vvm；
步驟7：每天從取樣口取樣，對(duì)培養(yǎng)液的pH值、含糖量進(jìn)行測(cè)量，并通過(guò)吸光度的測(cè)試確定菌種生長(zhǎng)情況，當(dāng)菌種度過(guò)調(diào)整期進(jìn)入對(duì)數(shù)期后加入發(fā)酵原料——10%動(dòng)植物油類，不再進(jìn)行pH值控制，轉(zhuǎn)速450rpm，通風(fēng)0.75vvm，含糖量控制在3%--4%；
所述萃取分離階段包括以下步驟：
步驟8：在加入動(dòng)植物油類后，每天從取樣口取樣10ml，加入等體積正己烷震蕩分層，取上清液50℃濃縮至干，稱量得出重量即為樣品中動(dòng)植物油類含量，再向下層液中兩次加入等體積乙酸乙酯震蕩分層，將兩次所得上層液合并，50℃濃縮至干，稱量得出重量即為樣品中槐糖脂含量；
步驟9：發(fā)酵周期結(jié)束后，以兩種方法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生發(fā)用槐糖脂的分離，方法一：向一半發(fā)酵液內(nèi)加入等質(zhì)量95%的乙醇，攪拌均勻后過(guò)濾，濾液稱重，加入濾液質(zhì)量1%的活性炭，攪拌0.5h，用1μm濾紙過(guò)濾，所得濾液內(nèi)再加入1%質(zhì)量的活性炭，攪拌0.5h，用硅藻土助濾，濾液再用0.22μm濾膜過(guò)濾，之后70℃濃縮至干，所得濃縮產(chǎn)物即為終產(chǎn)品；方法二：向一半發(fā)酵液內(nèi)加入等質(zhì)量二氯甲烷，攪拌0.5h后靜置分層，二氯甲烷層保留，向水層內(nèi)再加入1/2質(zhì)量的二氯甲烷，攪拌分層，保留二氯甲烷層。將兩次所得的二氯甲烷匯集，加入1/3質(zhì)量的水，攪拌0.5h，靜置分層，取二氯甲烷層，再向所得二氯甲烷層加入1/3質(zhì)量的水，攪拌0.5h，靜置分層，取二氯甲烷層。向所得的二氯甲烷層加入1%質(zhì)量的活性炭，攪拌0.5h，用1μm濾紙過(guò)濾，所得活性炭加適量二氯甲烷攪拌0.5h，與先前所得的二氯甲烷濾液匯集后用硅藻土過(guò)濾，向?yàn)V液內(nèi)加入所加原料動(dòng)植物油質(zhì)量的0.01%質(zhì)量的TBHQ（特丁基對(duì)苯二酚），50℃濃縮至干，向濃縮產(chǎn)物內(nèi)加適量乙醇溶解，70℃濃縮至干，再向濃縮產(chǎn)物內(nèi)加適量乙醇，之后70℃濃縮至干，所得濃縮產(chǎn)物即為終產(chǎn)品；
步驟10：分別取適量的兩種方法分離得到的最終濃縮產(chǎn)物，以20倍質(zhì)量的水加熱溶解，加入等體積正己烷充分震蕩后靜置分層，取上層液50℃濃縮至干，稱量得出重量即為終產(chǎn)物中動(dòng)植物油類或水解油類的含量；再向下層液中兩次加入等體積乙酸乙酯充分震蕩后靜置分層，將兩次所得上層液合并，50℃濃縮至干，稱量得出重量即為終產(chǎn)物中生發(fā)用槐糖脂的含量，由此可計(jì)算出本次發(fā)酵生產(chǎn)所用原料動(dòng)植物油類或水解油類的轉(zhuǎn)化率。
所述步驟1中，搖瓶培養(yǎng)基原料按重量份由如下原料組成：葡萄糖30份、酵母提取物15份、KH2PO41.2份、CaCl20.3份、氯化鈉1.5份、硫酸鎂3份、氫氧化鉀3份,所述原料油類添加量為每個(gè)搖瓶裝瓶量的30%，所述pH值通過(guò)5mol/L 氫氧化鉀調(diào)節(jié)，所述搖瓶培養(yǎng)基滅菌采用蒸汽滅菌，該蒸汽滅菌步驟為：a.預(yù)熱：40分鐘內(nèi)升溫至100℃；
b.保溫滅菌：20-30分鐘內(nèi)升溫至121-123℃，保溫30分鐘；
c.一次降溫：30分鐘降溫到100℃；
d.二次降溫：120分鐘降溫至30℃。
所述步驟5中，所述冷藏酵母菌的獲取步驟：
a.富集：在YM Broth培養(yǎng)基中180rpm、27℃搖瓶培養(yǎng)24h；
b.保菌：向菌液內(nèi)加入等體積高壓蒸汽滅菌并冷卻的50%的甘油溶液，混合均勻，分裝入10ml離心管內(nèi)；
c.藏菌：將離心管包好放入冰箱冷凍柜中，低溫保藏。
所述步驟4、9中活性炭為醫(yī)藥級(jí)粉末活性炭，所述步驟4中的水解油類成品采用無(wú)菌包裝。
所述步驟5中，培養(yǎng)基及接種菌液量的和值不超過(guò)錐形瓶裝瓶量的10%。
所述步驟6中，利用6mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵中培養(yǎng)基的pH值，所述消泡劑為乳狀消泡劑，與水以1：5比例混合均勻后使用。
所述步驟7中測(cè)量樣品吸光度所用波長(zhǎng)為660nm。
所述步驟5、6中，冷卻后的培養(yǎng)基溫度應(yīng)維持在25-32℃。
所述步驟9中，所用95%的乙醇、二氯甲烷均可以在濃縮后回收再利用。
所述步驟6中，培養(yǎng)基有以下三種配制方法：
方法一：Industrial Medium（產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)基）：葡萄糖：10%、磷酸二氫鉀：0.1%、氯化鈉：0.01%、二水氯化鈣：0.01%、七水硫酸鎂：0.05%、蛋白胨：0.07%、酵母提取物：0.5%、純水：89.26%，混合溶解，葡萄糖在水中易結(jié)塊，因此需要邊攪拌邊加入。
方法二：Rice Bran Extract（TC）Medium（纖維素酶處理米糠提取物培養(yǎng)基）：纖維素酶處理米糠提取物：5%、葡糖糖：10%、純水85%，混合，將純水加熱溶解，由于米糠提取物溶解緩慢，可使用超聲波震蕩儀加速溶解。
纖維素酶處理米糠提取物制作步驟：取適量米糠，加入20倍質(zhì)量的純水?dāng)嚢杈鶆?，取米糠質(zhì)量3%的纖維素酶（Cellulase），用少量純水溶解之后加入到米糠的懸浮液中，將上述溶液放入水浴鍋中，45℃攪拌12h，使其充分水解，之后將米糠懸浮液90℃水浴加熱30min對(duì)纖維素酶進(jìn)行滅活，待液體冷卻后加入等質(zhì)量95%的乙醇溶液，充分?jǐn)嚢韬笥?μm濾紙過(guò)濾，所得濾液70℃濃縮至干，得到的濃縮產(chǎn)物即為纖維素酶處理米糠提取物。另外，濃縮得到的乙醇溶液濃度可達(dá)70%，可回收再利用。
方法三：Orange Peel Extract（TC）Medium（桔皮提取物培養(yǎng)基）：纖維素酶處理桔皮提取物制作步驟：取適量新鮮桔皮，用刀切成細(xì)小碎塊，稱量重量，加入10倍質(zhì)量的純水?dāng)嚢杈鶆?，取新鮮桔皮質(zhì)量3%的纖維素酶（Cellulase），用少量純水溶解之后加入到新鮮桔皮的懸浮液中，將上述溶液裝入濃縮瓶，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，45℃旋轉(zhuǎn)加熱12h，使纖維素酶（Cellulase）充分發(fā)揮作用，之后將溫度升高到90℃旋轉(zhuǎn)加熱30min對(duì)纖維素酶進(jìn)行滅活，待液體冷卻后加入等質(zhì)量95%的乙醇溶液，充分?jǐn)嚢韬笥?μm濾紙過(guò)濾，所得濾液70℃濃縮至干，得到的濃縮產(chǎn)物即為纖維素酶處理桔皮提取物。另外，濃縮得到的乙醇溶液濃度可到85%，可回收再利用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：運(yùn)用于化妝品生產(chǎn)具有更好的生發(fā)、抗脫發(fā)作用，且天然無(wú)毒害，并能促進(jìn)細(xì)胞增值，加強(qiáng)細(xì)胞新陳代謝，有助于毛發(fā)生長(zhǎng)。
具體實(shí)施方式
一種具有生發(fā)作用的槐糖脂的生產(chǎn)方法，包括原料油類的水解方法、槐糖脂的發(fā)酵方法和萃取分離方法，其中，原料油類的水解方法包括如下步驟：
步驟1：將搖瓶培養(yǎng)基原料置于燒杯中并利用純化水進(jìn)行溶解，溶解之后平均分裝至搖瓶，然后每個(gè)搖瓶中添加原料油類并調(diào)節(jié)pH為8-9，滅菌得到搖瓶培養(yǎng)基，其中搖瓶培養(yǎng)基原料按重量份由如下原料組成：葡萄糖28-32份、酵母提取物14-16份、KH2PO40.9-1.4份、CaCl20.1-0.4份、氯化鈉1-2份、硫酸鎂1.5-4份、氫氧化鉀2-5份，純化水的用量為搖瓶培養(yǎng)基原料重量的4-5倍，原料油類添加量為每個(gè)搖瓶裝瓶量的28-32%；
步驟2：將試管生物酶菌分離接入搖瓶培養(yǎng)基中，用透氣棉塞封口，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)7天，得到水解油類粗品，將水解油類粗品常溫放置12h熟成，把搖瓶中的物料轉(zhuǎn)到分液漏斗里面分離，放下下層水層去除鹽分和其它營(yíng)養(yǎng)成分，上層即為水解油類；
步驟3：將水解油類經(jīng)水洗一次，加入乙醇，溶解水解油類，其中，乙醇的用量為發(fā)酵所投入原料油類質(zhì)量的0.3倍，然后，通過(guò)純化樹(shù)脂柱去除異味并調(diào)節(jié)pH至4.5-6.5，收集液體；
步驟4：將收集的液體，第一次加入活性炭，常溫?cái)嚢?2h后快速濾紙過(guò)濾，再用慢速濾紙過(guò)濾收集濾液，濾液第二次加入活性炭，常溫?cái)嚢?2h后先用快速濾紙過(guò)濾再用慢速濾紙過(guò)濾，再用1um濾紙過(guò)濾，再用0.45um濾紙過(guò)濾，再用0.22um濾紙過(guò)濾收集濾液，將收集的濾液經(jīng)50℃減壓濃縮完全并去除水分，用0.22um濾紙過(guò)濾除菌，得到水解油類成品。
槐糖脂的發(fā)酵方法包括如下步驟：
步驟5：在錐形瓶中加入純水，按2.1%加入YM Broth培養(yǎng)基，超聲震蕩溶解后，用透氣棉塞封口，用鋁箔包好，高壓蒸汽滅菌30min，溫度為121℃，在超凈臺(tái)中冷卻至27℃后接入3%冷藏酵母菌，塞上棉塞，放入搖床，轉(zhuǎn)速180rpm、27℃培養(yǎng)48h；
步驟6：配制產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中，準(zhǔn)備堿液和消泡劑，裝入堿液瓶與消泡劑瓶中，與發(fā)酵罐一起用鋁箔包好，溫度為121℃，高壓蒸汽滅菌30min，滅完菌后裝好發(fā)酵罐與堿液瓶、消泡劑瓶，待培養(yǎng)基冷卻后從接種口接入已搖床培養(yǎng)48h的酵母菌液，開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵期間pH值控制在4,轉(zhuǎn)速300rpm，通風(fēng)0.5vvm；培養(yǎng)基有以下三種配制方法：
方法一：Industrial Medium（產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)基）：葡萄糖：10%、磷酸二氫鉀：0.1%、氯化鈉：0.01%、二水氯化鈣：0.01%、七水硫酸鎂：0.05%、蛋白胨：0.07%、酵母提取物：0.5%、純水：89.26%，混合溶解，葡萄糖在水中易結(jié)塊，因此需要邊攪拌邊加入。
方法二：Rice Bran Extract（TC）Medium（纖維素酶處理米糠提取物培養(yǎng)基）：纖維素酶處理米糠提取物：5%、葡糖糖：10%、純水85%，混合，將純水加熱溶解，由于米糠提取物溶解緩慢，可使用超聲波震蕩儀加速溶解。
纖維素酶處理米糠提取物制作步驟：取適量米糠，加入20倍質(zhì)量的純水?dāng)嚢杈鶆?，取米糠質(zhì)量3%的纖維素酶（Cellulase），用少量純水溶解之后加入到米糠的懸浮液中，將上述溶液放入水浴鍋中，45℃攪拌12h，使其充分水解，之后將米糠懸浮液90℃水浴加熱30min對(duì)纖維素酶進(jìn)行滅活，待液體冷卻后加入等質(zhì)量95%的乙醇溶液，充分?jǐn)嚢韬笥?μm濾紙過(guò)濾，所得濾液70℃濃縮至干，得到的濃縮產(chǎn)物即為纖維素酶處理米糠提取物。另外，濃縮得到的乙醇溶液濃度可達(dá)70%，可回收再利用。
方法三：Orange Peel Extract（TC）Medium（桔皮提取物培養(yǎng)基）：纖維素酶處理桔皮提取物制作步驟：取適量新鮮桔皮，用刀切成細(xì)小碎塊，稱量重量，加入10倍質(zhì)量的純水?dāng)嚢杈鶆?，取新鮮桔皮質(zhì)量3%的纖維素酶（Cellulase），用少量純水溶解之后加入到新鮮桔皮的懸浮液中，將上述溶液裝入濃縮瓶，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，45℃旋轉(zhuǎn)加熱12h，使纖維素酶（Cellulase）充分發(fā)揮作用，之后將溫度升高到90℃旋轉(zhuǎn)加熱30min對(duì)纖維素酶進(jìn)行滅活，待液體冷卻后加入等質(zhì)量95%的乙醇溶液，充分?jǐn)嚢韬笥?μm濾紙過(guò)濾，所得濾液70℃濃縮至干，得到的濃縮產(chǎn)物即為纖維素酶處理桔皮提取物。另外，濃縮得到的乙醇溶液濃度可到85%，可回收再利用。
步驟7：每天從取樣口取樣，對(duì)培養(yǎng)液的pH值、含糖量進(jìn)行測(cè)量，并通過(guò)吸光度的測(cè)試確定菌種生長(zhǎng)情況，當(dāng)菌種度過(guò)調(diào)整期進(jìn)入對(duì)數(shù)期后加入發(fā)酵原料——10%動(dòng)植物油類，不再進(jìn)行pH值控制，轉(zhuǎn)速450rpm，通風(fēng)0.75vvm，含糖量控制在3%--4%；
萃取分離階段包括以下步驟：
步驟8：在加入動(dòng)植物油類后，每天從取樣口取樣10ml，加入等體積正己烷震蕩分層，取上清液50℃濃縮至干，稱量得出重量即為樣品中動(dòng)植物油類含量，再向下層液中兩次加入等體積乙酸乙酯震蕩分層，將兩次所得上層液合并，50℃濃縮至干，稱量得出重量即為樣品中槐糖脂含量；
步驟9：發(fā)酵周期結(jié)束后，以兩種方法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生發(fā)用槐糖脂的分離，方法一：向一半發(fā)酵液內(nèi)加入等質(zhì)量95%的乙醇，攪拌均勻后過(guò)濾，濾液稱重，加入濾液質(zhì)量1%的活性炭，攪拌0.5h，用1μm濾紙過(guò)濾，所得濾液內(nèi)再加入1%質(zhì)量的活性炭，攪拌0.5h，用硅藻土助濾，濾液再用0.22μm濾膜過(guò)濾，之后70℃濃縮至干，所得濃縮產(chǎn)物即為終產(chǎn)品；方法二：向一半發(fā)酵液內(nèi)加入等質(zhì)量二氯甲烷，攪拌0.5h后靜置分層，二氯甲烷層保留，向水層內(nèi)再加入1/2質(zhì)量的二氯甲烷，攪拌分層，保留二氯甲烷層。將兩次所得的二氯甲烷匯集，加入1/3質(zhì)量的水，攪拌0.5h，靜置分層，取二氯甲烷層，再向所得二氯甲烷層加入1/3質(zhì)量的水，攪拌0.5h，靜置分層，取二氯甲烷層。向所得的二氯甲烷層加入1%質(zhì)量的活性炭，攪拌0.5h，用1μm濾紙過(guò)濾，所得活性炭加適量二氯甲烷攪拌0.5h，與先前所得的二氯甲烷濾液匯集后用硅藻土過(guò)濾，向?yàn)V液內(nèi)加入所加原料動(dòng)植物油質(zhì)量的0.01%質(zhì)量的TBHQ（特丁基對(duì)苯二酚），50℃濃縮至干，向濃縮產(chǎn)物內(nèi)加適量乙醇溶解，70℃濃縮至干，再向濃縮產(chǎn)物內(nèi)加適量乙醇，之后70℃濃縮至干，所得濃縮產(chǎn)物即為終產(chǎn)品；
步驟10：分別取適量的兩種方法分離得到的最終濃縮產(chǎn)物，以20倍質(zhì)量的水加熱溶解，加入等體積正己烷充分震蕩后靜置分層，取上層液50℃濃縮至干，稱量得出重量即為終產(chǎn)物中動(dòng)植物油類或水解油類的含量；再向下層液中兩次加入等體積乙酸乙酯充分震蕩后靜置分層，將兩次所得上層液合并，50℃濃縮至干，稱量得出重量即為終產(chǎn)物中生發(fā)用槐糖脂的含量，由此可計(jì)算出本次發(fā)酵生產(chǎn)所用原料動(dòng)植物油類或水解油類的轉(zhuǎn)化率。
步驟5中，所述冷藏酵母菌的獲取步驟：
a.富集：在YM Broth培養(yǎng)基中180rpm、27℃搖瓶培養(yǎng)24h；
b.保菌：向菌液內(nèi)加入等體積高壓蒸汽滅菌并冷卻的50%的甘油溶液，混合均勻，分裝入10ml離心管內(nèi)；
c.藏菌：將離心管包好放入冰箱冷凍柜中，低溫保藏。
步驟1中，搖瓶培養(yǎng)基原料按重量份由如下原料組成：葡萄糖30份、酵母提取物15份、KH2PO41.2份、CaCl20.3份、氯化鈉1.5份、硫酸鎂3份、氫氧化鉀3份,所述原料油類添加量為每個(gè)搖瓶裝瓶量的30%，所述pH值通過(guò)5mol/L 氫氧化鉀調(diào)節(jié)，所述搖瓶培養(yǎng)基滅菌采用蒸汽滅菌，該蒸汽滅菌步驟為：a.預(yù)熱：40分鐘內(nèi)升溫至100℃；
b.保溫滅菌：20-30分鐘內(nèi)升溫至121-123℃，保溫30分鐘；
c.一次降溫：30分鐘降溫到100℃；
d.二次降溫：120分鐘降溫至30℃。
步驟5中，所述冷藏酵母菌的獲取步驟：
a.富集：在YM Broth培養(yǎng)基中180rpm、27℃搖瓶培養(yǎng)24h；
b.保菌：向菌液內(nèi)加入等體積高壓蒸汽滅菌并冷卻的50%的甘油溶液，混合均勻，分裝入10ml離心管內(nèi)；
c.藏菌：將離心管包好放入冰箱冷凍柜中，低溫保藏。
步驟4、9中活性炭為醫(yī)藥級(jí)粉末活性炭，步驟4中的水解油類成品采用無(wú)菌包裝，步驟5中，培養(yǎng)基及接種菌液量的和值不超過(guò)錐形瓶裝瓶量的10%，步驟6中，利用6mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵中培養(yǎng)基的pH值，消泡劑為乳狀消泡劑，與水以1：5比例混合均勻后使用，步驟7中測(cè)量樣品吸光度所用波長(zhǎng)為660nm，步驟5、6中，冷卻后的培養(yǎng)基溫度應(yīng)維持在25-32℃，步驟9中，所用95%的乙醇、二氯甲烷均可以在濃縮后回收再利用。
本發(fā)明的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)，具體為：細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中使用米諾地爾(minoxidil,MXD)為陽(yáng)性對(duì)照，使用由菜籽油經(jīng)Industrial Medium（產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)基）方法發(fā)酵生產(chǎn)的生發(fā)用槐糖脂 (ROS, rapeseed oil sophorolipid),由水飛薊油經(jīng)Rice Bran Extract（TC）Medium（纖維素酶處理米糠提取物培養(yǎng)基）方法發(fā)酵生產(chǎn)的生發(fā)用槐糖脂(SOS, silybum marianum marianum oil sophorolipid), 以及由水解水飛薊油經(jīng)Rice Bran Extract（TC）Medium（纖維素酶處理米糠提取物培養(yǎng)基）方法發(fā)酵生產(chǎn)的生發(fā)用槐糖脂(LSOS, lipase treatment silybum marianum marianum oil sophorolipid)為陰性對(duì)照，通過(guò)比較添加物不同而對(duì)HDP Cell(Human Dermal Papilla Cell)的細(xì)胞增殖的影響來(lái)確定生發(fā)用sophorolipid（槐糖脂）的生發(fā)效果。作為陽(yáng)性對(duì)照米諾地爾(minoxidil,MXD) )是得到美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and Drug Administration, FDA)公證的促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的藥物。
本發(fā)明的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中生發(fā)相關(guān)遺傳因子發(fā)現(xiàn)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，具體為：生發(fā)相關(guān)遺傳因子發(fā)現(xiàn)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中主要觀察三種遺傳因子的發(fā)現(xiàn)量：與生發(fā)、防脫發(fā)、抗衰老、抗皺相關(guān)的遺傳因子HGF(Hepatocyte growth factor)；纖維芽細(xì)胞生長(zhǎng)因子的一種、能夠刺激毛發(fā)生長(zhǎng)的遺傳因子KGF (Keratiocyte growth factor) ；在毛發(fā)生長(zhǎng)休止期時(shí)誘導(dǎo)新生毛發(fā)到生長(zhǎng)期、促進(jìn)新生血管生長(zhǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子-VEGF (Vescular endothelial growth factor)。實(shí)驗(yàn)時(shí)在培養(yǎng)的HDP Cell(Human Dermal Papilla Cell)中添加不同濃度的生發(fā)用sophorolipid（槐糖脂），通過(guò)觀察三種生發(fā)相關(guān)遺傳因子表達(dá)比例依存于濃度而增加或減少的情況來(lái)確定生發(fā)用sophorolipid（槐糖脂）的生發(fā)效果。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)RT-PCR RNA的增幅來(lái)確認(rèn)HGF(Hepatocyte growth factor)、KGF (Keratiocyte growth factor) 、-VEGF (Vescular endothelial growth factor)這三種遺傳因子的發(fā)現(xiàn)量。
以動(dòng)植物油類或水解油類為原料的生發(fā)用槐糖脂產(chǎn)品在化妝品原料中的用途包括但不僅限于作為添加劑使用。
本發(fā)明運(yùn)用于化妝品生產(chǎn)具有更好的生發(fā)、抗脫發(fā)作用，且天然無(wú)毒害，并能促進(jìn)細(xì)胞增值，加強(qiáng)細(xì)胞新陳代謝，有助于毛發(fā)生長(zhǎng)。