本發(fā)明涉及一種檢測技術(shù)，具體是鑒別垂穗披堿草和老芒麥的試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

垂穗披堿草(Elymus nutans Griseb)和老芒麥(Elymus sibiricus L)為禾本科小麥族披堿草屬多年生草本植物，其中垂穗披堿草為異源六倍體物種，老芒麥為異源四倍體物種。這兩種披堿草屬類植物對寒冷干旱的生態(tài)環(huán)境具有良好的適應(yīng)性和廣泛的生態(tài)可塑性，在我國西北和青藏高原地區(qū)具有廣泛的分布，并且成為該地區(qū)栽培利用最為廣泛的當(dāng)家牧草草種。由于垂穗披堿草和老芒麥生長分布環(huán)境較一致，且形態(tài)上皆為花序下垂類披堿草，在對這兩個(gè)物種野生種質(zhì)資源收集和鑒定過程中經(jīng)常發(fā)生混淆。目前，主要栽培利用的垂穗披堿草和老芒麥品種都是在搜集當(dāng)?shù)匾吧N質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，通過篩選、鑒定和選育而來的。收集這兩個(gè)物種野生種質(zhì)資源是高寒牧草育種工作中的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，而鑒定區(qū)分垂穗披堿草和老芒麥則是此基礎(chǔ)工作中首要解決的問題。

傳統(tǒng)上是通過一些形態(tài)學(xué)特征將垂穗披堿草和老芒麥進(jìn)行區(qū)分，依據(jù)《中國植物志》的檢索標(biāo)準(zhǔn)：垂穗披堿草的穗狀花序較緊密，小穗排列多少偏于穗軸一側(cè)，穎先端具尖芒。而老芒麥的穗狀花序長而疏松，小穗排列不偏于一側(cè)，穎先端具短芒。依據(jù)形態(tài)學(xué)特性區(qū)分的缺點(diǎn)：形態(tài)學(xué)特征易受生長環(huán)境的影響，如在某些高海拔地區(qū)或特殊生境中，老芒麥的穗狀花序會(huì)變得緊密，穎先端的短芒也會(huì)變?yōu)榧饷?，和垂穗披堿草的形態(tài)特征相近。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征對二者進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分比較困難。

利用細(xì)胞遺傳學(xué)方法對垂穗披堿草和老芒麥進(jìn)行區(qū)分是最為可靠的方法，垂穗披堿草是異源六倍體(2n＝6x＝42)，老芒麥?zhǔn)钱愒此谋扼w(2n＝4x＝28)，通過對其染色體條數(shù)的計(jì)數(shù)即可區(qū)分兩者。但是，依據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)區(qū)分需要獲得種子，將種子萌發(fā)生根，根尖處理壓片，顯微鏡下觀察獲得染色體信息。在野外采集材料中，由于時(shí)間等因素很難保證每次都能采集到種子，而野外采集的種子在實(shí)驗(yàn)室條件下有時(shí)很難破除休眠。此外，由于細(xì)胞學(xué)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)，普通實(shí)驗(yàn)室較難掌握。以上因素使得細(xì)胞遺傳學(xué)方法在兩者區(qū)分中很難得到推廣應(yīng)用。

DNA分子標(biāo)記手段是現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的技術(shù)，在已有的報(bào)道中研究者可以利用特定的SSR引物對，依據(jù)擴(kuò)增目的片段的大小和條數(shù)對垂穗披堿草和老芒麥進(jìn)行區(qū)分。但是，由于SSR標(biāo)記變異性高，SSR位點(diǎn)在種內(nèi)存在的變異有可能干擾對二者的準(zhǔn)確區(qū)分，還會(huì)因無法有效擴(kuò)增而出現(xiàn)假陰性的情況，準(zhǔn)確度不高，而且SSR標(biāo)記檢測時(shí)必需用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，操作步驟繁瑣費(fèi)時(shí)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的鑒別垂穗披堿草和老芒麥的試劑盒。

本發(fā)明鑒別垂穗披堿草和老芒麥的試劑盒，包含序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物對1，和/或SEQ ID NO：3～4所示的引物對2。

本發(fā)明鑒別垂穗披堿草和老芒麥的方法，包括如下步驟：

a，提取樣本DNA：提取待檢樣本中的DNA；

b，基因擴(kuò)增：用權(quán)利要求1所述的試劑盒對待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；

c，結(jié)果檢測：對DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測。

本發(fā)明還提供了SEQ ID NO：3～4所示的引物對。

本發(fā)明還提供了SEQ ID NO：1～2所示的引物對。

本發(fā)明還提供了SEQ ID NO：1～2所示的引物對和/或SEQ ID NO：3～4所示的引物對在鑒別垂穗披堿草和老芒麥中的用途。

本發(fā)明試劑盒和方法可以分別特異擴(kuò)增各個(gè)地區(qū)的垂穗披堿草和老芒麥，可以準(zhǔn)確、有效的鑒別垂穗披堿草與老芒麥，靈敏度高，可以采用瓊脂糖凝膠電泳檢測，工藝簡單，耗時(shí)短，成本低廉，應(yīng)用前景良好。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1 TNAC 1102引物對擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；

圖2 TNAC 1919引物對擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；

圖3靈敏度檢測結(jié)果，A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H分別為反應(yīng)體系中含100ng模板量的“3”材料，10ng模板量的“3”材料，100ng模板量的“9”材料，10ng模板量的“9”材料，10ng模板量的“ES 10”材料，100ng模板量的“ES 10”材料，100ng模板量的“康巴”材料，10ng模板量的“康巴”材料。

具體實(shí)施方式

一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器

實(shí)施例1本發(fā)明區(qū)分垂穗披堿草和老芒麥的方法

下述實(shí)例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

一、引物設(shè)計(jì)

區(qū)分垂穗披堿草和老芒麥的特異性引物對。

(1)TNAC1102上游引物(SEQ ID NO：1):

5’-GGAGAGGTGAAGGACCAACTC-3’

TNAC 1102下游引物(SEQ ID NO：2):

5’-CCTTGCAGCGTAGTGAGATTT-3’

(2)TNAC 1919上游引物(SEQ ID NO：3):

5’-CATTGGTTCACATGAATGAGG-3’

TNAC 1919下游引物(SEQ ID NO：4):

5’-GCCAGTGCTGATAGTATCTTCTTC-3’

二、檢測方法

1、選取垂穗披堿草和老芒麥材料各10份。

垂穗披堿草材料編號(hào)為1、3、5、9、12、13、14、59-1、30-1-2和12-8-1，其中1、3、5、9、12、13和14為美國國家植物種質(zhì)庫引進(jìn)材料；59-1、30-1-2和12-8-1為收集的不同地理居群的垂穗披堿草材料。

老芒麥材料編號(hào)為4、6、7、康巴、ES1、ES3、ES4、ES9、ES10和58-5，其中4、6和7為美國國家植物種質(zhì)庫引進(jìn)材料；康巴、ES1、ES3、ES4、ES9、ES10和58-5為收集的不同地理居群的老芒麥材料。

2、使用CTAB法提取上述20份材料總DNA。

(1)取材料,加液氮研磨成粉末狀,迅速移入1.5ml EP管中；

(2)加入800μl的CTAB提取緩沖液,混勻(CTAB在65℃水浴預(yù)熱),每5min輕輕震蕩幾次,20min后12000r/min,離心15min；

(3)小心吸取上清液,加入等體積的酚：氯仿(各400μl)溶液,混勻,4℃,12000r/min,離心10min；

(4)小心吸取上清液,加入等體積的氯仿,混勻,4℃,12000r/min,離心10min；

(5)重復(fù)步驟(4)1-2次,以蛋白層不出現(xiàn)為止；

(6)取上清,-20℃沉淀1h,4℃,12000r/min,離心10min；

(7)棄去上清液,用70％乙醇洗滌沉淀2次；

(8)室溫下干燥后(一般干燥5-15min),溶于30-50μl DEPC去離子水中,于-20℃或者-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

3、利用TNAC 1102和TNAC 1919引物對分別對上述20份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 100ng，dNTP 0.25mmol/L，10×buffer，2.5μL，Taq DNA聚合酶0.5U，上游引物和下游引物濃度均為10pmol，加雙蒸水至25μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析

分別取擴(kuò)增產(chǎn)物3ul和1μl Loading buffer，將混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，凝膠經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察照相。

三、檢測結(jié)果

編號(hào)為1、3、5、9、12、13、14、59-1、30-1-2和12-8-1的垂穗披堿草材料分別在TNAC 1102和TNAC 1919引物對擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段區(qū)域(TNAC1102和TNAC 1919引物對擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段區(qū)域分別為900-1500bp和700-1000bp)內(nèi)出現(xiàn)兩條明顯條帶，判定為垂穗披堿草。

編號(hào)為4、6、7、康巴、ES1、ES3、ES4、ES9、ES10和58-5的老芒麥材料分別在TNAC 1102和TNAC 1919引物對擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段區(qū)域(TNAC1102和TNAC 1919引物對擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段區(qū)域分別為900-1500bp和700-1000bp)內(nèi)僅出現(xiàn)一條明顯條帶，判定為老芒麥(圖1,2)。

可以看出，本發(fā)明引物可以有效擴(kuò)增來源不同的垂穗披堿草和老芒麥，其中，所有來源的垂穗披堿草均有兩條擴(kuò)增條帶，所有來源的老芒麥均只有一條帶。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明檢測試劑盒可以有效擴(kuò)增垂穗披堿草和老芒麥，同時(shí)擴(kuò)增結(jié)果有明顯區(qū)別，說明本發(fā)明檢測試劑盒和方法可以有效鑒別垂穗披堿草和老芒麥，準(zhǔn)確度高。

實(shí)施例2靈敏度試驗(yàn)

一、試驗(yàn)方法

1、PCR引物

取實(shí)施例1中的引物對1(TNAC 1102引物對)。

2、材料

實(shí)施例1中材料3、9、ES10與康巴。

3、模版制備和PCR擴(kuò)增、檢測

CTAB法(同實(shí)施例1)提取上述4份材料總DNA，將DNA稀釋至100ng/ul和10ng/ul，利用TNAC 1102引物對對上述4份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增方法和檢測方法同實(shí)施例1。

二、結(jié)果

結(jié)果如圖3所示，模板量10ng/ul與模板量100ng/ul的擴(kuò)增結(jié)果一致。3、9材料目的片段(TNAC 1102引物對擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段區(qū)域?yàn)?00-1500bp)區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)兩條明顯條帶，判定為垂穗披堿草；10、康巴材料目的片段區(qū)域(TNAC 1102引物對擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段區(qū)域?yàn)?00-1500bp)內(nèi)出現(xiàn)一條明顯條帶，判定為老芒麥。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，采用本發(fā)明引物擴(kuò)增，在模板量低至10ng/ul的情況下，仍然可以有效檢測，靈敏度高。

綜上，本發(fā)明提供的試劑盒和方法可以分別特異擴(kuò)增各個(gè)地區(qū)的垂穗披堿草和老芒麥，可以準(zhǔn)確、有效的鑒別垂穗披堿草與老芒麥，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，耗時(shí)短，靈敏度高，應(yīng)用前景良好。