本發(fā)明涉及一種檢測細(xì)胞內(nèi)γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶的熒光染料，具體涉及基于四苯乙烯的新型γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶類熒光探針的制備方法及應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT；EC 2.3.2.2)廣泛分布于人體各種組織細(xì)胞中，在某些組織的含量尤為豐富，比如腎小管細(xì)胞、肝臟細(xì)胞和腦毛細(xì)血管細(xì)胞中。在血細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中也達(dá)到了檢測含量。人體血清中的γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶主要來自肝臟，血清中的γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶含量可以作為肝臟疾病的診斷參數(shù)。越來越多的研究也表明γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶在某些癌細(xì)胞中是過量表達(dá)的，如宮頸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中，因此，γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶的含量也作為癌癥診斷的一項重要的參數(shù)。目前報道的γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶探針大多數(shù)是基于谷氨酸或者谷胱甘肽作為反應(yīng)基團(tuán)。當(dāng)谷氨酸或者谷胱甘肽被水解后，熒光探針的性質(zhì)會發(fā)生改變。1996年，White等人報道了一類基于香豆素的熒光探針，7位上的氨基被修飾以后熒光淬滅，酶切作用以后，重新生成氨基，熒光得到釋放。2014年，Hou等人利用萘酰亞胺熒光基團(tuán)設(shè)計了機理類似的探針，與香豆素相同，萘酰亞胺也是ICT類的探針，4位上的氨基被修飾后熒光淬滅，與γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)后，谷氨酸與萘酰亞胺之間的酰胺鍵斷裂，熒光得到恢復(fù)?；谒谋揭蚁╊惾玖细邿晒饬孔赢a(chǎn)率、低細(xì)胞毒性、低淬滅性等優(yōu)點，特別是具有聚集發(fā)光的獨特?zé)晒馓匦?，我們設(shè)計并合成了一種以四苯乙烯為母核的γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶類熒光探針，這類探針能夠成功用于γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶的活性檢測。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種新型γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶類熒光探針及其制備方法與其快速、靈敏地檢測谷氨酸轉(zhuǎn)移酶活性的用途。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶熒光探針，

其中R₁為H、R₂和R₃同R₁，且R₁、R₂和R₃不同時為H。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶探針為下列之一：

更優(yōu)選(Ⅰ-1)和(Ⅰ-2)。

本發(fā)明還提供一種所述γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶熒光探針的制備方法，所述方法為：將N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯溶于二氯甲烷中，依次加入1-羥基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、三乙胺和式(II)所示化合物，室溫下反應(yīng)12小時，將反應(yīng)液分離純化，獲得所述式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶熒光探針；

式(II)中R₁為H、-CH₂NH₂或-NH₂，R₂和R₃同R₁，且R₁、R₂和R₃不同時為H。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述式(II)所示化合物為下列之一：

進(jìn)一步，式(II)所示化合物與N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物質(zhì)的量之比均為0.25-0.3:1，優(yōu)選0.25:1，所述二氯甲烷體積用量以式(II)所示化合物物質(zhì)的量計為35-40mL/mmol，優(yōu)選35mL/mmol；所述1-羥基苯并三唑與N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物質(zhì)的量之比為0.6:1，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物質(zhì)的量之比均為0.6:1，三乙胺與N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯物質(zhì)的量之比均為1:1。

進(jìn)一步，所述反應(yīng)液分離純化方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液減壓濃縮至無液體流出，獲得濃縮液，將濃縮液以體積比15:1的二氯甲烷和甲醇混合液為展開劑進(jìn)行薄層層析分離，收集Rf值為0.5的目標(biāo)產(chǎn)物；再將目標(biāo)產(chǎn)物加入無水二氯甲烷a中，靜置澄清后加入三氟乙酸，室溫攪拌反應(yīng)4h，反應(yīng)過程TLC檢測式(II)所示化合物的含量，茚三酮顯色進(jìn)行追蹤，完全反應(yīng)后，旋蒸除盡溶劑和三氟乙酸至無液體流出，加無水二氯甲烷b重復(fù)旋蒸幾次，隨后加入甲醇溶解，滴入乙醚中，析出固體，過濾，濾餅烘干，獲得式(Ⅰ)所示γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶熒光探針；所述無水二氯甲烷a體積用量以目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量計為0.16ml/mg，所述三氟乙酸體積用量以目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量計為0.08ml/mg。

本發(fā)明還提供一種所述γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶熒光探針在檢測γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用，所述γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶為0～1000U/Lγ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶緩沖溶液。所述的γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶的熒光檢測的方法為：以化合物(I)作為熒光探針，與含γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶的PBS緩沖溶液中的γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行反應(yīng)，生成熒光物質(zhì)(II-1)或(II-2)，測定在激發(fā)波為360nm下的熒光強度變化，從而實現(xiàn)對γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶的檢測。

本發(fā)明熒光探針的結(jié)構(gòu)中以苯環(huán)上氨基與酰胺之間的轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)推-拉電子能力的變化，從而達(dá)到吸收光譜以及發(fā)射波譜藍(lán)移的效果。

本發(fā)明所述二氯甲烷a和二氯甲烷b均為二氯甲烷，為了便于表述不同步驟用量不同而命名，字母本身沒有含義。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明選用的四苯乙烯結(jié)構(gòu)是個聚集誘導(dǎo)發(fā)光型的熒光團(tuán)，具有良好的光譜穩(wěn)定性以及高熒光量子產(chǎn)率，同時在聚集狀態(tài)下不會引發(fā)熒光淬滅效應(yīng)。更為重要的是是本申請所合成的探針結(jié)構(gòu)更為簡單，化學(xué)性質(zhì)更為穩(wěn)定，制備更為方便，與其它結(jié)構(gòu)相似的探針相比，優(yōu)選探針對γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶具有極高的選擇性，為研究細(xì)胞中γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶的生理作用提供一種有效的研究工具。

(四)附圖說明

圖1為本發(fā)明中探針(I-1)的核磁氫譜。

圖2為本發(fā)明中探針(I-2)的核磁氫譜。

圖3為本發(fā)明中探針(I-1)的核磁碳譜。

圖4為本發(fā)明中探針(I-2)的核磁碳譜。

圖5為本發(fā)明中探針(I)在pH為7.4最佳激發(fā)與發(fā)射波長的測定光譜，a代表探針(I-1)，b代表探針(I-2)，虛線表示最佳激發(fā)波長，實線表示最佳發(fā)射波長。

圖6為本發(fā)明中探針(I)在不同溶劑中的熒光光譜，a代表探針(I-1)，b代表探針(I-2)。

圖7為本發(fā)明中探針(I)在不同比例的二氯甲烷和乙醇混合溶液中的熒光光譜，a代表探針(I-1)，b代表探針(I-2)。

圖8為本發(fā)明中探針(I-1-7)在pH為7.4的條件下加入500U/Lγ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶后熒光光譜的變化。

圖9為本發(fā)明中探針(I)在pH為7.4的條件下加入500U/Lγ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶后熒光光譜的變化，a代表探針(I-1)，b代表探針(I-2)。

圖10為本發(fā)明中探針(I)在pH為7.4的條件下與不同酶作用的熒光光譜變化，a代表探針(I-1)，b代表探針(I-2)，c代表探針(I-1)與探針(I-2)分別與失活酶以及加入抑制劑體系的作用結(jié)果。

圖11為本發(fā)明中探針(I)制備流程圖。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

本發(fā)明所述室溫是指25℃。

實施例1探針(I-1，I-2和I-5)的合成

(1)探針(I-1)

將N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羥基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室溫反應(yīng)1h后，加入化合物(II-1)(27.3mg，0.07mmol)，室溫反應(yīng)過夜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮溶劑至無液體流出，濃縮液用薄層層析硅膠板(展開劑：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值為0.5的化合物(III-1)53mg，產(chǎn)率為80.3％。將化合物(III-1)(50mg，0.075mmol)加入到裝有8mL無水二氯甲烷的圓底燒瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室溫攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)過程TLC檢測式(II-1)所示化合物的含量，茚三酮顯色進(jìn)行追蹤，完全反應(yīng)后旋蒸除盡溶劑和三氟乙酸，加二氯甲烷重復(fù)旋蒸幾次，盡量將TFA抽干。隨后加入2ml甲醇溶解剩余固體，將溶液滴入20ml乙醚中，有白色固體析出。過濾得白色固體，烘干，得淡黃色固體16mg，即化合物(I-1)，產(chǎn)率48.2％。核磁氫譜見圖1，核磁碳譜見圖3。

化合物(III-1)

化合物(I-1)：

1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.87–7.70(m,5H),7.63–7.45(m,6H),7.44–7.17(m,7H),4.38(qt,J＝8.7,4.0Hz,2H),3.00–2.84(m,4H),2.50(dddd,J＝19.7,15.1,12.3,7.4Hz,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ171.05,169.98,144.70,143.84,143.71,140.13,138.62,137.58,137.56,131.40,131.03,128.08,127.98,126.68,125.79,119.01,118.76,116.71,114.41,112.11,54.97,51.75,31.78,25.83.

(2)探針(I-2)

將步驟(1)中化合物(II-1)改為化合物(II-2)(27.3mg，0.07mmol)，其它操作同步驟(1)，獲得探針(I-2)16mg，產(chǎn)率48.2％。核磁氫譜見圖2，核磁碳譜見圖4。

化合物(III-2)

化合物(I-2)：

1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.45–7.23(m,7H),7.08(tdd,J＝9.6,7.4,5.8Hz,6H),7.00–6.92(m,3H),6.87(dd,J＝16.8,8.5Hz,2H),3.95(dtt,J＝19.2,5.9,3.8Hz,2H),2.55–2.43(m,4H),2.08(ddp,J＝28.1,21.0,7.1Hz,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ171.23,159.36,158.43,140.40,131.61,131.25,128.82,128.64,128.53,128.25,126.83,119.02,118.97,116.68,114.39,112.10,54.57,51.99,31.94,25.96.

(3)探針(I-5)

將步驟(1)中化合物N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯改為化合物N-叔丁氧羰基-D-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)，其它操作同步驟(1)，獲得探針(I-5)168mg，產(chǎn)率50％。

¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.42–7.37(m,4H),7.35(dd,J＝8.0,6.7Hz,4H),7.28(ddt,J＝11.5,7.4,2.2Hz,6H),7.14–7.09(m,4H),3.41(t,J＝7.0Hz,1H),3.17–3.10(m,1H),3.07(dd,J＝12.6,3.1Hz,1H),2.80(s,2H),2.78–2.71(m,2H),2.68–2.62(m,1H),2.62–2.55(m,1H),2.49(tdd,J＝12.8,7.0,2.4Hz,1H),2.37(ddt,J＝12.6,6.9,2.9Hz,1H),2.14–2.06(m,1H),1.83(s,2H).

化合物(III-5)。

實施例2探針(I-3和I-4)的合成

(1)探針(I-3)

將N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羥基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室溫反應(yīng)1h后，加入化合物(II-3)(27.3mg，0.07mmol)，室溫反應(yīng)過夜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮溶劑至無液體流出，濃縮液用薄層層析硅膠板(展開劑：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值為0.5的化合物(III-3)43mg，產(chǎn)率為76.8％。將化合物(III-3)(80mg，0.1mmol)加入到裝有8mL無水二氯甲烷的圓底燒瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室溫攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)過程TLC檢測式(II-3)所示化合物的含量，茚三酮顯色進(jìn)行追蹤，完全反應(yīng)后旋蒸除盡溶劑和三氟乙酸，加二氯甲烷重復(fù)旋蒸幾次，盡量將TFA抽干。隨后加入2ml甲醇溶解剩余固體，將溶液滴入20ml乙醚中，有白色固體析出。過濾得白色固體，烘干，得淡黃色固體46mg，即化合物(I-3)，產(chǎn)率80％。

化合物(III-3)

¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.50(s,1H),7.41–7.37(m,2H),7.35–7.27(m,8H),7.25(d,J＝4.7Hz,6H),7.11–7.05(m,2H),4.99–4.88(m,1H),4.32–4.20(m,1H),3.24(t,J＝7.0Hz,1H),2.81(td,J＝12.4,4.1Hz,1H),2.68–2.56(m,1H),2.51(ddd,J＝12.3,4.8,2.0Hz,1H),2.30(d,J＝1.5Hz,3H),2.15(tdd,J＝12.3,7.1,4.9Hz,1H),0.75(s,2H).

(2)探針(I-4)

將步驟(1)中化合物N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯改為化合物N-叔丁氧羰基-D-谷氨酸-1-叔丁酯(84.8mg，0.28mmol)，其它操作同步驟(1)，獲得探針(I-4)46mg，產(chǎn)率80％。

¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.50(s,1H),7.41–7.37(m,2H),7.35–7.27(m,8H),7.25(d,J＝4.7Hz,6H),7.11–7.05(m,2H),4.99–4.88(m,1H),4.32–4.20(m,1H),3.24(t,J＝7.0Hz,1H),2.81(td,J＝12.4,4.1Hz,1H),2.68–2.56(m,1H),2.51(ddd,J＝12.3,4.8,2.0Hz,1H),2.30(d,J＝1.5Hz,3H),2.15(tdd,J＝12.3,7.1,4.9Hz,1H),0.75(s,2H).

化合物(III-4)。

實施例4探針(I-6)的合成

將N-叔丁氧羰基-D-谷氨酸-1-叔丁酯(119.2mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羥基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室溫反應(yīng)1h后，加入化合物(II-1)(27.3mg，0.07mmol)，室溫反應(yīng)過夜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮溶劑至無液體流出，濃縮液用薄層層析硅膠板(展開劑：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值為0.5的化合物(III-6)73mg，產(chǎn)率為85.4％。將化合物(III-6)(70mg，0.075mmol)加入到裝有8mL無水二氯甲烷的圓底燒瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室溫攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)過程TLC檢測式(II-1)所示化合物的含量，茚三酮顯色進(jìn)行追蹤，完全反應(yīng)后旋蒸除盡溶劑和三氟乙酸，加二氯甲烷重復(fù)旋蒸幾次，盡量將TFA抽干。隨后加入2ml甲醇溶解剩余固體，將溶液滴入20ml乙醚中，有白色固體析出。過濾得白色固體，烘干，得淡黃色固體40.2mg，即化合物(I-6)，產(chǎn)率87％。

化合物(III-6)

1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.87–7.70(m,5H),7.63–7.45(m,6H),7.44–7.17(m,7H),4.38(qt,J＝8.7,4.0Hz,2H),3.00–2.84(m,4H),2.50(dddd,J＝19.7,15.1,12.3,7.4Hz,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ171.05,169.98,144.70,143.84,143.71,140.13,138.62,137.58,137.56,131.40,131.03,128.08,127.98,126.68,125.79,119.01,118.76,116.71,114.41,112.11,54.97,51.75,31.78,25.83.

實施例4探針(I-7)的合成

將N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯(119.2mg，0.28mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入1-羥基苯并三唑(22.6mg，0.168mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(32mg，0.168mmol)、三乙胺(39μL，0.28mmol)，室溫反應(yīng)1h后，加入化合物(II-4)(27.3mg，0.07mmol)，室溫反應(yīng)過夜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮溶劑至無液體流出，濃縮液用薄層層析硅膠板(展開劑：二氯甲烷：甲醇＝15：1，v/v)，收集Rf值為0.5的化合物(III-7)73mg，產(chǎn)率為85.4％。將化合物(III-7)(40mg，0.04mmol)加入到裝有8mL無水二氯甲烷的圓底燒瓶中，待混合液澄清后加入三氟乙酸(4mL)，室溫攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)過程TLC檢測式(II-4)所示化合物的含量，茚三酮顯色進(jìn)行追蹤，完全反應(yīng)后旋蒸除盡溶劑和三氟乙酸，加二氯甲烷重復(fù)旋蒸幾次，盡量將TFA抽干。隨后加入2ml甲醇溶解剩余固體，將溶液滴入20ml乙醚中，有白色固體析出。過濾得白色固體，烘干，得淡黃色固體18mg，即化合物(I-7)，產(chǎn)率54％。

化合物(III-7)

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ7.50(s,2H),7.41–7.32(m,8H),7.29(td,J＝7.2,6.8,1.9Hz,4H),7.25–7.13(m,6H),5.12–5.02(m,1H),4.76(dd,J＝12.4,1.3Hz,1H),4.32–4.25(m,1H),4.23–4.16(m,1H),3.50(t,J＝7.0Hz,1H),3.43(t,J＝7.1Hz,1H),3.39–3.28(m,3H),2.86–2.78(m,1H),2.63–2.51(m,2H),2.47–2.41(m,1H),2.33(s,2H),1.96–1.88(m,1H),1.56–1.42(m,1H).

實施例5探針(I)在pH為7.4條件下最佳激發(fā)與發(fā)射波長的測定

準(zhǔn)確稱取0.2g實施例1制備的探針(I-1)和(I-2)，分別用二甲基亞砜配制成濃度為1mM的探針母液，用移液槍各吸取6μL加入到294μL磷酸緩沖液(10mM、pH＝7.4)，測定兩個混合液的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，結(jié)果見圖5。

根據(jù)圖5的結(jié)果可知探針(I-1)和(I-2)的最佳激發(fā)與發(fā)射波長均是360nm/460nm。從結(jié)果可推斷出化合物(II-1)，(II-2)在與氨基酸發(fā)生反應(yīng)以后會出現(xiàn)50nm的藍(lán)移。

實施例6探針(I)在不同溶劑中的熒光性質(zhì)

準(zhǔn)確稱取0.2g實施例1制備的探針(I-1)和(I-2)，分別用二甲基亞砜配制成濃度為1mM的探針母液，用移液槍各吸取4μL分別加入到294μL的甲醇、二氯甲烷、四氫呋喃、乙腈、丙酮、乙醇和水中，用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光掃描，λex＝360nm熒光譜圖見圖6。

探針(I-1)和(I-2)在二氯甲烷中的熒光強度最高，在四氫呋喃和丙酮中也較強，而在水中強度比在上述非極性溶劑中低很多，說明這些探針的水溶性較好，適合用于生物檢測。

實施例7探針(I)聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的測定

準(zhǔn)確稱取0.2g實施例1制備的探針(I-1)和(I-2)，用二甲基亞砜配制成濃度為1mM的探針母液，用移液槍各吸取6μL加入到294μL不同濃度的二氯甲烷和乙醇混合溶液中(混合溶液中二氯甲烷體積濃度分別為0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，100％)，并測定其在360nm激發(fā)下的熒光值。熒光強度曲線見圖7。

探針(I)在二氯甲烷含量在0-80％變化時，熒光強度基本保持不變，而從80-100％變化時，熒光強度急劇增加。該現(xiàn)象符合聚集誘導(dǎo)發(fā)光原理，說明該類探針具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)。

實施例8探針(I-1～I(xiàn)-7)在pH為7.4條件下加入500U/Lγ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶后熒光光譜的變化

為篩選得到可檢測γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶的最佳探針，在微量離心管中分別加入適量的PBS緩沖液(pH＝7.4)，隨后加入γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶酶液(500U/L)，最后分別加入探針I(yè)-1～I(xiàn)-7(20μM)，37℃反應(yīng)1h后用熒光酶標(biāo)儀在λex＝360nm下進(jìn)行全波段掃描，熒光譜圖見圖8。

從圖8檢測結(jié)果可得出，在所有7個探針中，I-1和I-2對γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶有優(yōu)異的響應(yīng)值，而其它5個探針對該酶沒有響應(yīng)，證明了這兩個探針具有極高的專一性。

實施例9探針(I)在pH為7.4條件下加入500U/Lγ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶后熒光光譜的變化

準(zhǔn)確稱取0.2g實施例1制備的探針(I-1)和(I-2)，分別用二甲基亞砜配制成濃度為1mM的探針母液，用移液槍各吸取6μL加入到284μL磷酸緩沖液(10mM pH＝7.4)，分別加入γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶至終濃度為500U/L，37℃下反應(yīng)，在不同時間點(分別為0、2、5、10、20、30、40、50、60、70min)測定其熒光值。激發(fā)波長為350nm，熒光譜圖見圖9。

從圖9檢測結(jié)果得出當(dāng)γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶加入以后，在460nm出會迅速出現(xiàn)一個增強峰，這是γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶與探針的非特異性結(jié)合，而隨著γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶催化水解反應(yīng)的進(jìn)行，在460nm處的峰下降，510nm出的熒光強度越來越高。反應(yīng)進(jìn)行至60min時，反應(yīng)基本完全，70min時熒光增強不明顯。

實施例10探針(I)在pH為7.4條件下的選擇性實驗

準(zhǔn)確稱取0.2g實施例1制備的探針(I-1)和(I-2)，分別用二甲基亞砜配制成濃度為1mM的探針母液，用移液槍各吸取6μL加入到284μL磷酸緩沖液(10mM pH＝7.4)，分別加入熱失活處理的γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸失活處理的γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶以及胃蛋白酶、α-蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、BSA至終濃度均為500U/L。37℃下反應(yīng)1小時，測定其熒光值，以不加蛋白為對照。激發(fā)波長為360nm，熒光譜圖見圖10。

實驗證明，探針(I)的抗干擾能力十分好，即對γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶的專一性比較好。