本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，更具體的說是涉及一種A群C群腦膜炎球菌多糖的純化方法。

背景技術：

流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦，下同)是一種由奈瑟氏腦膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道傳染病。一百多年來，一直在世界各地流行或散在發(fā)生，感染病原菌后可引起敗血癥、腦膜炎。易感人群主要為兒童，以暴發(fā)型病死率最高，可達40%～60%。當今世界各大洲發(fā)病率在1/10萬～10/10萬，總病死率在5%～15%，高達20%的腦膜炎患者會有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括智力受損和耳聾等。根據(jù)莢膜多糖型別進行血清學分類可分13個血清型，其中A群、B群、C群約占流行菌群的90%。A群腦膜炎球菌是較大流行的主要致病血清群，特別是在所謂的非洲“流腦流行帶”，每隔7-14年就會出現(xiàn)一次較大流行。

我國于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾發(fā)生過5次全國性流腦流行；其中以1967年春季流行最為嚴重，發(fā)病率高達403/10萬，病死率為5.49%。我國過去90%以上的病例是A群病菌致病，現(xiàn)在B群或C群病菌有時亦引起流腦暴發(fā)。2003年開始，C群流腦的發(fā)病率明顯上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有進一步增高的趨勢。因此，目前我國預防流腦工作的重點是以預防A 群和C 群為主。

莢膜多糖是大分子物質，分離純化比單糖或小分子寡糖復雜。在莢膜多糖的分離純化中，需去除核酸、蛋白質、內(nèi)毒素等雜質。目前國內(nèi)上市的A群C群腦膜炎球菌莢膜多糖的純化主要采用苯酚抽提，因此苯酚抽提成為了生產(chǎn)規(guī)模純化莢膜多糖的主要方法。但是苯酚抽提法，需要使用大量的苯酚，對人體和環(huán)境的危害很大，而且最終的多糖制品中含有少量的苯酚殘留物。

苯酚對皮膚、粘膜有強烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能。吸入高濃度苯酚氣體可致頭痛、頭暈、視物模糊，肺水腫。皮膚接觸可致灼傷，可經(jīng)灼傷皮膚吸收經(jīng)一定潛伏期后引起急性腎功能衰竭。同時，苯酚對環(huán)境有嚴重危害，對水體和大氣可造成污染。隨著社會的進步，人們對安全和環(huán)保的標準也不斷提高，因此要求以更安全有效的方法純化細菌的莢膜多糖。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種更安全有效的A群C群腦膜炎球菌多糖的純化方法，該方法采用層析法對莢膜多糖進行純化，有效的避免了傳統(tǒng)的采用苯酚抽提的方式純化細菌的莢膜多糖，即避免純化過程對苯酚的使用，防止了莢膜多糖純化過程中苯酚對環(huán)境的損害。

為解決上述的技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種A群C群腦膜炎球菌多糖的純化方法，包括以下步驟：將粗制多糖溶解于緩沖液A中，粗制多糖的溶解濃度為5～10mg/ml，溶解后的粗制多糖經(jīng)澄清過濾后，上樣于用緩沖液預先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上樣于以緩沖液B預先平衡好的Capto Adhere層析柱，以緩沖液B作為流動相進行洗脫，收集含有多糖的目標峰，再將收集的多糖溶液以注射用水為超濾液，用超濾膜包進行脫鹽，脫鹽后的溶液即為A群C群腦膜炎球菌多糖溶液，其中緩沖液A為20mM Tris-HCl，0.5%脫氧膽酸鈉，pH 8.0；緩沖液B為20mM Tris-HCl，pH 8.0。

粗制多糖的溶解濃度為5～10mg/ml。

粗制多糖的溶解濃度為6～8mg/ml。

超濾膜包的截留分子量為300KD。

溶解后的粗制多糖需經(jīng)0.45μm濾膜進行澄清過濾。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明創(chuàng)造性的采用了層析法，避免了傳統(tǒng)純化方法中對苯酚的大量使用，在保證了純化質量的基礎上，有效的避免了苯酚對環(huán)境的破壞，且多糖回收率與傳統(tǒng)苯酚抽提法相近，操作簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。本發(fā)明的實施方式包括但不限于下列實施例。

實施例1

A群腦膜炎球菌多糖的純化

將A群腦膜炎球菌粗糖溶解于緩沖液（20mM Tris-HCl，0.5%脫氧膽酸鈉，pH 8.0）中，溶解濃度為5-10mg/ml。溶解后的樣品經(jīng)0.45μm濾膜澄清過濾后，上樣于用緩沖液（20mM Tris-HCl，0.5%脫氧膽酸鈉，pH 8.0）預先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上樣于以緩沖液（20mM Tris-HCl，pH 8.0）預先平衡好的Capto Adhere層析柱，以20mM Tris-HCl，pH 8.0緩沖液作為流動相進行洗脫，收集含有多糖的目標峰。然后將收集的多糖溶液以注射用水為超濾液，用截留分子量為300KD的超濾膜包進行脫鹽。脫鹽后的溶液即為A群C群腦膜炎球菌多糖溶液，取樣檢測質量指標。由下表可見，制得的三批C群多糖的各項質量指標均符合藥典要求。

實施例2

C群腦膜炎球菌多糖制備

將C群腦膜炎球菌粗糖溶解于緩沖液（20mM Tris-HCl，0.5%脫氧膽酸鈉，pH 8.0）中，溶解濃度為6-8mg/ml。溶解后的樣品經(jīng)0.45μm濾膜澄清過濾后，上樣于用緩沖液（20mM Tris-HCl，0.5%脫氧膽酸鈉，pH 8.0）預先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上樣于以緩沖液（20mM Tris-HCl，pH 8.0）預先平衡好的Capto Adhere層析柱，以20mM Tris-HCl，pH 8.0緩沖液作為流動相進行洗脫，收集含有多糖的目標峰。然后將收集的多糖溶液以注射用水為超濾液，用截留分子量為300KD的超濾膜包進行脫鹽。脫鹽后的溶液即為A群C群腦膜炎球菌多糖溶液，取樣檢測質量指標。由下表可見，制得的三批C群多糖的各項質量指標均符合藥典要求。

按照上述的實施例，即可很好的完成本發(fā)明。

如上所述即為本發(fā)明的實施例。本發(fā)明不局限于上述實施方式，任何人應該得知在本發(fā)明的啟示下做出的結構變化，凡是與本發(fā)明具有相同或相近的技術方案，均落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。