本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌肽制備方法的專利申請。

背景技術(shù)：

抗菌肽是一類生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有生物活性的小分子多肽，具有廣譜殺菌作用。天然的抗菌肽，已發(fā)現(xiàn)有A、B及D等多種。這類活性多肽多具有較好的耐酸堿性、熱穩(wěn)定性、以及廣譜抗菌等特性?？咕膶?xì)菌有很強(qiáng)的殺傷作用，尤其是對某些耐藥性病原菌具有很強(qiáng)的殺滅作用。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽最大的特點在于其殺菌機(jī)理是其疏水性端螺旋直接插入細(xì)菌菌胞膜內(nèi)而形成孔道，將細(xì)菌內(nèi)容物泄出胞外而造成細(xì)菌死亡，具有作用迅速、對耐藥菌有效且細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)良特點。

已有研究還發(fā)現(xiàn)，某些抗菌肽對部分病毒、真菌、原蟲和癌細(xì)胞等具有一定的殺滅作用，甚至能提高人體免疫力，加速傷口愈合。由于抗菌肽較為廣泛的生物學(xué)活性，在醫(yī)學(xué)上良好的應(yīng)用前景，因而其應(yīng)用價值巨大。

現(xiàn)有應(yīng)用中，抗菌肽作為飼料添加劑代替抗生素喂養(yǎng)小雞、小豬及對蝦預(yù)防禽畜及水產(chǎn)疾病已正在推廣應(yīng)用。

現(xiàn)有技術(shù)中，抗菌肽的生產(chǎn)是通過注射大腸桿菌于柞蠶蛹，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽的，然后再從柞蠶蛹提取天然抗菌肽，這種生產(chǎn)方式具有較為明顯的得率低、成本高、大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)困難的缺陷，一定程度限制了抗菌肽的生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。因而極有必要開發(fā)新的抗菌肽生產(chǎn)制備工藝。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種抗菌肽的制備方法，從而為抗菌肽的生產(chǎn)和推廣應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種抗菌肽的制備方法，該方法利用枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵制備而成，所述枯草芽孢桿菌菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YS439，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為 CICC 20445（該菌株屬于一種可公開獲得的菌株），制備方法具體包括如下步驟：

（1）菌株復(fù)壯，具體為：

如果菌株是以凍干粉（一般在-80℃保存）形式保存，則首先應(yīng)將凍干粉形式菌株接種在斜面培養(yǎng)基上，26℃~35℃條件下培養(yǎng)36~72h進(jìn)行復(fù)壯生長；

所述斜面培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：蛋白胨 0.4~0.8%，牛肉膏 0.2~0.3%，葡萄糖 1~4%，磷酸二氫鉀0.2~0.5%，瓊脂1.5~1.8%，pH=自然；

需要說明的是，如果菌株以斜面培養(yǎng)方式保藏，則無需進(jìn)行此步驟的菌株復(fù)壯操作，可直接進(jìn)入下一步生產(chǎn)過程；

（2）制備種子液，具體為：

將步驟（1）中復(fù)壯后菌株接種于滅菌后搖瓶培養(yǎng)基中，26℃~35℃、150-230 轉(zhuǎn)/min搖瓶培養(yǎng)16~25h左右，至OD₆₀₀ =3~8時，可認(rèn)為菌種培養(yǎng)成熟，即已制備好種子液；

所述搖瓶培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：

蛋白胨 0.4~0.8%，牛肉膏 0.2~0.3%，葡萄糖 1~4%，磷酸二氫鉀0.2~0.5%，硫酸銨0.2~0.7%，硫酸鎂0.1~0.3%，pH=自然；

（3）制備一級種子罐培養(yǎng)液，具體為：

將一級種子罐培養(yǎng)基滅菌后，接種步驟（2）中所制備的種子液（以體積比計，接種量為1:100~500），26℃~35℃、180-220 轉(zhuǎn)/min、通風(fēng)量1:0.5~0.7條件下，培養(yǎng)8~15h；

所述一級種子罐培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：

玉米面3~6%，豆粕4~8%，磷酸二氫鉀0.2~0.5%，葡萄糖1~4%，硫酸銨0.2~0.7%，硫酸鎂0.1~0.3%，pH=自然；

（4）菌株發(fā)酵，具體為：

將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，以4~8%體積比的接種量，接種步驟（3）中所制備的一級種子罐培養(yǎng)液，26℃~35℃、罐壓0.05～0.08Mpa、通風(fēng)量1:0.6~0.8條件下，發(fā)酵22~32h，至發(fā)酵效價不低于130000U/ml，且連續(xù)兩小時效價不再增加時，即可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束；

需要注意的是，發(fā)酵過程中可每2小時取樣檢測發(fā)酵效價，在發(fā)酵至12~15h時，補加發(fā)酵培養(yǎng)基，補加量為初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的15~20%；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基，配方同一級種子罐培養(yǎng)基，即，以質(zhì)量百分比計，配方為：

玉米面3~6%，豆粕4~8%，磷酸二氫鉀0.2~0.5%，葡萄糖1~4%，硫酸銨0.2~0.7%，硫酸鎂0.1~0.3%，pH=自然；

（5）發(fā)酵液預(yù)處理，具體為：

將步驟（4）中發(fā)酵結(jié)束后醪液采用板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，濾液再經(jīng)超濾機(jī)濃縮；

濃縮后濾液加入淀粉、麥芽糊精或輔益粉等載體，在乳化罐內(nèi)混合均勻后，使固形物含量控制在30%-40%；

超濾機(jī)濃縮時，所用超濾膜截留分子量為3000道爾頓；

（6）抗菌肽提取與精制，具體為：

將步驟（5）加入載體的濃縮后濾液經(jīng)泵輸送到噴霧干燥塔進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥時，具體參數(shù)為：

進(jìn)風(fēng)溫度 130℃~160℃，排風(fēng)溫度65℃~75℃，霧化盤轉(zhuǎn)速為3000~4500轉(zhuǎn)/min，進(jìn)料量為500~700kg/h；

干燥后，旋風(fēng)分離收集菌粉，即抗菌肽粉劑；

尾氣經(jīng)沉降除塵、生物介質(zhì)吸附、微生物分解除臭后排放；

（7）粉碎、篩分及包裝，對步驟（6）中所制備的抗菌肽可進(jìn)一步篩分、粉碎并包裝后，以便進(jìn)一步應(yīng)用，具體為：

將步驟（6）中所收集的菌粉，經(jīng)提升機(jī)輸送到篩分機(jī)（40~80目）進(jìn)行篩分，其中細(xì)粉輸送到混合機(jī)，而篩分所得粗料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后送至混合機(jī)以與細(xì)粉混合，攪拌20min~40min混合均勻后，經(jīng)質(zhì)檢檢測合格后即可進(jìn)一步進(jìn)行包裝；

包裝時，可采用自動定量包裝機(jī)進(jìn)行定量包裝；進(jìn)一步地，包裝時可采用聚乙烯材質(zhì)袋體作為內(nèi)包裝袋，而采用編織袋、紙桶或紙箱作為外包裝袋；更進(jìn)一步地，包裝時，在將內(nèi)袋捆扎后，采用封口機(jī)進(jìn)行外包裝袋縫包；包裝時，每袋重量可設(shè)計為1~20Kg。

本發(fā)明所制備的抗菌肽干粉，作為一種天然抗菌劑，可部分代替抗生素的應(yīng)用，且無毒副作用，因而可以用作食品防腐劑、果蔬保鮮劑、飼料添加劑、農(nóng)用生物防治劑和動物防病劑，具有無毒、無殘留、不產(chǎn)生耐藥性、安全性高等優(yōu)點。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請的主要技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在如下幾個方面：

（1）生產(chǎn)成本較低，實現(xiàn)了抗菌肽的規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明通過優(yōu)化培養(yǎng)基構(gòu)成，規(guī)?；a(chǎn)時，以玉米面、豆粕等農(nóng)副產(chǎn)品為主要發(fā)酵原料，代替了傳統(tǒng)的乳糖、酵母粉、蛋白胨、蠶蛹等原料，較好降低了生產(chǎn)成本；同時通過特定菌株的選擇，實現(xiàn)了抗菌肽規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)實現(xiàn)；

（2）抗菌肽生產(chǎn)周期較短、生產(chǎn)效率較高，且制備的抗菌肽的效價較高；在60噸發(fā)酵罐中批量生產(chǎn)時，發(fā)酵液平均抑菌效價在13~15萬U/mL左右，最高達(dá)15.9萬U/mL，產(chǎn)品綜合回收率達(dá)80%以上，具有較好地生產(chǎn)價值。

總體而言，本發(fā)明通過對特定發(fā)酵菌株培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，達(dá)到了高密度和高產(chǎn)量的預(yù)期效果。生產(chǎn)工藝簡單易實現(xiàn)，較好縮短了抗菌肽的生產(chǎn)周期，加上生產(chǎn)成本較低、抗菌肽產(chǎn)量高、純度高等優(yōu)點，本發(fā)明可為抗菌肽的推廣應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為所制備抗菌肽的熱穩(wěn)定性檢測；

圖2為所制備抗菌肽的酶穩(wěn)定性檢測；

圖3為所制備抗菌肽的酸堿穩(wěn)定性檢測。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本申請做進(jìn)一步解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中所涉及的枯草芽孢桿菌菌株情況簡要介紹如下。

下述實施例中所采用的枯草芽孢桿菌菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YS439，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為 CICC 20445，是一種可公開獲得的微生物菌株；發(fā)明人在獲得此菌株時，其在-80℃冰箱中以凍干粉形式存在，實際使用過程中，較為常見的還有以斜面培養(yǎng)基保存的形式。為較為全面的描述本發(fā)明的技術(shù)方案，下述實施例中，以凍干粉形式的菌株作為相關(guān)生產(chǎn)工藝的開始，但具體實施相關(guān)生產(chǎn)工藝時并非必須以此作為開始步驟。

實施例1

本實施例所提供的抗菌肽的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）菌株復(fù)壯，具體為：

首先將凍干粉形式菌株接種在斜面培養(yǎng)基上，32℃條件下培養(yǎng)48h進(jìn)行復(fù)壯生長；

所述斜面培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：蛋白胨 0.4%，牛肉膏 0.2%，葡萄糖 2%，磷酸二氫鉀0.3%，瓊脂1.6%，pH=自然。

（2）制備種子液，具體為：

將步驟（1）中復(fù)壯后菌株接種于滅菌后搖瓶培養(yǎng)基中，32℃、180 轉(zhuǎn)/min搖瓶培養(yǎng)24h左右，至OD₆₀₀=7時，可認(rèn)為菌種培養(yǎng)成熟，即已制備好種子液；

所述搖瓶培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：

蛋白胨 0.4%，牛肉膏 0.2%，葡萄糖 2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸銨0.3%，硫酸鎂0.2%，pH=自然。

（3）制備一級種子罐培養(yǎng)液，具體為：

在2噸規(guī)格的種子罐中配制1m³一級種子罐培養(yǎng)基，滅菌后，接種步驟（2）中所制備的種子液（以體積比計，接種量1:100），33℃、220 轉(zhuǎn)/min、通風(fēng)量1:0.5條件下，培養(yǎng)12h；此時顯微鏡檢測表明，菌絲稠密、菌體正常，此時可以移種用于發(fā)酵生產(chǎn)。

所述一級種子罐培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：

玉米面4%，豆粕5%，磷酸二氫鉀0.2%，葡萄糖2%，硫酸銨0.5%，硫酸鎂0.2%，pH=自然（此時為6.5左右）。

（4）菌株發(fā)酵，具體為：

在35噸規(guī)格的發(fā)酵罐中配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后（121℃~123℃實消40~45分鐘左右），降溫到34℃時，以5%體積比的接種量，接種步驟（3）中所制備的一級種子罐培養(yǎng)液，33℃、罐壓0.05Mpa、通風(fēng)量1:0.6條件下，發(fā)酵30h，至發(fā)酵效價不低于130000U/ml，且連續(xù)兩小時效價不再增加時，即可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束；

需要注意的是，發(fā)酵過程中可每2小時取樣檢測發(fā)酵效價，在發(fā)酵至15h時，補加發(fā)酵培養(yǎng)基，補加量為初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的17%；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基，配方同一級種子罐培養(yǎng)基，即，以質(zhì)量百分比計，配方為：

玉米面4%，豆粕5%，磷酸二氫鉀0.2%，葡萄糖2%，硫酸銨0.5%，硫酸鎂0.2%，pH=自然。

（5）發(fā)酵液預(yù)處理，具體為：

將步驟（4）中發(fā)酵結(jié)束后醪液轉(zhuǎn)入回收罐，并向其中加入硅藻土和珍珠巖（硅藻土、珍珠巖的添加量分別為發(fā)酵液重量的2%和3%），攪拌均勻，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，清液再經(jīng)超濾機(jī)濃縮（所用超濾膜截留分子量為3000道爾頓），加入水溶性淀粉為載體，在乳化罐內(nèi)混合均勻，使固形物含量控制在36%。

（6）抗菌肽提取與精制，具體為：

將步驟（5）加入載體的濃縮后濾液經(jīng)泵輸送到噴霧干燥塔進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥時，具體參數(shù)為：

進(jìn)風(fēng)溫度 150℃，排風(fēng)溫度70℃，霧化盤轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/min，進(jìn)料量為500kg/h；

干燥后，經(jīng)旋風(fēng)分離收集菌粉，即抗菌肽粉劑；

尾氣經(jīng)沉降除塵、生物介質(zhì)吸附、微生物分解除臭后排放。

（7）粉碎、篩分及包裝，對步驟（6）中所制備的抗菌肽進(jìn)一步篩分、粉碎并包裝后，以便進(jìn)一步應(yīng)用，具體為：

將步驟（6）中所收集的菌粉，經(jīng)提升機(jī)輸送到篩分機(jī)（40目）進(jìn)行篩分，其中細(xì)粉輸送到混合機(jī)，而篩分所得粗料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后送至混合機(jī)以與細(xì)粉混合，攪拌30min混合均勻后，經(jīng)質(zhì)檢檢測合格后即可進(jìn)一步進(jìn)行包裝。

對本實施例所制備的抗菌肽產(chǎn)品，發(fā)明人分別對其進(jìn)行了熱穩(wěn)定性、酶穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性檢測，檢測結(jié)果表明，所制備的抗菌肽產(chǎn)品的活性不受溫度、不受酶解影響，且具有較好的耐酸堿性。下面就相關(guān)實驗檢測過程簡要介紹如下。

抗菌肽的熱穩(wěn)定性檢測

本實驗主要是檢測所制備的抗菌肽產(chǎn)品在不同溫度條件下的熱穩(wěn)定性，具體實驗過程為：

分別稱取1g抗菌肽產(chǎn)品，分別溶解在50mL水中，不同溫度梯度水浴中保溫20分鐘后，測定其抗菌活性。測定結(jié)果如圖1所示。

實驗結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的抗菌肽產(chǎn)品易溶于水。而且從圖1中可以看出，抗菌肽具有較好的熱穩(wěn)定性，隨著溫度升高，抗菌肽活性雖然受到一定影響，但即使100℃水浴20分鐘后，對其殺菌作用影響并不明顯，其抑菌活力仍可達(dá)到95%左右。

酶穩(wěn)定性試驗

本實驗主要是檢測所制備的抗菌肽產(chǎn)品在不同消化酶處理后的酶穩(wěn)定性，具體實驗過程為：

分別稱取1g抗菌肽產(chǎn)品，在pH=3.0、37℃條件下，模擬動物腸胃內(nèi)酶的濃度水平，分別采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶酶解處理抗菌肽2h，然后測定抗菌肽的抑菌效價。測定過程中，以清水處理作為對照。測定結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，抗菌肽活性在經(jīng)消化酶處理后雖然出現(xiàn)一定程度降低，但與對照相比，這種差別并不明顯，即，抗菌肽具有較好的酶穩(wěn)定性，其活性不受消化酶酶解處理影響。

酸堿穩(wěn)定性試驗

本實驗主要是檢測所制備的抗菌肽產(chǎn)品在不同酸堿條件下活性變化情況，具體實驗過程為：

分別稱取1g抗菌肽產(chǎn)品，分別在溶解50mL具有不同酸堿度水溶液試管中，37℃水浴2h后，檢測其抗菌活性。測定結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以看出，抗菌肽在中性環(huán)境下，活性最高，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境下，活性受到一定影響，但與中性環(huán)境相比，活性受影響程度并不明顯，這一結(jié)果表明，所制備的抗菌肽產(chǎn)品具有較好的耐酸堿環(huán)境特性。

實施例2

本實施例所提供的抗菌肽的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）菌株復(fù)壯，具體為：

首先將凍干粉形式菌株接種在斜面培養(yǎng)基上，31℃條件下培養(yǎng)48h進(jìn)行復(fù)壯生長；

所述斜面培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.25%，葡萄糖 1%，磷酸二氫鉀0.2%，瓊脂1.8%，pH=自然。

（2）制備種子液，具體為：

將步驟（1）中復(fù)壯后菌株接種于滅菌后搖瓶培養(yǎng)基中，31℃、220 轉(zhuǎn)/min搖瓶培養(yǎng)23h左右，至OD ₆₀₀=3時，可認(rèn)為菌種培養(yǎng)成熟，即已制備好種子液；

所述搖瓶培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：

蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.25%，葡萄糖 1%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸銨0.4%，硫酸鎂0.1%，pH=自然。

（3）制備一級種子罐培養(yǎng)液，具體為：

在2噸規(guī)格的種子罐中配制1m³一級種子罐培養(yǎng)基，滅菌后，接種步驟（2）中所制備的種子液（以體積比計，接種量1:500），33℃、200 轉(zhuǎn)/min、通風(fēng)量1:0.6條件下，培養(yǎng)8h；此時顯微鏡檢測表明，菌絲稠密、菌體正常，此時可以移種用于發(fā)酵生產(chǎn)。

所述一級種子罐培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：

玉米面3%，豆粕7%，磷酸二氫鉀0.4%，葡萄糖1%，硫酸銨0.3%，硫酸鎂0.1%，pH=自然。

（4）菌株發(fā)酵，具體為：

在5噸規(guī)格的發(fā)酵罐中配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后（121℃~123℃實消40~45分鐘左右），降溫到36℃時，以4%體積比的接種量，接種步驟（3）中所制備的一級種子罐培養(yǎng)液，31℃、罐壓0.06Mpa、通風(fēng)量1:0.6條件下，發(fā)酵25h，至發(fā)酵效價不低于130000U/mL（測定表明，發(fā)酵效價達(dá)到了150000U/mL），且連續(xù)兩小時效價不再增加時，即可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束；

發(fā)酵過程中可每2小時取樣檢測發(fā)酵效價，在發(fā)酵至13h時，補加發(fā)酵培養(yǎng)基，補加量為初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20%；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基，配方同一級種子罐培養(yǎng)基，即，以質(zhì)量百分比計，配方為：

玉米面3%，豆粕7%，磷酸二氫鉀0.4%，葡萄糖1%，硫酸銨0.3%，硫酸鎂0.1%，pH=自然。

（5）發(fā)酵液預(yù)處理，具體為：

將步驟（4）中發(fā)酵結(jié)束后醪液轉(zhuǎn)入回收罐，并向其中加入硅藻土和珍珠巖（硅藻土、珍珠巖的添加量分別為發(fā)酵液重量的1.5%和3.5%），攪拌均勻，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，清液再經(jīng)超濾機(jī)濃縮（所用超濾膜截留分子量為3000道爾頓），加入輔益粉為載體，在乳化罐內(nèi)混合均勻，使固形物含量控制在38%。

（6）抗菌肽提取與精制，具體為：

將步驟（5）加入載體的濃縮后濾液經(jīng)泵輸送到噴霧干燥塔進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥時，具體參數(shù)為：

進(jìn)風(fēng)溫度 160℃，排風(fēng)溫度65℃，霧化盤轉(zhuǎn)速為3500轉(zhuǎn)/min，進(jìn)料量為700kg/h；

干燥后，經(jīng)旋風(fēng)分離收集菌粉，即抗菌肽粉劑；

尾氣經(jīng)沉降除塵、生物介質(zhì)吸附、微生物分解除臭后排放。

（7）粉碎、篩分及包裝，對步驟（6）中所制備的抗菌肽進(jìn)一步篩分、粉碎并包裝后，以便進(jìn)一步應(yīng)用，具體為：

將步驟（6）中所收集的菌粉，經(jīng)提升機(jī)輸送到篩分機(jī)（60目）進(jìn)行篩分，其中細(xì)粉輸送到混合機(jī)，而篩分所得粗料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后送至混合機(jī)以與細(xì)粉混合，攪拌40min混合均勻后，經(jīng)質(zhì)檢檢測合格后即可進(jìn)一步進(jìn)行包裝。

實施例3

本實施例所提供的抗菌肽的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）菌株復(fù)壯，具體為：

首先將凍干粉形式菌株接種在斜面培養(yǎng)基上，31℃條件下培養(yǎng)48h進(jìn)行復(fù)壯生長；

所述斜面培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：蛋白胨 0.8%，牛肉膏 0.3%，葡萄糖 3%，磷酸二氫鉀0.5%，瓊脂1.6%，pH=自然。

（2）制備種子液，具體為：

將步驟（1）中復(fù)壯后菌株接種于滅菌后搖瓶培養(yǎng)基中，31℃、220 轉(zhuǎn)/min搖瓶培養(yǎng)24h左右，至OD ₆₀₀=5時，可認(rèn)為菌種培養(yǎng)成熟，即已制備好種子液；

所述搖瓶培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：

蛋白胨 0.8%，牛肉膏 0.3%，葡萄糖 3%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸銨0.5%，硫酸鎂0.3%，pH=自然。

（3）制備一級種子罐培養(yǎng)液，具體為：

在2噸規(guī)格的種子罐中配制1m³一級種子罐培養(yǎng)基，滅菌后，接種步驟（2）中所制備的種子液（以體積比計，接種量1:300），33℃、210 轉(zhuǎn)/min、通風(fēng)量1:0.8條件下，培養(yǎng)10h；此時顯微鏡檢測表明，菌絲稠密、菌體正常。

所述一級種子罐培養(yǎng)基，以質(zhì)量百分比計，配方為：

玉米面3%，豆粕6%，磷酸二氫鉀0.4%，葡萄糖4%，硫酸銨0.3%，硫酸鎂0.1%，pH=自然。

需要說明的是，為便于后續(xù)規(guī)?；瘮U(kuò)大使用，在一級中國種子罐培養(yǎng)液基礎(chǔ)上，進(jìn)一步制備了二級種子罐培養(yǎng)液，具體過程為：

在15噸規(guī)格的種子罐中配制7m³二級種子罐培養(yǎng)基，滅菌后，接種上述所制備的一級種子罐培養(yǎng)液（以體積比計，接種量1:8），35℃、180 轉(zhuǎn)/min、通風(fēng)量1:0.8條件下，培養(yǎng)10h；此時顯微鏡檢測表明，菌絲稠密、菌體正常，此時可以移種用于發(fā)酵生產(chǎn)。

所述二級種子罐培養(yǎng)基，既可以與一級種子罐培養(yǎng)基相同，也可按如下質(zhì)量百分比配方制備：

玉米面6%，豆粕8%，磷酸二氫鉀0.5%，葡萄糖3%，硫酸銨0.6%，硫酸鎂0.3%，pH=自然。

（4）菌株發(fā)酵，具體為：

在60噸規(guī)格的發(fā)酵罐中配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后（121℃~123℃實消40~45分鐘左右），降溫到36℃時，以3%體積比的接種量，接種步驟（3）中所制備的二級種子罐培養(yǎng)液，35℃、罐壓0.08Mpa、通風(fēng)量1:0.8條件下，發(fā)酵32h，至發(fā)酵效價不低于130000U/mL（測定表明，發(fā)酵效價達(dá)到了140000U/mL），且連續(xù)兩小時效價不再增加時，即可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束；

發(fā)酵過程中可每2小時取樣檢測發(fā)酵效價，在發(fā)酵至14h時，補加發(fā)酵培養(yǎng)基，補加量為初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的18%；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基，配方同二級種子罐培養(yǎng)基，即，以質(zhì)量百分比計，配方為：

玉米面6%，豆粕8%，磷酸二氫鉀0.5%，葡萄糖3%，硫酸銨0.6%，硫酸鎂0.3%，pH=自然。

（5）發(fā)酵液預(yù)處理，具體為：

將步驟（4）中發(fā)酵結(jié)束后醪液轉(zhuǎn)入回收罐，并向其中加入硅藻土和珍珠巖（硅藻土、珍珠巖的添加量分別為發(fā)酵液重量的2%和3.6%），攪拌均勻，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，清液再經(jīng)超濾機(jī)濃縮（所用超濾膜截留分子量為3000道爾頓），加入麥芽糊精為載體，在乳化罐內(nèi)混合均勻，使固形物含量控制在30%。

（6）抗菌肽提取與精制，具體為：

將步驟（5）加入載體的濃縮后濾液經(jīng)泵輸送到噴霧干燥塔進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥時，具體參數(shù)為：

進(jìn)風(fēng)溫度 130℃，排風(fēng)溫度75℃，霧化盤轉(zhuǎn)速為4500轉(zhuǎn)/min，進(jìn)料量為600kg/h；

干燥后，經(jīng)旋風(fēng)分離收集菌粉，即抗菌肽粉劑；

尾氣經(jīng)沉降除塵、生物介質(zhì)吸附、微生物分解除臭后排放。

（7）粉碎、篩分及包裝，對步驟（6）中所制備的抗菌肽進(jìn)一步篩分、粉碎并包裝后，以便進(jìn)一步應(yīng)用，具體為：

將步驟（6）中所收集的菌粉，經(jīng)提升機(jī)輸送到篩分機(jī)（80目）進(jìn)行篩分，其中細(xì)粉輸送到混合機(jī)，而篩分所得粗料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后送至混合機(jī)以與細(xì)粉混合，攪拌35min混合均勻后，經(jīng)質(zhì)檢檢測合格后即可進(jìn)一步進(jìn)行包裝。