本發(fā)明涉及兩親性藥物及其制備領(lǐng)域，具體涉及一種銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物和作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

8-羥基喹啉，其分子式為C₉H₇NO，分子量為145.16，CAS.NO:148-24-3，結(jié)構(gòu)式如下：

被廣泛用于金屬的測(cè)定和分離，與許多離子(如Cu²⁺；Zn²⁺；Ca²⁺；Fe³⁺等)均有絡(luò)合作用。同時(shí)它也是鹵化喹啉類抗阿米巴藥物的中間體，包括喹碘仿、氯碘喹啉、雙碘喹啉等，這類藥物通過(guò)抑制腸內(nèi)共生菌而發(fā)揮抗阿米巴作用，對(duì)阿米巴痢疾有效。Saverio Tardito等人(S.Tardito,A.Barilli,I.Bassanetti,M.Tegoni,O.Bussolati,R.Franchi-Gazzola,C.Mucchino,L.Marchio,J Med Chem 2012,55,10448.)的研究中得出，在與銅離子絡(luò)合后，8-羥基喹啉強(qiáng)烈地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其抑瘤的機(jī)制為不依賴于caspase活性的細(xì)胞死亡。許多臨床使用的藥物(如阿霉素、順鉑等)都是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞caspase依賴性的凋亡從而產(chǎn)生抑瘤效果，而某些細(xì)胞株會(huì)積累含有抑制細(xì)胞凋亡途徑的突變從而獲得抗藥性，利用8-羥基喹啉銅作用于此類抗藥性細(xì)胞系，可以提高對(duì)抗藥性腫瘤的治療效果。同時(shí)，腫瘤組織中的銅元素含量較正常組織中更高，且銅元素在腫瘤中的富集與腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)性。因此，利用腫瘤內(nèi)銅元素進(jìn)行腫瘤的治療也具有發(fā)展?jié)摿?。但是?-羥基喹啉本身代謝速度非?？?，其與銅的絡(luò)合物的毒性很大，怎樣高效將其輸送到腫瘤部位是其作為抗腫瘤藥物的關(guān)鍵。

納米藥物具有廣闊的應(yīng)用前景，其可以通過(guò)腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(即EPR效應(yīng))選擇性地在癌癥組織富集，達(dá)到有效殺死癌細(xì)胞而減少傷害正常組織的效果。目前，常用的制備納米藥物的方式包括通過(guò)脂質(zhì)體、納米膠束等對(duì)藥物進(jìn)行包埋以及通過(guò)鍵合物連接藥物。同時(shí)利用兩種方式來(lái)制備納米藥物可以給輸送多種藥物提供更簡(jiǎn)便的選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物及其制備方法。

本發(fā)明提供了一種銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物在抗腫瘤中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種可自組裝形成膠束的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物在包埋阿霉素后(PEG-PHQMA/DOX)對(duì)抗藥性腫瘤的治療。

本發(fā)明利用銅離子催化斷裂的化學(xué)鍵連接8-羥基喹啉和可聚合雙鍵，與親水基團(tuán)通過(guò)可控自由基聚合得到兩親性聚合物(PEG-PHQMA)。該聚合物形成的膠束在游離銅離子的催化作用下可以快速釋放出8-羥基喹啉銅絡(luò)合物，同時(shí)造成膠束的破裂，釋放出包埋的阿霉素，同時(shí)發(fā)揮抗癌活性。

一種銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物，是由含有8-羥基喹啉的可聚合單體與含親水基團(tuán)的大分子引發(fā)劑通過(guò)聚合而成的。

作為優(yōu)選，所述8-羥基喹啉上8位的羥基通過(guò)可斷裂化學(xué)鍵碳酸酯鍵與甲基丙烯酸羥乙酯的羥基連接而成。

作為優(yōu)選，所述的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物為如下式Ⅰ所示結(jié)構(gòu)的化合物：

式(I)中，所述的聚乙二醇的鏈段的分子量為2000-10000；n＝10-300。

一種銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物，所述兩親性聚合物結(jié)構(gòu)如下：

上式中，R₁為C10～18的長(zhǎng)鏈烷烴；所述的聚乙二醇的鏈段的分子量為2000-10000，優(yōu)選為2000-5000；n＝10-300。

作為優(yōu)選，R₁為-C₁₂H₂₅。作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述R₁為C12直鏈烷烴。

一種銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物的制備方法，包括：

(a)利用三光氣和甲基丙烯酸羥乙酯合成氯甲酸酯為端基的甲基丙烯酸羥乙酯；

(b)步驟(a)合成的產(chǎn)物與8-羥基喹啉反應(yīng)，合成含8-羥基喹啉的可聚合單體；

(c)R₁SH與二硫化碳和2-溴代異丁酸反應(yīng)得到含長(zhǎng)鏈硫醇的鏈轉(zhuǎn)移劑；

(d)步驟(c)中合成的含長(zhǎng)鏈硫醇的鏈轉(zhuǎn)移劑和聚乙二醇單甲醚反應(yīng)得到大分子鏈轉(zhuǎn)移劑；

(e)步驟(d)合成的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑與步驟(b)中的含8-羥基喹啉的可聚合單體聚合得到所述的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物。

作為優(yōu)選，以制備R₁為-C₁₂H₂₅的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物為例，制備方法具體為：

(1)將甲基丙烯酸羥乙酯和三光氣在三乙胺的催化作用下，室溫?cái)嚢?～5小時(shí)，經(jīng)萃取、洗滌，制得式a所示結(jié)構(gòu)的以氯甲酸酯為端基的甲基丙烯酸羥乙酯；

(2)將上述式a所示結(jié)構(gòu)的以氯甲酸為端基的甲基丙烯酸羥乙酯和8-羥基喹啉加入到有機(jī)溶劑中反應(yīng)，反應(yīng)完成用水洗滌后倒入正己烷中沉淀，分離，得到式b所示結(jié)構(gòu)的含8-羥基喹啉的可聚和單體；

(3)將2-溴異丁酸，二硫化碳和十二硫醇在丙酮中常溫?cái)嚢柽^(guò)夜，反應(yīng)完成后經(jīng)過(guò)過(guò)濾，洗滌，最后在正己烷中重結(jié)晶得到式c所示結(jié)構(gòu)的含十二硫醇的鏈轉(zhuǎn)移劑；

(4)將上述式c所示結(jié)構(gòu)的含十二硫醇的鏈轉(zhuǎn)移劑和聚乙二醇單甲醚在對(duì)甲苯磺酸催化下，在甲苯中回流反應(yīng)10～15小時(shí)，反應(yīng)完成后在乙酸乙酯中重結(jié)晶得到式d所示結(jié)構(gòu)的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑；

(5)將上述式b所示結(jié)構(gòu)的含8-羥基喹啉的可聚合單體和式d所示結(jié)構(gòu)的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑在AIBN的引發(fā)下，在N，N-二甲基甲酰胺中60～80攝氏度聚合5～8小時(shí)，反應(yīng)完成后在乙醚中沉淀得到式(I)所示結(jié)構(gòu)的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物；

式a:以氯甲酸酯為端基的甲基丙烯酸羥乙酯

式b:含8-羥基喹啉的可聚合單體

式c:含十二硫醇的鏈轉(zhuǎn)移劑

式d:大分子鏈轉(zhuǎn)移劑

一種上述銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物在抗腫瘤中的應(yīng)用。

一種上述銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物膠束制劑(或稱納米顆粒)。

一種上述銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物膠束制劑的制備方法，包括：

(1)將所述兩親性聚合物溶解在有機(jī)溶劑中；

(2)將兩親性聚合物溶液滴加至去離子水中，形成納米顆粒；

(3)通過(guò)水透析法除去多余的有機(jī)溶劑。

作為優(yōu)選，所述的有機(jī)溶劑包括二甲亞砜、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、二氧六環(huán)、四氫呋喃中的一種或多種。優(yōu)選四氫呋喃與N,N-二甲基甲酰胺。

一種如上述任一技術(shù)方案所述的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物，其膠束可以作為輸送羥基喹啉類分子和抗腫瘤藥物的載體。

一種阿霉素包埋藥物，由上述銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物包埋得到。

所述的納米顆粒平均粒徑約為50微米，可溶于注射用水、葡萄糖和生理鹽水重制形成PH在5.0-7.0之間的可注射水溶液。

一種上述阿霉素包埋藥物的制備方法，包括：

(1)將阿霉素鹽酸鹽溶于二甲亞砜，加入三乙胺脫鹽；

(2)將兩親性聚合物以及脫鹽后的阿霉素溶液溶解在有機(jī)溶劑中；

(3)將混合溶液滴加至去離子水中，形成納米顆粒；

(4)通過(guò)水透析法除去多余的有機(jī)溶劑。

作為優(yōu)選，所述的有機(jī)溶劑包括二甲亞砜、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、二氧六環(huán)中的一種或多種。優(yōu)選N,N-二甲基甲酰胺。

所述的納米顆粒平均粒徑約為50微米，可溶于注射用水、葡萄糖和生理鹽水重制形成PH在5.0-7.0之間的可注射水溶液。

本發(fā)明具有如下有益效果：

由于含有8-羥基喹啉的聚合物鏈段具有很強(qiáng)的疏水性，本發(fā)明通過(guò)引入PEG鏈段制作出雙親性的聚合物。該雙親性的聚合物在水中自組裝形成膠束結(jié)構(gòu)，一方面大大增加8-羥基喹啉在水中的溶解度；另一方面，具有高的載藥量，在銅離子的催化作用下，能在細(xì)胞中快速釋放出8-羥基喹啉銅的絡(luò)合物以及傳統(tǒng)抗癌藥物阿霉素；并且，該雙親性聚合物納米膠束可以更加有效地利用腫瘤的EPR效應(yīng)靶向癌癥組織。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明含有8-羥基喹啉的聚合物組成的納米膠束，在無(wú)銅離子的作用下，即便很高劑量也對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，而在添加了銅離子以后，其細(xì)胞毒性大大提高，有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)抗藥性的腫瘤細(xì)胞也有相似的作用。

本發(fā)明的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物制備方法操作簡(jiǎn)單，采用本領(lǐng)域常規(guī)的合成反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)。

而且本發(fā)明得到的兩親性聚合物在水中自組裝形成膠束結(jié)構(gòu)也可包埋阿霉素形成膠束，在腫瘤內(nèi)部或者額外添加的銅離子催化下，能快速釋放出8-羥基喹啉銅絡(luò)合物以及包埋的阿霉素，針對(duì)抗藥性細(xì)胞系有很強(qiáng)的殺傷作用；并且，該前藥納米膠束可以有效利用腫瘤的EPR效應(yīng)靶向癌癥組織。

附圖說(shuō)明

圖1為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物以及大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的凝膠滲透色譜法(GPC)表征譜圖；

圖2動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得的兩親性聚合物在水中形成的膠束及其包載阿霉素(DOX)后膠束的粒徑分布圖；

圖3為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束在不同條件下的釋放曲線。

圖4為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束在添加銅離子前后作用于人乳腺癌抗藥性細(xì)胞MCF-7/ADR，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；

圖5為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束在添加銅離子前后作用于人乳腺癌細(xì)胞BCap37上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

圖6為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束在添加銅離子前后作用于人宮頸癌細(xì)胞Hela上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

圖7為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束在添加銅離子前后作用于人肺癌細(xì)胞A549上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

圖8為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束在添加銅離子前后作用于人肝癌細(xì)胞HepG2上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

圖9為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束包埋阿霉素在添加銅離子前后作用于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

圖10為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束包埋阿霉素在添加銅離子前后作用于人乳腺癌抗藥性細(xì)胞MCF-7/ADR上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

圖11為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束包埋阿霉素在添加銅離子前后作用于人口腔上皮癌細(xì)胞KB上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

圖12為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束包埋阿霉素在添加銅離子前后作用于人口腔上皮癌抗藥性細(xì)胞KBv200上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

圖13為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束包埋阿霉素的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)的腫瘤體積-時(shí)間曲線以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后玻璃的老鼠腫瘤重量圖。所用的腫瘤細(xì)胞系為人乳腺癌抗藥性細(xì)胞MCF-7/ADR。

圖14為銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束包埋阿霉素在添加銅離子前后的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)的腫瘤體積-時(shí)間曲線以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后玻璃的老鼠腫瘤重量圖。所用的腫瘤細(xì)胞系為人乳腺癌抗藥性細(xì)胞MCF-7/ADR。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一些具體實(shí)施例，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制

實(shí)施例1銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物的合成

(1)氯甲酸酯為端基的甲基丙烯酸羥乙酯的合成

將三光氣(Mn＝296.75，7.42g)溶于干燥的四氫呋喃(80mL)用冰水浴冷卻至0℃，甲基丙烯酸羥乙酯(Mn＝130.14，6.5g)溶于干燥的四氫呋喃(50mL)后滴加到上述溶液中?；旌弦涸诒∠聰嚢?小時(shí)。取三乙胺(Mn＝101.19，7.57g)溶于干燥的四氫呋喃(70mL)后再滴加到上述混合液中。反應(yīng)溶液在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完成后，除去析出的鹽，旋蒸除去四氫呋喃后，用二氯甲烷溶解，有機(jī)相用冰水洗滌2次后，用無(wú)水硫酸鈉干燥。旋蒸除去二氯甲烷即得產(chǎn)物。產(chǎn)物直接用于下一步反應(yīng)。

(2)含8-羥基喹啉的可聚合單體(HQMA)的合成

取8-羥基喹啉(Mn＝145.16，5g)與三乙胺(Mn＝101.19，3.5g)溶于干燥的四氫呋喃(100mL)用冰水浴冷卻至0℃，將步驟(1)中的產(chǎn)物(Mn＝192.46，6.64g)溶于干燥的四氫呋喃(40mL)后滴加到上述溶液中。在室溫反應(yīng)過(guò)夜后，過(guò)濾除去沉淀，旋蒸除去四氫呋喃，產(chǎn)物溶于三氯甲烷后用水洗2次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。有機(jī)相濃縮后在正己烷中沉淀2次得到產(chǎn)物。經(jīng)檢測(cè)產(chǎn)物的¹H NMR(400MHz,CDCl3,δ):8.93–7.43(m,6H,Ar H),6.17(s,1H),5.64–5.57(m,1H),4.60–4.53(m,2H,CH2),4.48–4.43(m,2H,CH2),1.96(s,3H,CH3)。表明得到式b所示結(jié)構(gòu)的含8-羥基喹啉的可聚合單體。

(3)含十二硫醇的鏈轉(zhuǎn)移劑的合成

取三水磷酸鉀(Mn＝266.31，3.2g)和十二硫醇(Mn＝202.4，2.87mL)溶于丙酮(60mL)，在室溫?cái)嚢?0分鐘。二硫化碳(Mn＝76.14，2.3g)溶于丙酮(20mL)后滴加至上述溶液，室溫?cái)嚢?0分鐘后加入2-溴代異丁酸(Mn＝167，2g)，混合液室溫反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾除去不溶的鹽，旋蒸除去丙酮。粗產(chǎn)物用二氯甲烷溶解后，用1M的鹽酸溶液洗2次，飽和食鹽水洗3次，用無(wú)水硫酸鈉干燥。有機(jī)相濃縮后在正己烷中重結(jié)晶2次得到產(chǎn)物。經(jīng)檢測(cè)產(chǎn)物的¹H NMR(400MHz,CDCl3,δ):3.31–3.24(m,2H,CH2),1.73(s,6H,CH3),1.71–1.61(m,2H,CH2),1.43–1.18(m,18H,CH2),0.88(t,J＝6.9Hz,3H；CH3)。

(4)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的合成

取步驟(3)中合成的含十二硫醇的鏈轉(zhuǎn)移劑(Mn＝365.38，4.75g)和聚乙二醇單甲醚(Mn＝5000，6.5g)溶于甲苯(150mL)，溶液中加入對(duì)甲苯磺酸(Mn＝172.2，0.58g)作為催化劑。溶液加熱到回流反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)中產(chǎn)生的水用分水器除去。反應(yīng)完成后，旋蒸除去甲苯，產(chǎn)物在乙醚中沉淀2次而得。經(jīng)檢測(cè)產(chǎn)物的¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ):4.29–4.20(m,2H,CH₂),3.86–3.44(m,480H,CH₂),3.38(s,3H,CH₃),3.30–3.23(m,2H,CH₂),1.73(s,6H,CH₃),1.71–1.61(m,2H,CH₂),1.42–1.16(m,18H,CH₂),0.88(t,J＝6.9Hz,3H；CH₃)。

(5)銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物的合成

取步驟(4)的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑(Mn＝5300，0.2g)，步驟(2)中的含8-羥基喹啉的可聚合單體(Mn＝301.3，0.287g)以及AIBN(偶氮二異丁腈，Mn＝164.2，3.28mg)置于聚合瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)溶解。聚合瓶用N₂鼓泡法除去內(nèi)部殘余空氣，然后在70℃下聚合反應(yīng)6小時(shí)。將聚合瓶打開(kāi)接觸空氣即可終止反應(yīng)，溶液在無(wú)水乙醚中沉淀3次即得產(chǎn)物。經(jīng)檢測(cè)產(chǎn)物的¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.89(s,22H,ArH),8.15(s,22H,Ar H),7.75–7.31(m,88H,Ar H),4.57–4.00(m,88H,CH₂),3.75–3.51(m,450H,CH₂),3.38(s,3H,CH₃),1.91(m,44H,CH₂),0.99(m,66H,CH₃).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ153.53,150.54,147.04,140.81,135.95,129.38,126.30,121.90,121.05,70.53,40.94。表明得到式Ⅰ(PEG-PHQMA)所示結(jié)構(gòu)的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物。圖1所示聚合物以及PEG大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的凝膠滲透色譜法(GPC)譜圖測(cè)定了其PHQMA段分子量為5000左右。

性能測(cè)試1：銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束的銅離子響應(yīng)性能

本例中，取一定量的實(shí)施例1制備的兩親性聚合物PEG-PHQMA溶于水，即得到其膠束。圖2為動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得的兩親性聚合物在水中形成的膠束及其包載阿霉素(DOX)后膠束的粒徑分布圖，說(shuō)明其粒徑在40納米左右。

取一定量膠束于透析袋中，分別置于：(1)pH 5.0；(2)pH 7.0；(3)pH 5.0+3mM銅；(4)pH 7.0+3mM銅的Tris-HCl緩沖溶液中，在37℃下釋放，釋放出的8-羥基喹啉銅通過(guò)高效液相色譜HPLC檢測(cè)。釋放的曲線見(jiàn)圖3。

從圖3中可以看出，在未加銅離子之前，膠束非常穩(wěn)定，在整個(gè)過(guò)程中幾乎沒(méi)有8-羥基喹啉的釋放，而在添加了銅離子之后，膠束迅速釋放出8-羥基喹啉銅絡(luò)合物。而且，隨著pH的下降，釋放速率也隨之降低。

性能測(cè)試2：體外對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

本例中，采用的藥物為實(shí)施例1制備的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束。首先用顯微鏡觀察膠束在加入銅離子前后對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響(圖4)，可以發(fā)現(xiàn)，膠束本身和銅離子對(duì)細(xì)胞沒(méi)有影響，但一旦將其一起加入到細(xì)胞中，腫瘤細(xì)胞很快變圓，表明開(kāi)始死亡。利用常用的MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法測(cè)定了添加銅離子后膠束對(duì)人乳腺癌BCap37細(xì)胞(圖5)、人宮頸癌Hela細(xì)胞(圖6)、人肺癌A549細(xì)胞(圖7)以及人肝癌HepG2細(xì)胞(圖8)48小時(shí)抗癌細(xì)胞增殖的效果。附圖5～8中右側(cè)的小圖為單獨(dú)的30μM銅離子對(duì)細(xì)胞活力的影響。

圖5～8中，PEG-PHQMA為本發(fā)明按照實(shí)施例1方法制備得到的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束，其濃度換算為含有的8-羥基喹啉的濃度；PEG-PHQMA+Cu為添加了銅離子的PEG-PHQMA；銅離子添加的濃度為30μM。

從圖5～8中可以看出，在添加銅離子之前，膠束對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)用殺傷作用，而在添加了銅離子之后，膠束的細(xì)胞毒性大大增強(qiáng)，說(shuō)明銅離子催化了碳酸酯鍵斷裂，從而釋放出高毒性的8-羥基喹啉銅絡(luò)合物，這種現(xiàn)象在許多不同的腫瘤細(xì)胞系中都可以觀察到。單獨(dú)的銅離子對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響。

性能測(cè)試3：膠束及負(fù)載阿霉素膠束對(duì)耐藥性癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

本例中，采用的藥物為實(shí)施例1制備的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束以及用此聚合物包載阿霉素(DOX含量8％)后形成的膠束(PEG-PHQMA/DOX)。利用常用的MTT細(xì)胞代謝測(cè)定方法，測(cè)定了膠束添加30μmol/L銅(II)離子前后膠束對(duì)人乳腺癌MCF-7(圖9)以及其對(duì)應(yīng)的抗藥性MCF-7/ADR細(xì)胞(圖10)、人口腔上皮癌KB(圖11)以及其對(duì)應(yīng)的抗藥性KBv200細(xì)胞(圖12)48小時(shí)抗癌細(xì)胞增殖效果。附圖柱狀小圖為單獨(dú)的銅離子對(duì)細(xì)胞活力的影響。

圖9～12中，HQ-Cu為直接將8-羥基喹啉和銅離子混合的體系；PEG-PHQMA為本發(fā)明按照實(shí)施例1方法制備得到的銅離子響應(yīng)性的兩親性聚合物形成的膠束；PEG-PHQMA+Cu為添加了銅離子的PEG-PHQMA；PEG-PHQMA/DOX為用PEG-PHQMA包載阿霉素后形成的膠束；PEG-PHQMA/DOX+Cu為添加了銅離子的PEG-PHQMA/DOX；DOX為阿霉素溶液。銅離子添加的濃度為30μM。DOX在膠束中含量為8％。

從圖9～12中可以看出，在添加銅離子之前，膠束以及包載阿霉素的膠束都對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)用殺傷作用，而在添加了銅離子之后，膠束的細(xì)胞毒性大大增強(qiáng)，說(shuō)明銅離子催化了碳酸酯鍵斷裂，從而釋放出高毒性的8-羥基喹啉銅絡(luò)合物以及包埋的阿霉素，這種細(xì)胞毒性效果在抗藥腫瘤細(xì)胞系中與不抗藥的細(xì)胞系中表現(xiàn)一致，證明8-羥基喹啉的抗腫瘤效果與這些細(xì)胞的抗藥性機(jī)理無(wú)關(guān)。從圖9～12右側(cè)的小圖可以看出，單獨(dú)的銅離子對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響。

性能測(cè)試4：抗腫瘤活性試驗(yàn)

考察上述幾種制劑對(duì)MCF-7/ADR乳腺癌細(xì)胞荷瘤裸鼠腫瘤的抑制作用。BALB/c-nu/nu裸鼠腋下移植1×10⁷個(gè)MCF-7/ADR腫瘤細(xì)胞，待腫瘤長(zhǎng)至約100mm³后開(kāi)始給藥，每隔兩天或者三天進(jìn)行尾靜脈注射藥物，小鼠給藥后，通過(guò)腹腔注射氯化銅溶液。圖13中的5組裸鼠分別為磷酸鹽緩沖液陰性對(duì)照組(PBS)；小分子阿霉素對(duì)照組(DOX，4mg/kg)；小分子8-羥基喹啉對(duì)照組(HQ，15mg/kg)；銅離子響應(yīng)性聚合物膠束(PEG-PHQMA，含HQ 15mg/kg)和銅離子響應(yīng)性聚合物膠束包埋阿霉素(PEG-PHQMA/DOX，含HQ 15mg/kg；DOX，4mg/kg)。圖14中七組裸鼠分別為磷酸鹽緩沖液陰性對(duì)照組(PBS)；小分子阿霉素對(duì)照組(DOX，4mg/kg)；氯化銅對(duì)照組(CuCl₂，0.5mg/kg)；傳統(tǒng)膠束包埋阿霉素對(duì)照組(PEG-PCL/DOX，4mg/kg)；銅離子響應(yīng)性聚合物膠束加氯化銅(PEG-PHQMA+Cu，含HQ 15mg/kg；CuCl₂，0.5mg/kg)；銅離子響應(yīng)性聚合物膠束包埋阿霉素(PEG-PHQMA/DOX，含HQ 15mg/kg；DOX，4mg/kg)和銅離子響應(yīng)性聚合物膠束包埋阿霉素加氯化銅(PEG-PHQMA/DOX，含HQ 15mg/kg；DOX，4mg/kg；CuCl₂，0.5mg/kg)。每次給藥時(shí)記錄腫瘤的長(zhǎng)短徑和裸鼠體重，計(jì)算腫瘤體積V(V＝[Length×(Width)2]/2)，繪制腫瘤體積-時(shí)間變化曲線。于開(kāi)始給藥后的第21天處死老鼠，剝離腫瘤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13和圖14所示。

從圖13中可以看出，包埋了阿霉素的銅離子響應(yīng)性聚合物膠束對(duì)抗藥性腫瘤MCF-7/ADR具有較好的治療效果，但是腫瘤抑制效果集中在前幾次給藥時(shí)間內(nèi)，之后會(huì)有所反彈；而銅離子響應(yīng)性聚合物膠束加氯化銅組，能夠長(zhǎng)時(shí)間抑制腫瘤體積的增加。從圖14中可以看出，在添加了銅離子之后，兩親性聚合物膠束完全抑制了腫瘤的生長(zhǎng)(PEG-PHQMA+Cu組)，而傳統(tǒng)的載藥膠束包載阿霉素系統(tǒng)(PEG-PCL/DOX)和單純小分子化療藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有影響。其中兩親性聚合物膠束包載阿霉素(PEG-PHQMA/DOX+Cu組)的效果沒(méi)有單獨(dú)的兩親性聚合物膠束(PEG-PHQMA+Cu組)效果好，原因是因?yàn)榘⒚顾卣T導(dǎo)細(xì)胞caspase依賴性的凋亡，而8-羥基喹啉銅誘導(dǎo)細(xì)胞caspase非依賴型的細(xì)胞死亡，這兩種細(xì)胞死亡途徑相互拮抗，造成了治療效果的下降。