本發(fā)明屬于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病原檢測領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)檢測4株大鼠細(xì)小病毒（RMV、KRV、H1和RPV-1a）的多重?zé)晒夥治龇椒ā?/p>

背景技術(shù)：

大鼠細(xì)小病毒 (Rat parvovirus) 是對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠危害最為嚴(yán)重的病毒之一, 可致種鼠群繁殖率下降, 感染鼠還可通過糞便長期向外排毒，污染飼料、飲水和周圍環(huán)境，并重新感染易感動(dòng)物，造成大鼠細(xì)小病毒在鼠群中持續(xù)存在。大鼠細(xì)小病毒還會(huì)污染腫瘤移植物和細(xì)胞系, 對(duì)實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。

截至當(dāng)前，共分離出4株大鼠細(xì)小病毒RMV、KRV、H-1和RPV-1a，其中前期鑒定的KRV和H-1株是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國標(biāo)( GB 14922. 2- 2011)中 SPF 級(jí)大鼠病毒必檢項(xiàng)目之一。血清學(xué)方法是目前診斷實(shí)驗(yàn)大鼠細(xì)小病毒感染的常用方法，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國標(biāo)中規(guī)定的血清學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA)、免疫酶試驗(yàn)( IEA)、免疫熒光試驗(yàn)( IFA)和血凝抑制試驗(yàn)(HIA)，ELISA 或 IFA 一般用做大規(guī)模的篩查，HIA一般用來做確證試驗(yàn)。ELISA 和 IFA 敏感性較高，但由于細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白比較保守，會(huì)產(chǎn)生抗體間的交叉反應(yīng)，因而方法的特異性較差，并不能區(qū)分不同株型的細(xì)小病毒。同時(shí)，血清學(xué)方法存在“窗口期”，也不適用病毒在動(dòng)物間急性感染而血清還未發(fā)生陽轉(zhuǎn)的情況。PCR方法以其較高的靈敏度和特異性已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒的檢測。最初建立的PCR方法能夠鑒定KRV，但無法與H-1區(qū)分開，后續(xù)又有研究者分別設(shè)計(jì)了H-1和KRV的特異引物，能將二者區(qū)分開，但仍需要分成兩個(gè)反應(yīng)體系做鑒定。最近有實(shí)驗(yàn)室建立了大鼠細(xì)小病毒H-1株和KRV株的PCR檢測方法，特異性好，靈敏度高，能夠在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測并區(qū)分H-1和KRV，提高了檢測效率。但無論是單重還是雙重PCR技術(shù)，其結(jié)果判定都需要凝膠電泳，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在實(shí)際應(yīng)用中遇到樣品量大的情況，很難滿足檢測需求。

另外，隨著RMV和RPV-1a新毒株的發(fā)現(xiàn)，對(duì)大鼠細(xì)小病毒各株型的檢測也提上日程。目前國內(nèi)還未見到一種能同時(shí)檢測和區(qū)分4株大鼠細(xì)小病毒的方法，也未見有應(yīng)用多重?zé)晒夥治龇椒z測大鼠細(xì)小病毒的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的多重?zé)晒夥治鲆铩?/p>

本發(fā)明的另一目的在于提供一種同時(shí)檢測大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的多重?zé)晒夥治鲈噭┖小?/p>

本發(fā)明的再一目的在于提供一種同時(shí)檢測大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的多重?zé)晒夥治龇椒ā?/p>

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種同時(shí)檢測大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的多重?zé)晒夥治鲆?，所述引物核苷酸序列如下所示?/p>

引物M1：ACACCATGCCAACTGCAGATG（SEQ ID NO：1），

引物M2：ATTGTTCACTCCCTGTGTTTGTGTT （SEQ ID NO：2）；

引物K1：AACCAGACGCTGGAATCGCTAA（SEQ ID NO：3），

引物K2：TGTAGCAGTCTAGATGCATGA（SEQ ID NO：4）；

引物H1：CTCTAGCAACTCTGCTGAAG（SEQ ID NO：5），

引物H2：CAGTTATTCCTTGGAGGCAT（SEQ ID NO：6）；

引物P1：GATGATAAGCGGTTCAGGG（SEQ ID NO：7），

引物P2：AAGAGCTCCGGTATCTCTGTC（SEQ ID NO：8）。

進(jìn)一步的，所述引物M1和M2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物K1和K2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物H1和H2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物P1和P2其中一條引物的5’端被生物素化。

進(jìn)一步的，所述引物M1和M2、K1和K2、H1和H2、P1和P2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列，所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補(bǔ)配對(duì)。

進(jìn)一步的，所述引物M1和M2、K1和K2、H1和H2、P1和P2這4組引物對(duì)中連接的tag序列選自SEQ ID NO:9~12所示的tag序列，且該4組引物對(duì)中連接的tag序列互不相同。

一種同時(shí)檢測大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的多重?zé)晒夥治鲈噭┖?，該試劑盒中含有上述所述引物?/p>

進(jìn)一步的，上述試劑盒中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。

進(jìn)一步的，所述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列，編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一種同時(shí)檢測大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的多重?zé)晒夥治龇椒?，包括如下步驟：

1）從樣品中提取病毒DNA；

2）以提取的病毒DNA為模板，用上述任一所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3）將上步擴(kuò)增產(chǎn)物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行雜交；

4）雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析，確定其病毒的類型；

上述方法用于非疾病的診斷和治療。

進(jìn)一步的，步驟2）中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

Premix Ex Taq? Hot Start Version 7.5μL

引物混合液 2μL

DNA模板 1μL

ddH₂O 4.5μL

Total 15μL；

步驟2）中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火25s，72℃延伸15s；循環(huán)35次；72℃終延伸7min。

進(jìn)一步的，步驟3）中所述雜交的反應(yīng)體系和程序?yàn)椋?/p>

3種熒光編碼微球 20μL

鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL

擴(kuò)增產(chǎn)物 5μL

總體積 100μL；42℃反應(yīng)25min。

本發(fā)明的有益效果是：

1）本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)大鼠4株細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株進(jìn)行檢測，本發(fā)明通過特定PCR獲得目標(biāo)擴(kuò)增片段，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物、熒光編碼微球和鏈霉親和素-藻紅蛋白（SA-PE）進(jìn)行雜交，然后通過檢測儀讀取MFI值時(shí)，分辨不同株型的大鼠細(xì)小病毒。

2）本發(fā)明方法能夠同時(shí)對(duì)大鼠4株細(xì)小病毒進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，而且特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好。與傳統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行檢測，樣本用量少，操作簡單、快速，可大大降低檢測成本。本發(fā)明能保證相同的復(fù)性溫度和雜交效率，且有效避免不同檢測物標(biāo)記的微球之間交叉雜交。

附圖說明

圖1是4株大鼠細(xì)小病毒RMV、KRV、H-1和PRV-1a株的PCR電泳圖；

圖2是4株大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治龇椒z測實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖3是4株大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治龇椒z測特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖4是4株大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治龇椒z測靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖5是4株大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治龇椒ㄅR床檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

一種同時(shí)檢測大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的多重?zé)晒夥治鲆铮鲆锖塑账嵝蛄腥缦滤荆?/p>

引物M1：ACACCATGCCAACTGCAGATG（SEQ ID NO：1），

引物M2：ATTGTTCACTCCCTGTGTTTGTGTT （SEQ ID NO：2）；

引物K1：AACCAGACGCTGGAATCGCTAA（SEQ ID NO：3），

引物K2：TGTAGCAGTCTAGATGCATGA（SEQ ID NO：4）；

引物H1：CTCTAGCAACTCTGCTGAAG（SEQ ID NO：5），

引物H2：CAGTTATTCCTTGGAGGCAT（SEQ ID NO：6）；

引物P1：GATGATAAGCGGTTCAGGG（SEQ ID NO：7），

引物P2：AAGAGCTCCGGTATCTCTGTC（SEQ ID NO：8）。

優(yōu)選的，所述引物M1和M2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物K1和K2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物H1和H2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物P1和P2其中一條引物的5’端被生物素化。

優(yōu)選的，所述引物M1和M2、K1和K2、H1和H2、P1和P2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列，所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補(bǔ)配對(duì)。

優(yōu)選的，所述引物M1和M2、K1和K2、H1和H2、P1和P2這4組引物對(duì)中連接的tag序列選自SEQ ID NO:9~12所示的tag序列，且該4組引物對(duì)中連接的tag序列互不相同。

一種同時(shí)檢測大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的多重?zé)晒夥治鲈噭┖?，該試劑盒中含有上述任一所述引物?/p>

優(yōu)選的，上述試劑盒中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。

優(yōu)選的，所述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列，編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一種同時(shí)檢測大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的多重?zé)晒夥治龇椒?，包括如下步驟：

1）從樣品中提取病毒DNA；

2）以提取的病毒DNA為模板，用上述任一所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3）將上步擴(kuò)增產(chǎn)物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行雜交；

4）雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析，確定其病毒的類型；

上述方法用于非疾病的診斷和治療。

優(yōu)選的，步驟2）中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

Premix Ex Taq? Hot Start Version 7.5μL

引物混合液 2μL

DNA模板 1μL

ddH₂O 4.5μL

Total 15μL；

步驟2）中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火25s，72℃延伸15s；循環(huán)35次；72℃終延伸7min。

優(yōu)選的，步驟3）中所述雜交的反應(yīng)體系和程序?yàn)椋?/p>

3種熒光編碼微球 20μL

鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL

擴(kuò)增產(chǎn)物 5μL

總體積 100μL；42℃反應(yīng)25min。

優(yōu)選的，步驟3）中4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列，4種熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實(shí)施例1 引物設(shè)計(jì)

經(jīng)過對(duì)所設(shè)計(jì)的大量引物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物對(duì)M1和M2、K1和K2、H1和H2、P1和P2對(duì)多重?zé)晒馔瑫r(shí)檢測4株大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的效果最好，其堿基序列如下所示。

引物M1：ACACCATGCCAACTGCAGATG（SEQ ID NO：1），

引物M2：ATTGTTCACTCCCTGTGTTTGTGTT （SEQ ID NO：2）；

引物K1：AACCAGACGCTGGAATCGCTAA（SEQ ID NO：3），

引物K2：TGTAGCAGTCTAGATGCATGA（SEQ ID NO：4）；

引物H1：CTCTAGCAACTCTGCTGAAG（SEQ ID NO：5），

引物H2：CAGTTATTCCTTGGAGGCAT（SEQ ID NO：6）；

引物P1：GATGATAAGCGGTTCAGGG（SEQ ID NO：7），

引物P2：AAGAGCTCCGGTATCTCTGTC（SEQ ID NO：8）。

本發(fā)明采用多重?zé)晒夥治龅姆椒▽?duì)大鼠細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株進(jìn)行區(qū)分，故將上述引物作進(jìn)一步的修飾，以滿足相應(yīng)的操作要求。其中引物M1、K1、H1和P1的5’端連接有tag序列，所連接的tag序列分別為：

引物M1的tag序列為：TACTTCTTTACTACAATTTACAAC（SEQ ID NO：9）；

引物K1的tag序列為：ATTAAACAACTCTTAACTACACAA（SEQ ID NO：10）；

引物H1的tag序列為：CTAAACATACAAATACACATTTCA（SEQ ID NO：11）；

引物P1的tag序列為：AATAACAACTCACTATATCATAAC（SEQ ID NO：12）。

另外，引物M2、K2、H2、P2的5’端還添加有生物素標(biāo)記。

實(shí)施例 2：同時(shí)檢測4株大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治鲈噭┖?/p>

試劑盒包括以下組分：

（1）實(shí)施例1所設(shè)計(jì)的用于多重?zé)晒夥治龅囊铮?/p>

（2）4種編碼不同熒光色的包含有anti-tag序列的熒光編碼微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與多重?zé)晒夥治鲆镏械膖ag序列互補(bǔ)配對(duì)；4種微球均購自luminex公司，其中RMV、KRV、H-1和PRV-1a分別對(duì)應(yīng)的熒光編碼微球號(hào)為MTAG-A015、MTAG-A036、MTAG-A062和MTAG-077。

（3）鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物。

實(shí)施例3 同時(shí)檢測4株大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治龇椒z測方法的建立

（1）質(zhì)粒的構(gòu)建

用天根的核酸自動(dòng)抽取儀分別提取4株細(xì)小病毒RMV株、KRV株、H1株和RPV-1a株的DNA，分別引物對(duì)M1和M2、K1和K2、H1和H2、P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠純化。再用天根的試劑盒將純化后的cDNA連接至pMD-19T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆，進(jìn)行菌液PCR鑒定，將鑒定為陽性菌的菌落進(jìn)行質(zhì)粒抽提，送測序。

（2）質(zhì)粒PCR擴(kuò)增

用實(shí)施例1所述的引物分別對(duì)RMV、KRV、H-1和PRV-1a引物進(jìn)行單重、四重PCR擴(kuò)增。

上游引物混合液的制備：將M1、K1、H1和P1以摩爾比1:1:1:1比例進(jìn)行混合；下游引物混合液的制備：將M2、K2、H2和P2以摩爾比1:1:1:1比例進(jìn)行混合。分別利用4種病原RMV、KRV、H-1或PRV-1a的特異性模板，以及RMV、KRV、H-1和PRV-1a四重模板，對(duì)上述病原的特應(yīng)性區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。其中四重模板的制備：將四種質(zhì)粒以體積比1:1:1:1的比例進(jìn)行混合。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

Premix Ex Taq? Hot Start Version 7.5ul

上游引物混合液 1ul

下游引物混合液 1ul

模板 1ul

ddH₂O 4.5ul

Total 15ul。

其中上下游引物的終濃度在0.15-0.3μM之間。

擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火25s，72℃延伸15s；循環(huán)35次；72℃終延伸7min。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，其電泳圖如圖1所示。1：RMV，2：KRV，3：H-1，4：RPV-1a，5：對(duì)RMV+KRV+H-1+RPV-1a進(jìn)行的四重PCR，6：PCR blank（PCR空白對(duì)照），M：DL500 DNA marker，

（3）將所得的PCR產(chǎn)物與熒光編碼微球工作液、鏈霉親和素藻紅蛋白（SA-PE）工作液雜交，包括以下步驟：

分別包被有特異的anti-tag序列的4種微球，其中anti-tag序列能相應(yīng)地與RMV、KRV、H-1和PRV-1a四種病原引物上的tag序列互補(bǔ)配對(duì)。4種微球均購自luminex公司，具體的RMV、KRV、H-1和PRV-1a分別對(duì)應(yīng)的熒光編碼微球號(hào)為MTAG-A015、MTAG-A036、MTAG-A062和MTAG-077。

熒光編碼微球工作液的制備：將2500個(gè)/μl熒光編碼微球用1.1×Tm Hybrdization Buffer稀釋到1μl約含有125個(gè)/種熒光編碼微球。

SA-PE工作液制備：將1mg/ml SA-PE用1×Tm Hybrdization Buffer稀釋到10μg/μl。

充分重懸熒光編碼微球工作液，每個(gè)樣品孔和背景孔加入微球工作液20μl，樣品孔中加入5μl PCR產(chǎn)物，背景孔中加入5μl PCR blank產(chǎn)物，再加入75μl的SA-PE工作液，充分混勻，于金屬加熱器中42℃孵育25min。

依照檢測儀Luminex 200儀器的說明將雜交后的50μl上述反應(yīng)液進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。檢測儀Luminex 200儀器讀取MFI值時(shí)，可以明顯分辯不同類型的病原。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)（注：該判斷標(biāo)準(zhǔn)僅供參考，亦可對(duì)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整）如下：

最低檢測閾值（cutoff值）的確定：選取20只無細(xì)小病毒感染的大鼠組織樣品（每個(gè)樣品平行重復(fù)3次），分別讀取MFI值并計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。以平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的MIF值設(shè)定其為cutoff值。本發(fā)明所獲得RMV、KRV、H-1和PRV-1a cutoff值分別為531.5、234.9、405.6、433.9，因此將本發(fā)明RMV、KRV、H-1和PRV-1a 的cutoff值分別定為550、300、450、450。只有檢測樣品的MFI值高于設(shè)定的cutoff值時(shí)，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才能進(jìn)行有效分析。

待測樣本的分析判斷：1）當(dāng)待測樣本的MFI值＞cutoff值時(shí)，判斷為陽性樣本；2）待測樣本的MFI值≤cutoff值時(shí)，判斷為陰性，需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)或采取其他檢測方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

實(shí)施例4 同時(shí)檢測4株大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治鰴z測特異性實(shí)驗(yàn)

分別用大鼠細(xì)小病毒RMV、KRV、H-1和PRV-1a、小鼠巨細(xì)胞病毒MCMV、呼腸孤病毒III型Reo-3、小鼠腺病毒MAD、小鼠細(xì)小病毒MVM株MVM、多瘤病毒POLY、仙臺(tái)病毒 SV、小鼠肝炎病毒MHV作為模板進(jìn)行多重?zé)晒夥治鰴z測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，只有大鼠細(xì)小病毒RMV、KRV、H-1和PRV-1a為陽性，其他的均為陰性，說明檢測體系特異性良好。

實(shí)施例5：大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治鰴z測靈敏性實(shí)驗(yàn)

將制備的質(zhì)粒進(jìn)行定量，采用10倍稀釋法進(jìn)行稀釋，稀釋至10¹copies/μl，用上述建立的多重?zé)晒夥治龇椒ㄟM(jìn)行檢測。大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治鰴z測靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RMV、H-1和PRV-1a的靈敏度檢出限均為10²copies/ul，KRV的靈敏度檢出限為10³copies/ul。

實(shí)施例6：樣品的檢測

在外捕捉的野鼠和兩家單位提供的普通級(jí)大鼠，無菌采集其脾臟、盲腸，用天根核酸自動(dòng)抽取儀提取DNA，使用TAKARA的Premix Ex Taq? Hot Start Version進(jìn)行擴(kuò)增，以DNA作為模板，采用上述大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治鰴z測方法進(jìn)行檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光編碼微球和SA-PE雜交，在Luminex 200檢測儀上讀數(shù)。具體步驟參照實(shí)施例3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

經(jīng)本發(fā)明檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品1、2、3、4、5、7、8、9、11、13、14、15、19、20為陰性樣本；10、12、16、17、18為RMV陽性樣品；6、17為KRV陽性樣品；10、18為H-1陽性樣品；12為RPV-1a陽性樣品。通過測序分析，結(jié)果一致。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110> 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所

<120> 一種同時(shí)檢測4株大鼠細(xì)小病毒的多重?zé)晒夥治龇椒霸噭┖?/p>

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<170> PatentIn version 3.5

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