本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種氮取代3-氧代-6-取代四氫喹喔啉結(jié)構(gòu)化合物、其制備方法及其醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：

微管是由α,β微管蛋白異二聚體聚合而成的管狀聚合物，在細胞中具有諸多功能，特別是以紡錘體的形式參與細胞的有絲分裂過程。腫瘤細胞具有快速增殖能力，若抑制其紡錘體的形成，必將導(dǎo)致有絲分裂的阻斷，使得腫瘤細胞生長停滯于G₂/M期，抑制細胞增殖。

微管以胞質(zhì)微管和紡錘體微管兩種形式存在，參與細胞運動、細胞器定位、胞內(nèi)物質(zhì)運輸及真核細胞的有絲分裂過程等。細胞進入分裂期，其胞質(zhì)微管解聚成微管蛋白后再組裝成紡錘體微管。在分裂后期，紡錘體微管牽引著姐妹染色單體從赤道面移向紡錘體兩極。在有絲分裂結(jié)束后，紡錘體微管解聚再組裝成胞質(zhì)微管。因此，這種微管蛋白/微管之間的動態(tài)轉(zhuǎn)換(聚合和解聚)，為細胞正常有絲分裂所必需。若破壞此循環(huán)將致使進入有絲分裂的細胞停止分裂，進而延長細胞周期或誘導(dǎo)細胞凋亡。

康普瑞汀(Combretastatin A4)是從風(fēng)車子屬南非柳樹Combretum caffrum中分離得到的天然產(chǎn)物，其能夠抑制微管蛋白的聚合，具有較好的抗腫瘤活性。然而，其水溶性差及容易發(fā)生雙鍵的異構(gòu)化而生成無活性的反式同分異構(gòu)體限制了其臨床應(yīng)用。

康普瑞汀的結(jié)構(gòu)改造主要包括：(1)引入磷酸、氨基酸等結(jié)構(gòu)以改善其水溶性；(2)以磺酰胺、羰基、五元芳香雜環(huán)等替代雙鍵以解決其雙鍵在體內(nèi)的不穩(wěn)定問題。然而，上述所有報道的康普瑞汀衍生物均不同于本發(fā)明所涉及的化合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種氮取代3-氧代-6-取代四氫喹喔啉類新穎結(jié)構(gòu)化合物；本發(fā)明的另一個目的是提供該類化合物的制備方法；本發(fā)明的第三個目的是提供該類化合物或含有該類化合物的藥物組合物在制備預(yù)防或治療抗腫瘤或除腫瘤以外的增殖性疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

作為本發(fā)明的第一方面，氮取代3-氧代-6-取代四氫喹喔啉結(jié)構(gòu)化合物以及其任意組合或其藥用鹽，結(jié)構(gòu)通式如式(Ⅰ)：

其中R₁代表羥基，鏈狀C_1-6的烷氧基，3-6個環(huán)成員的環(huán)烷氧基，鏈狀C_1-6的烷胺基，3-6個環(huán)成員的環(huán)烷胺基，苯環(huán)或取代的苯環(huán)基，芳香環(huán)或取代的芳香環(huán)基，芳香雜環(huán)或取代的芳香雜環(huán)基，3-6個環(huán)成員的含氮和/或含氧雜環(huán)基；

R₂代表氫，鹵素(氟，氯，溴，碘)，羥基，鏈狀C_1-6的烷氧基；

R₃代表氫，鹵素(氟，氯，溴，碘)，羥基，鏈狀C_1-6的烷氧基；

R₄代表氫，鹵素(氟，氯，溴，碘)，羥基，鏈狀C_1-6的烷氧基；

W代表亞甲基，羰基，磺?；瑏喕酋；?。

優(yōu)選地，R₁為羥基、甲氧基、正丁胺基、環(huán)己胺基、嗎啉基或苯胺基；R₂為氫或甲氧基；R₃為氫、氟或甲氧基；R₄為氫或甲氧基；W為亞甲基、羰基或亞甲基羰基。

本發(fā)明的化合物可按照常規(guī)方法制備為藥用鹽形式；包括其有機酸鹽及無機酸鹽：有機酸包括(但不限于)乙酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、對甲苯磺酸、水楊酸、草酸等，無機酸包括(但不限于)鹽酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氫溴酸、硝酸等。含有羧酸化合物的金屬鹽：包括(但不限于)鉀鹽、鈉鹽等。

作為本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明的化合物可以用以下方法制備得到，其合成路線如下：

具體步驟為：

(1)制備3-硝基-4-氨基苯甲酸酯或3-硝基-4-氨基苯甲酰胺(2a-2e)

以3-硝基-4-氨基苯甲酸(即化合物1)為起始原料，在二氯亞砜作用下與甲醇脫水縮合，得到化合物2a；以3-硝基-4-氨基苯甲酸(即化合物1)為起始原料，二氯甲烷為溶劑，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDCI)作用下與不同的胺類化合物縮合得到化合物2b-2e；

(2)制備3-硝基-4-((2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)苯甲酸酯或3-硝基-4-((2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)苯甲酰胺(3a-4e)

化合物2a-2e分別以碳酸銫為堿，與溴乙酸乙酯發(fā)生親核取代反應(yīng)，得到化合物3a-3e；

(3)制備3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-羧酸酯或3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-羧酰胺(4a-4e)

化合物3a-3e分別以甲醇為溶劑，以鈀碳為催化劑，在氫氣作用下經(jīng)還原、環(huán)合一鍋法得到化合物4a-4e；

(4)制備1-取代芐基-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-羧酸酯(5a-5c)

化合物4a以乙腈為溶劑，以碳酸鉀為堿、碘化鉀為催化劑與不同取代的氯化芐發(fā)生親核取代反應(yīng)得到化合物5a-5c；

(5)制備1-(3,4,5-三甲氧芐基)-3氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-羧酸(6)

化合物5a以四氫呋喃/水為溶劑，在氫氧化鋰作用下水解，之后用濃鹽酸酸化處理得到化合物6；

(6)制備1-(3,4,5-三甲氧芐基)-3氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-羧酰胺(7a-7b)

化合物6以甲苯為溶劑，與草酰氯作用生成中間體，該中間體以四氫呋喃為溶劑，碳酸鉀為堿，分別與不同的苯胺作用生成化合物7a-7b；

(7)制備取代苯甲酰氯或取代苯乙酰氯(9a-9e)

原料8a-8e分別與二氯亞砜反應(yīng)生成化合物9a-9e；

(8)制備1-取代苯甲?；?3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-羧酸酯、1-取代苯甲?；?3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-羧酰胺或1-取代苯乙?；?3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-羧酸酯(10a-10l)

化合物4a-4e以四氫呋喃為溶劑、碳酸鉀為堿分別與化合物9a-9e反應(yīng)得到化合物10a-10l。

作為本發(fā)明的第三個方面，還提供了上述任一化合物以及其任意組合或其藥用鹽，在制備預(yù)防或治療抗腫瘤疾病或其它增殖性疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，通式(Ⅰ)化合物、藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物可以添加藥學(xué)上可接受的載體制成常見的藥用制劑，如片劑、膠囊、粉劑、糖漿、液劑、懸浮劑、針劑，可以加入香料、甜味劑、液體或固體填充料或稀釋劑等常用的藥物輔料。

為評價本發(fā)明合成化合物及其藥物組合物的抗腫瘤活性，對本發(fā)明的化合物進行了細胞和分子水平的藥理活性測試。

本發(fā)明化合物及其藥物組合物經(jīng)體外細胞生長抑制實驗，結(jié)果顯示該類化合物普遍具有較強的細胞生長抑制作用?；衔?c、10c對細胞生長抑制作用的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)達到幾微摩爾/升(μM)，化合物10d達到納摩爾水平(nM)。這些化合物的細胞生長抑制活性明顯優(yōu)于阿霉素。

本發(fā)明化合物及其藥物組合物經(jīng)體外微管蛋白聚合抑制實驗，結(jié)果顯示化合物5c、10c及10d在20μM具有明顯的抑制微管蛋白聚合抑制作用，化合物10d對微管蛋白聚合抑制作用的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)為3.9μM。

本發(fā)明化合物及其藥物組合物經(jīng)體外細胞生長周期實驗，結(jié)果顯示化合物10d在0.15μM能夠明顯地將細胞阻滯在G₂/M期。

本發(fā)明所述化合物和藥學(xué)上可接受的載體在臨床上可以采用口服、靜脈注射等給藥方式。在臨床上可以用于單藥治療，也可以和其他臨床上使用的化療藥物及放療等治療手段聯(lián)合用于前述癌癥的治療。

附圖說明

圖1是體外微管蛋白聚合抑制作用圖。其中A為空白對照、紫杉醇(3μM)、康普瑞汀(2.5μM)、化合物5c(20μM)、10c(20μM)及10d(20μM)對微管蛋白聚合影響；B為化合物10d在1μM，5μM，10μM，50μM濃度時對微管蛋白聚合抑制作用。

圖2是化合物10d對HeLa細胞生長周期影響圖。其中A為空白對照、化合物10d在0.1μM，0.15μM，0.20μM，0.25μM濃度時對細胞生長周期影響；B為處于不同生長期細胞統(tǒng)計圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。下述實施例中柱層析所用洗脫劑的比例均為體積比。

實施例1

1-(4-甲氧芐基)-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸甲酯(5a)的制備

(1)3-硝基-4-氨基苯甲酸甲酯的制備(2a)

將3-硝基-4-氨基苯甲酸(即化合物1，4.50g，24.7mmol)、無水甲醇(80mL)，依次投入到250mL三頸瓶中，待溫度降至0℃，用恒壓滴液漏斗慢慢滴加氯化亞砜(5.38mL，74.1mmol,3equiv)，滴加完畢，0℃繼續(xù)攪拌30分鐘，升溫至50℃反應(yīng)4h，有大量的黃色固體產(chǎn)生，抽濾，將濾液中的甲醇蒸干，加入30mL水與30mL乙酸乙酯，分液，用無水硫酸鈉干燥有機層，蒸干溶劑，得到黃色固體，與前面濾餅合并后干燥，得到化合物2a，黃色固體4.32g，收率89.2％。熔點：181.9-182.7℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.85(d,J＝1.9Hz,1H),7.99(dd,J＝8.8,1.9Hz,1H),6.83(d,J＝8.8Hz,1H),6.42(brs,2H),3.90(s,3H).

(2)3-硝基-4-((2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)苯甲酸甲酯的制備(3a)

將2a(300mg，1.53mmol)，碳酸銫(600mg，1.84mmol，1.2equiv)，溴乙酸乙酯(1.70mL，15.3mmol，10equiv)依次投入到25mL圓底燒瓶中，升溫至140℃反應(yīng)20h，反應(yīng)完畢，減壓蒸出溴乙酸乙酯，殘留物經(jīng)柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝20︰1)，得252mg黃色固體3a，收率58.3％。熔點：127.6-128.8℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.91(d,J＝2.0Hz,1H),8.75(brs,1H),8.09(dd,J＝8.9,1.8Hz,1H),6.72(d,J＝9.0Hz,1H),4.31(q,J＝7.1Hz,2H),4.14(d,J＝5.2Hz,2H),3.91(s,3H),1.33(t,J＝7.1Hz,3H).

(3)3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-羧酸甲酯的制備(4a)

將3a(300mg，1.06mmol)，無水甲醇(100mL)，10％鈀碳(56mg，0.053mmol，0.05equiv，CAS號：64741-65-7，下同)依次投入到250mL圓底燒瓶中，氫氣球置換空氣三次，室溫攪拌反應(yīng)10小時，反應(yīng)完畢，抽濾，蒸出溶劑，柱層析(200-300目硅膠，二氯甲烷︰甲醇＝80︰1)，得到180mg灰白色固體4a，收率82.4％。熔點：大于280℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.74(brs,1H),7.60(d,J＝8.1Hz,1H),7.38(s,1H),6.64(d,J＝8.2Hz,1H),4.09(s,2H),3.87(s,3H).MS(ESI)[M+H]⁺207.00.

(4)1-(4-甲氧芐基)-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸甲酯的制備(5a)

將4a(30mg，0.145mmol)，乙腈(2mL)，無水碳酸鉀(24mg，0.174mmol，1.2equiv)，碘化鉀(12mg，0.073mmol，0.5equiv)，4-甲氧基氯化芐(34mg，0.218mmol，1.5equiv)依次投入到10mL茄型瓶中，升溫至70℃反應(yīng)6小時，反應(yīng)完畢，蒸出溶劑，柱層析(200-300目硅膠，二氯甲烷︰甲醇＝80︰1)，得到20mg灰白色固體，收率42.3％。熔點：217-219℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.48(brs,1H),7.65(d,J＝8.4Hz,1H),7.44(s,1H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),6.88(d,J＝8.3Hz,2H),6.76(d,J＝8.2Hz,1H),4.44(s,2H),3.92(s,2H),3.87(s,3H),3.80(s,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ166.7,165.5,159.3,138.8,128.8,127.1,126.7,125.0,119.9,116.6,114.4,110.9,55.4,52.8,51.9,51.6.HRMS(ESI):calcd for C₁₈H₁₉N₂O₄[M+H]⁺327.13393,found 327.13388.

實施例2

1-(3,4-二甲氧芐基)-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸甲酯(5b)的制備

除第(4)步中用3,4-二甲氧基氯化芐替代4-甲氧基氯化芐外，其他步驟及提純方法同實施例1，得到29mg白色固體，收率56.1％。熔點：155.9-157.5℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ9.05(s,1H),7.65(dd,J＝8.5,1.8Hz,1H),7.50(d,J＝1.8Hz,1H),6.82(s,2H),6.79-6.74(m,2H),4.43(s,2H),3.92(s,2H),3.87(s,6H),3.83(s,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ166.8,165.8,149.5,148.7,138.9,127.6,126.6,125.2,120.0,119.9,116.8,111.4,110.9,110.5,56.0,53.2,52.0,51.6.HRMS(ESI):calcd for C₁₉H₂₁N₂O₅[M+H]⁺357.14450,found 357.14450.

實施例3

1-(2,3,4-三甲氧芐基)-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸甲酯(5c)的制備

除第(4)步中用3,4,5-三甲氧基氯化芐替代4-甲氧基氯化芐外，其他步驟及提純方法同實施例1，得到38mg白色固體，收率67.8％。熔點：188.9-191.0℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.02(brs,1H),7.67(dd,J＝8.5,1.9Hz,1H),7.43(d,J＝1.9Hz,1H),6.78(d,J＝8.6Hz,1H),6.47(s,2H),4.42(s,2H),3.93(s,2H),3.88(s,3H),3.84(s,3H),3.81(s,6H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ166.7,165.7,153.8,138.8,137.5,131.0,126.7,125.1,120.2,116.8,111.0,104.3,60.9,56.2,53.8,52.0,51.8.HRMS(ESI):calcd for C₂₀H₂₃N₂O₆[M+H]⁺387.15506,found 387.15512.

實施例4

1-(2,3,4-三甲氧芐基)-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸(6)的制備

將5c(30mg，0.0776mmol)、四氫呋喃(2mL)、蒸餾水(1mL)和氫氧化鋰(3.7mg，0.155mmol，2equiv)依次投入到10mL茄型瓶中，升溫至40℃反應(yīng)10小時，反應(yīng)完畢，蒸出四氫呋喃，滴加0.5mL濃鹽酸(12mol/L)，析出白色固體，靜置30分鐘，抽濾得到21mg灰白色固體，收率72.6％。熔點：135.3-136.3℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ11.95(brs,1H),7.73(s,1H),7.51(d,J＝8.1,1H),6.67(d,J＝8.4,1H),6.51(s,2H),4.46(s,2H),4.04(s,2H),3.84(s,9H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ170.3,167.8,153.8,138.9,137.5,131.0,127.2,124.4,119.0,118.6,109.9,104.1,60.9,56.3,53.9,51.3.HRMS(ESI):calcd for C₁₉H₂₁N₂O₆[M+H]⁺373.13941,found 373.13940.

實施例5

1-(2,3,4-三甲氧芐基)-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酰正丁胺(7a)的制備

將化合物6(25mg，0.0671mmol)，甲苯(3mL)，草酰氯(57μL，0.671mmol，10euqiv)依次投入到25mL茄型瓶中，室溫攪拌至固體全部溶解，升溫至70℃反應(yīng)3小時，反應(yīng)完畢，蒸出甲苯及未反應(yīng)的草酰氯，殘余物即為酰氯中間體，未純化；將正丁胺(20μL，0.201mmol，3equiv)，無水四氫呋喃(1.0mL)，無水碳酸鉀(28mg，0.201mmol，3equiv)依次投入到10mL茄型瓶中，用無水四氫呋喃(1.0mL)將上述制備的酰氯中間體溶解，慢慢滴加到反應(yīng)液中，室溫攪拌反應(yīng)20分鐘，反應(yīng)完畢，蒸出溶劑，柱層析(200-300目硅膠，二氯甲烷︰甲醇＝80:1)，得到21mg白色固體，收率73.2％。熔點：184.5-186.0℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.72(s,1H),7.52(s,1H),7.25(d,J＝8.4,1H),6.72(d,J＝8.5Hz,1H),6.48(s,2H),6.06(t,J＝5.4Hz,1H),4.39(s,2H),3.90(s,2H),3.84(s,3H),3.81(s,6H),3.44-3.51(m,2H),1.62-1.55(m,2H),1.47-1.37(m,2H),0.95(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ166.6,165.6,153.7,137.7,137.5,131.3,126.0,124.9,122.2,115.3,111.1,104.3,60.9,56.2,53.9,52.0,39.9,31.8,20.2,13.8.HRMS(ESI):calcd for C₂₃H₃₀N₃O₅[M+H]⁺428.21800,found428.21802.

實施例6

1-(2,3,4-三甲氧芐基)-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酰環(huán)己胺(7b)的制備

除用環(huán)己胺代替正丁胺外，其他步驟及提純方法同實施例5，得到19mg淡黃色固體，收率62.4％。熔點：167.1-169.0℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.80(s,1H),7.55(d,J＝1.6Hz,1H),7.24(d,J＝8.1,1H),6.70(d,J＝8.4Hz,1H),6.48(s,2H),5.91(d,J＝7.9Hz,1H),4.39(s,2H),4.01-4.07(m,1H),3.90(s,2H),3.84(s,3H),3.81(s,6H),1.95-2.08(m,2H),1.68-1.80(m,3H),1.39-1.50(m,2H),1.15-1.23(m,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ165.7,165.6,153.7,137.6,137.5,131.3,126.1,125.1,122.1,115.5,111.0,104.3,60.9,56.2,53.9,52.1,48.7,33.4,25.6,24.9.HRMS(ESI):calcd for C₂₅H₃₂N₃O₅[M+H]⁺454.23365,found 454.23367.

實施例7

1-(4-氟苯甲?；?-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸甲酯(10a)的制備

(1)4-氟苯甲酰氯的制備(9a)

將對氟苯甲酸8a(110mg，0.786mmol，2equiv)、氯化亞砜(856μL，11.8mmol，30equiv)依次投入到10mL茄型瓶中，升溫至70℃反應(yīng)3h，反應(yīng)完畢，減壓蒸除氯化亞砜，得到淡黃色油狀物，未純化；

(2)將4a(81mg，0.393mmol)，無水四氫呋喃(1.0mL)，無水碳酸鉀(109mg，0.786mmol，2equiv)依次投入到10mL茄型瓶中，用無水四氫呋喃(1.0mL)將上述制備化合物9a溶解，慢慢滴加至茄型瓶中，室溫下攪拌反應(yīng)2小時，減壓蒸除溶劑，用200-300目硅膠柱層析(洗脫劑DCM:MeOH＝80︰1)，得到77mg灰白色固體，收率59.7％。熔點：239.6-241.5℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ9.31(s,1H),7.71(d,J＝1.2Hz,1H),7.39-7.53(m,3H),7.02(t,J＝8.5Hz,2H),6.70(d,J＝8.5Hz,1H),4.60(s,2H),3.91(s,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ168.2,167.9,165.9,164.5(J＝252),131.6(J＝8.25),131.5,129.9,129.6(J＝3.75),127.8,124.3,124.2,117.9,115.9(J＝21.7),52.5,47.6.HRMS(ESI):calcd for C₁₇H₁₄FN₂O₄[M+H]⁺329.09321,found 329.09311.

實施例8

1-(4-甲氧基苯甲?；?-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸甲酯(10b)的制備

除步驟(1)中用對甲氧基苯甲酸替代對氟苯甲酸制得化合物9b外，其他步驟及提純方法同實施例7，得到78mg灰白色固體，收率58.3％。熔點：205.5-207.2℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ9.37(s,1H),7.70(d,J＝1.7Hz,1H),7.46(dd,J＝8.5,1.8Hz,1H),7.39(d,J＝8.8Hz,2H),6.81(d,J＝8.8Hz,2H),6.73(d,J＝8.5Hz,1H),4.59(s,2H),3.90(s,3H),3.82(s,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ169.0,168.2,166.0,162.3,132.2,131.3,129.7,127.3,125.4,124.3,124.2,117.8,113.8,55.4,52.5,47.7.HRMS(ESI):calcd for C₁₈H₁₇N₂O₅[M+H]⁺341.11320,found341.11310.

實施例9

1-(3,4-二甲氧基苯甲?；?-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸甲酯(10c)的制備

除步驟(1)中用3,4-二甲氧基苯甲酸替代對氟苯甲酸制得化合物9c外，其他步驟及提純方法同實施例7，得到68mg白色固體，收率46.7％。熔點：217.0-218.8℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ9.39(s,1H),7.70(d,J＝1.7Hz,1H),7.47(dd,J＝8.5,1.8Hz,1H),7.04(d,J＝1.9Hz,1H),6.95(dd,J＝8.3,1.9Hz,1H),6.74(m,2H),4.59(s,2H),3.90(s,3H),3.88(s,3H),3.78(s,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ169.0,168.1,166.0,152.0,148.9,132.2,129.6,127.3,125.4,124.3,124.2,123.1,117.8,112.2,110.3,56.0,52.5,47.8.HRMS(ESI):calcd for C₁₉H₁₉N₂O₆[M+H]⁺371.12376,found 371.12363.

實施例10

1-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸甲酯(10d)的制備

除步驟(1)中用3,4,5-三甲氧基苯甲酸替代對氟苯甲酸制得化合物9d外，其他步驟及提純方法同實施例7，得到92mg灰白色固體，收率58.5％。熔點：92.0-94.6℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.99(brs,1H),7.67(s,1H),7.51(d,J＝8.2Hz,1H),6.83(d,J＝8.2Hz,1H),6.64(s,2H),4.59(s,2H),3.91(s,3H),3.87(s,3H),3.70(s,6H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ168.9,167.7,165.9,153.1,141.0,131.7,129.6,128.2,127.5,124.3(2C),117.6,106.5,61.1,56.2,52.5,47.8.HRMS(ESI):calcd for C₂₀H₂₁N₂O₇[M+H]⁺401.13433,found 401.13437.

實施例11

1-[2-(3,4,5)-三甲氧基乙?；鵠-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸甲酯(10e)的制備

除步驟(1)中用3,4,5-三甲氧基苯乙酸替代對氟苯甲酸外，其他步驟及提純方法同實施例7，得到103mg白色固體，收率63.2％。熔點：188.0-181.9℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ9.10(s,1H),7.77(dd,J＝8.3,1.3Hz,1H),7.61(s,1H),7.41-7.52(m,1H),6.35(s,2H),4.51(s,2H),3.93(s,3H),3.85(d,J＝4.5Hz,2H),3.80(s,3H),3.78(s,6H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ170.4,165.8,153.4,137.0,130.8,129.3,128.7,124.6,124.2(2C),117.9,106.4,105.6,60.9,56.1,52.6,41.4,41.1.HRMS(ESI):calcd for C₂₁H₂₃N₂O₇[M+H]⁺415.14998,found 415.14999.

實施例12

1-(3，4-二甲氧基苯甲?；?-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酰丁胺(10f)的制備

(1)3-硝基-4-氨基苯甲酰丁胺的制備(2b)

將3-硝基-4-氨基苯甲酸(250mg，1.37mmol)，二氯甲烷(30mL)，EDCI(314mg，1.64mmol，1.2equiv)，正丁胺(135μL，1.37mmol，1equiv)依次投入到100mL茄型瓶中，室溫攪拌反應(yīng)2小時，反應(yīng)完畢，蒸出溶劑，柱層析(200-300目硅膠，石油醚︰乙酸乙酯＝1︰1)，得到273mg黃色固體，收率84.0％。熔點：162.8-164.6℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.47(s,1H),7.90(d,J＝8.8Hz,1H),6.86(d,J＝8.7Hz,1H),6.35(brs,2H),6.05(brs,1H),3.42-3.49(m,2H),1.58-1.67(m,2H),1.35-1.49(m,2H),0.97(t,J＝7.3Hz,3H).MS(ESI)[M+H]⁺238.08。

(2)3-硝基-4-(2-乙氧基-2-氧代乙基)胺基苯甲酰丁胺的制備(3b)

將2b(200mg，0.843mmol)，碳酸銫(329mg，1.01mmol，1.2equiv)，溴乙酸乙酯(0.935mL，8.43mmol，10equiv)依次投入到25mL圓底燒瓶中，升溫至140℃反應(yīng)20小時，反應(yīng)完畢，減壓蒸出溴乙酸乙酯，殘留物經(jīng)柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝20︰1)，得126mg黃色固體，收率46.2％。熔點：152.8-154.0℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.66(brs,1H),8.55(s,1H),8.01(d,J＝8.6Hz,1H),6.76(d,J＝9.0Hz,1H),6.05(brs,1H),4.31(q,J＝7.5Hz,2H),4.13(d,J＝5.1Hz,2H),3.40-3.51(m,2H),1.57-1.67(m,2H),1.37-1.49(m,2H),1.33(t,J＝7.1Hz,3H),0.97(t,J＝7.3Hz,3H).MS(ESI)[M-1]^-322.41.

(3)3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酸甲酯的制備(4b)

將3b(300mg，0.928mmol)，無水甲醇(100mL)，10％鈀碳(49mg，0.0464mmol，0.05equiv)依次投入到250mL圓底燒瓶中，氫氣球置換空氣三次，室溫攪拌反應(yīng)10小時，反應(yīng)完畢，抽濾，蒸出溶劑，柱層析(200-300目硅膠，二氯甲烷︰甲醇＝80:1)，得到158mg灰白色固體，收率68.8％。熔點：211.9-213.3℃。¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ7.32(d,J＝8.3Hz,1H),7.24(s,1H),6.67(d,J＝8.3Hz,1H),3.92(s,2H),3.32-3.37(m,2H),1.54-1.63(m,2H),1.35-1.44(m,2H),0.96(t,J＝7.2Hz,3H).MS(ESI)[M-1]^-246.44.

(4)1-(3，4-二甲氧基苯甲?；?-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酰丁胺的制備(10f)

將4b(60mg，0.243mmol)、無水四氫呋喃(1.0mL)、無水碳酸鉀(67mg，0.486mmol，2equiv)依次投入到10mL茄型瓶中，用無水四氫呋喃(1.0mL)將化合物9c(2equiv)溶解，慢慢滴加至茄型瓶中，室溫下攪拌反應(yīng)2小時，減壓蒸除溶劑，用200-300目硅膠柱層析(洗脫劑DCM:MeOH＝80︰1)，得到55mg白色固體，收率55.1％。熔點：224.5-226.7℃。¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ7.50(s,1H),7.20(d,J＝8.5Hz,1H),6.95-7.02(m,2H),6.89(d,J＝8.7Hz,1H),6.79(d,J＝8.5Hz,1H),4.50(s,2H),3.82(s,3H),3.69(s,3H),3.31-3.39(m,2H),1.51-1.63(m,2H),1.34-1.42(m,2H),0.95(t,J＝7.2Hz,3H).¹³C NMR(75MHz,CD₃OD)δ169.5,168.1,167.4,152.0,148.8,132.1,130.9,130.4,125.8,124.0,122.7,120.5,115.6,112.2,110.6,55.0(2C),39.4,31.2,19.8,12.8.HRMS(ESI):calcd for C₂₂H₂₆N₃O₅[M+H]⁺412.18670,found 412.18668.

實施例13

1-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酰丁胺(10g)的制備

除步驟(4)中用9d替代9c外，其他步驟及提純方法同實施例12，得到70mg灰白色固體，收率65.3％。熔點：230.5-232.0℃。¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ7.50(s,1H),7.23(d,J＝8.5Hz,1H),6.86(d,J＝8.5Hz,1H),6.70(s,2H),4.51(s,2H),3.77(s,3H),3.69(s,6H),3.32-3.37(m,2H),1.52-1.62(m,2H),1.34-1.44(m,2H),0.95(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C NMR(75MHz,CD₃OD)δ169.4,167.9,167.4,153.1,140.5,132.3,131.0,130.1,129.0,124.1,120.5,115.5,106.3,59.8,55.2,39.4,31.2,19.8,12.7.HRMS(ESI):calcd for C₂₃H₂₈N₃O₆[M+H]⁺442.19726,found 442.19727.

實施例14

1-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酰環(huán)己胺(10h)的制備

除步驟(1)中用環(huán)己胺替代正丁胺、步驟(4)中用9d替代9c外，其他步驟及提純方法同實施例12，得到62mg灰白色固體，收率54.6％。熔點：263.9-264.9℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ9.07(s,1H),7.84(s,1H),7.07(d,J＝8.4Hz,1H),6.83(d,J＝8.5Hz,1H),6.66(s,2H),5.98(d,J＝8.0Hz,1H),4.56(s,2H),4.01-4.10(m,1H),3.88(s,3H),3.73(s,6H),1.99-2.08(m,2H),1.64-1.80(m,3H),1.24-1.53(m,2H),1.25-1.29(m,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ169.0,167.0,164.9,153.2,140.8,132.0,130.6,130.2,128.6,124.0,119.8,116.8,106.4,61.0,56.3,49.1,48.1,33.2,25.5,24.8.HRMS(ESI):calcd for C₂₅H₃₀N₃O₆[M+H]⁺468.21291,found468.21289.

實施例15

1-(3，4-二甲氧基苯甲?；?-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酰苯胺(10i)的制備

除步驟(1)中用苯胺替代正丁胺，其他步驟及提純方法同實施例12，得到54mg白色固體，收率51.5％。熔點：274.7-276.5℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.25(s,1H),7.75(s,1H),7.56-7.65(m,3H),7.38(t,J＝7.5Hz,2H),7.22-7.25(m,1H),7.17(t,J＝7.0Hz,1H),7.07(s,1H),6.97(d,J＝8.8Hz,1H),6.85(d,J＝8.4Hz,1H),6.76(d,J＝8.3Hz,1H),4.58(s,2H),3.90(s,3H),3.82(s,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ167.2,164.0(2C),152.0,149.0,137.5,131.2,129.2,125.5(2C),125.0(2C),124.4,123.0,120.6,120.2,116.0,112.1,110.3,56.0,48.0.HRMS(ESI):calcd for C₂₄H₂₂N₃O₅[M+H]⁺432.15540,found 432.15540.

實施例16

1-(3,4-三甲氧基苯甲?；?-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酰苯胺(10j)的制備

除步驟(1)中用苯胺替代正丁胺、步驟(4)中用9d替代9c外，其他步驟及提純方法同實施例12，得到62mg白色固體，收率55.3％。熔點：247.1-248.5℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ9.11(s,1H),8.07(s,1H),7.61-7.66(m,3H),7.36(t,J＝7.4Hz,2H),7.27-7.30(m,1H),7.15(t,J＝7.0Hz,1H),6.93(d,J＝8.3Hz,1H),6.67(s,2H),4.53(s,2H),3.88(s,3H),3.73(s,6H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ169.2,167.3,164.2,153.2,140.9,137.6,132.3,130.5,130.4,129.2,128.4,125.0,124.3,120.8,120.4,116.3,106.4,61.0,56.3,48.2.HRMS(ESI):calcd for C₂₅H₂₄N₃O₆[M+H]⁺462.16596,found 462.16595.

實施例17

1-(3,4-二甲氧基苯甲?；?-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酰嗎啉胺(10k)的制備

除步驟(1)中用嗎啉替代正丁胺，其他步驟及提純方法同實施例12，得到54mg淡黃色固體，收率50.3％。熔點：204.0-205.1℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.62(s,1H),7.11(d,J＝13.8Hz,2H),6.94(d,J＝8.6Hz,1H),6.83(s,2H),6.74(d,J＝8.1Hz,1H),4.55(s,2H),3.89(s,3H),3.83(s,3H),3.69(brs,4H),3.54-3.58(m,4H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ169.0(2C),167.5,151.9,149.0,132.5,130.2,129.6,125.5,124.2,122.9,121.6,116.1,112.1,110.3,66.8,56.0(2C),48.1.HRMS(ESI):calcd for C₂₂H₂₄N₃O₆[M+H]⁺426.16596,found 426.16595.

實施例18

1-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-3-氧代-1,2,3,4-四氫喹喔啉-6-甲酰嗎啉胺(10l)的制備

除步驟(1)中用嗎啉替代正丁胺、步驟(4)中用9d替代9c外，其他步驟及提純方法同實施例12，得到59mg淡黃色固體，收率53.3％。熔點：205.5-207.0℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.86(s,1H),7.16(s,1H),6.94(d,J＝8.1Hz,1H),6.88(d,J＝8.3Hz,1H),6.66(s,2H),4.54(s,2H),3.87(s,3H),3.74(s,6H),3.69(brs,4H),3.50-3.61(m,4H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ169.0,168.8,167.4,153.2,141.0,132.8,130.4,129.0,128.4,124.3,121.5,116.1,106.4,66.8,61.0,56.3,48.3.HRMS(ESI):calcd for C₂₃H₂₆N₃O₇[M+H]⁺456.17653,found 456.17651.

下面是本發(fā)明所述的部分藥理實驗及結(jié)果：

實驗例1：對腫瘤細胞的增殖抑制實驗(MTT實驗)

(1)實驗方法

測試本發(fā)明所述化合物對人類肝癌細胞株(SMMC-7721)，人類子宮頸癌細胞株(HeLa)，人類白血病細胞株(K562)的細胞增殖抑制活性。以上細胞株均由該實驗室凍存和傳代。方法：對于SMMC-7721和HeLa兩種腫瘤細胞，將細胞接種于96孔平底板中(每孔約有4000-6000個細胞)，于37℃，5％CO₂條件下孵育24小時后，每孔加入不同濃度待測化合物或陽性對照藥，再培養(yǎng)72小時后，各小孔中分別加入50μL MTT的PBS緩沖液(濃度為1mg/mL)，與37℃孵育4小時，除去MTT和培養(yǎng)基，每個小孔中分別加入100μL DMSO，于570nm下檢測(Power Wave XS,Bio Tek,美國)；對于K562細胞株，將細胞接種于96孔平底板中(每孔約有6000個細胞)，與37℃，5％CO₂條件下孵育24小時后，每孔加入不同濃度待測化合物或陽性對照藥，再培養(yǎng)72小時后，各小孔中分別加入50μL MTT的無血清培養(yǎng)基溶液(濃度為1mg/mL)，與37℃孵育4小時，每小孔中加入50μL三聯(lián)溶液(10％SDS，5％異丁醇，0.01mol/L鹽酸)，37℃孵育12小時，待溫度降至室溫于570nm下檢測(Power Wave XS,Bio Tek,美國)。選取康普瑞汀(CA-4)、阿霉素為陽性對照藥。對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

(2)實驗結(jié)果

實驗結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示該類化合物普遍具有較強的細胞生長抑制作用?；衔?c、10c對細胞生長抑制作用的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)達到幾微摩爾/升(μM)，化合物10d達到納摩爾水平(nM)。這些化合物的細胞生長抑制活性明顯優(yōu)于阿霉素。

表1化合物MTT測試結(jié)果

說明：表格中化合物CA-4，阿霉素為陽性對照藥，不包含在專利保護范圍。

實驗例2：微管蛋白聚合抑制實驗

(1)實驗方法

測試本發(fā)明所述化合物對微管蛋白聚合抑制作用，采用cytoskeleton公司BK011P試劑盒。將96孔板置于多功能酶標(biāo)儀(CLARIOstar,BMG LABTECH公司,德國)上，37℃預(yù)熱10分鐘。按照說明書上操作，配置好紫杉醇溶液(10×)、CA-4溶液(10×)、檢測化合物溶液(10×)、緩沖液1、GTP母液、微管蛋白甘油緩沖液、微管蛋白母液備用，根據(jù)實驗選擇合適的比例，將緩沖液1、GTP母液、微管蛋白甘油緩沖液、微管蛋白母液混合配制微管反應(yīng)液，置于冰浴上。向96孔板中分別加入5μL對照緩沖液、紫杉醇溶液、CA-4溶液、待測化合物溶液(設(shè)1復(fù)孔)，酶標(biāo)儀上37℃預(yù)熱1分鐘，快速加入上面配制好的微管反應(yīng)液，記錄60分鐘內(nèi)熒光強度變化。

緩沖液1的配制：①每瓶緩沖液1用10mL Milli-Q超純水溶解其中的物質(zhì)(共兩瓶)；②混合兩瓶中的物質(zhì)；③將上述緩沖液分裝到13個凍存管中，每管裝1.5mL，-70℃條件下保存。

微管蛋白甘油緩沖液，保存于4℃。

GTP母液的配制：①每管GTP母液用100μL的冰冷無菌蒸餾水溶解其中的物質(zhì)(共3管)；②將其置于冰上；③混合三管中物質(zhì)；④將上述溶液分裝到13個凍存管中，每管20μL，-70℃條件下保存。

微管蛋白溶液的配制：①將盛裝凍干微管蛋白的小瓶放在冰上，將液氮置于杜瓦瓶中；②標(biāo)記12個凍存管并置于冰上待用；③將一個20μLGTP母液除霜；④將1.5mL冰冷的緩沖液1與15μLGTP母液混合；⑤用1.1mL上述混合液溶解微管蛋白凍干粉末；⑥置于冰上2分鐘待粉末全部溶解懸浮；⑦將上述微管蛋白液分裝到12個細胞凍存管中，每管88μL，置于液氮中迅速冷凍；⑧-70℃條件下保存。

紫杉醇母液配制：100μL DMSO溶解紫杉醇，-70℃條件下保存。

(2)實驗結(jié)果

結(jié)果顯示化合物5c、10c及10d在20μM具有明顯的抑制微管蛋白聚合抑制作用，化合物10d對微管蛋白聚合抑制作用的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)為3.9μM，如附圖1所示。

實驗例3：細胞周期實驗

(1)實驗方法

測試本發(fā)明所述化合物對癌細胞周期作用(選取人類子宮頸癌細胞株HeLa)，采用PI(碘化丙啶)染色。方法：將細胞接種于6孔平底板中(每孔約有100000個細胞)，于37℃，5％CO₂條件下孵育24小時后，每孔加入不同濃度10d(0.10μM，0.15μM，0.20μM，0.25μM)，設(shè)置空白對照組(空白對照組不加化合物10d)，于37℃，5％CO₂條件下孵育24小時。收集細胞，用預(yù)冷PBS(4℃，0.01mol/L)洗滌，將細胞加入到預(yù)冷(4℃)的70％(v/v)乙醇中，固定好的細胞-20℃條件下放置過夜。離心，除去乙醇，預(yù)冷PBS(4℃，0.01mol/L)洗滌，加入帶有RNase的PI染料于4℃條件下避光染色1小時，離心，除去染料，PBS洗滌，過300目濾網(wǎng)，在流式細胞儀(BD FACSVerse，美國)上進行測試。

(2)實驗結(jié)果

結(jié)果顯示化合物10d在0.15μM能夠明顯地將細胞阻滯在G₂/M生長期。