本發(fā)明涉及生物多糖提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種透明質(zhì)酸提純工藝。
背景技術(shù)：
：透明質(zhì)酸即玻璃酸(SodiumHyaluronate)，也稱玻尿酸，簡(jiǎn)稱HA，是人類于1934年首先從牛眼玻璃體中分離得到的一種廣泛存在于動(dòng)物和人體結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)以及部分細(xì)菌中的一種高分子直鏈酸性粘多糖。目前，人們已從結(jié)締組織、臍帶、皮膚、關(guān)節(jié)滑液、腦、軟骨、雞冠、林蛙皮等組織中分離出HA。在生物體中，HA常與蛋白質(zhì)相結(jié)合，并與其他粘多糖共存。在眼玻璃體和滑液中，HA以溶解形式存在，在雞冠和臍帶中，以凝膠形式存在。HA是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通過β-1,4和β-1,3糖苷鍵反復(fù)交替連接而成的一種鏈狀高分子聚合物，分子量在10萬至400百萬之間。分子中兩種單糖按等摩爾比組成。由于HA分子中每一個(gè)雙糖單位中均含有一個(gè)羧基，在生理?xiàng)l件下均可解離成負(fù)離子，等空間距離的負(fù)離子相互排斥，使其分子在水溶液中處于松散狀，占據(jù)了大量空間，因此具有特殊的保水作用，保水能力理論上可高達(dá)500ml/g，被譽(yù)為理想的天然保濕因子。由于氫鍵作用，HA分子在水溶液中呈單螺旋狀態(tài)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。當(dāng)HA達(dá)到一定濃度時(shí)，HA分子之間產(chǎn)生相互作用，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，濃度達(dá)到0.1％時(shí)，HA分子即可互相纏繞，形成網(wǎng)狀的三級(jí)結(jié)構(gòu)，賦予HA溶液特異的流變學(xué)性質(zhì)。該特性是HA具有粘彈性和發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)。HA形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的特性賦予其廣泛的生物學(xué)功能及應(yīng)用開發(fā)前景。目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸采用的工藝發(fā)酵周期長、產(chǎn)物相對(duì)分子量低、產(chǎn)品透光率差、蛋白質(zhì)含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明質(zhì)酸的形態(tài)為纖維狀，不易溶解。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種透明質(zhì)酸提純工藝。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種透明質(zhì)酸提純工藝，包括以下步驟：(1)絮凝過濾：將發(fā)酵液采用乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5-5.5，加入絮凝劑，絮凝劑的添加量為18-22mg/L，絮凝溫度為68-72℃，絮凝時(shí)間為42-48min，再過濾，得到濾液；(2)活性炭脫色：將濾液采用活性炭脫色，活性炭的添加量為5.5-7.5g/L，脫色溫度為68-72℃，脫色時(shí)間為42-48min，得到脫色液；(3)乙醇沉淀：脫色液采用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.0-6.5，再經(jīng)乙醇沉淀，得到乙醇沉淀物；(4)絡(luò)合沉淀：將乙醇沉淀物用0.08-0.12mol/L氯化鈉溶液溶解后，加入絡(luò)合劑進(jìn)行絡(luò)合沉淀；(5)解離沉淀：絡(luò)合沉淀物用鹽解離，過濾，濾液再經(jīng)乙醇沉淀，最后將沉淀物經(jīng)乙醇脫水，干燥；(6)將干燥后的沉淀物進(jìn)行超細(xì)研磨即得。所述步驟(1)中絮凝劑由海藻酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈉混合而成，所述海藻酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈉的質(zhì)量比為(1-3)：(1-3)：(1-3)。所述步驟(4)中的絡(luò)合劑由下述重量份的原料制備而成：十二烷基二甲基叔胺1-5份、十四烷基氯化吡啶1-5份、雙十二烷基二甲基溴化銨1-5份、水80-100份。優(yōu)選地，所述步驟(5)中沉淀物用鹽解離時(shí)，先用0.08-0.12mol/L氯化鈉溶液洗滌2-3次，然后再加入與發(fā)酵液等體積的0.4-0.6mol/L氯化鈉溶液中攪拌解離16-19小時(shí)。優(yōu)選地，所述干燥采用真空干燥，干燥溫度為45-55℃，干燥時(shí)間為2-4小時(shí)。本發(fā)明透明質(zhì)酸提純工藝，操作流程簡(jiǎn)單，解決了目前透明質(zhì)酸鈉提純工藝復(fù)雜的問題，其生產(chǎn)易于控制，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，得率高，成本大幅下降，具有良好的應(yīng)用前景。具體實(shí)施方式實(shí)施例中各原料介紹：發(fā)酵液采用專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310351005.4中實(shí)施例1的方法制備，其中發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量為1.17g/L，透明質(zhì)酸中蛋白質(zhì)含量為0.025wt％。乙酸，CAS號(hào)：64-19-7?；钚蕴?，CAS號(hào)：7440-44-0，采用鞏義市北山口竹清活性炭廠提供的粒度為200目的食品級(jí)活性炭。氫氧化鈉，CAS號(hào)：1310-73-2。乙醇，CAS號(hào)：64-17-5。氯化鈉，CAS號(hào)：7647-14-5。海藻酸鈉，CAS號(hào)：31581-02-9，采用珠海味佳食品添加劑有限公司提供的食品級(jí)海藻酸鈉。檸檬酸鈉，CAS號(hào)：68-04-2，采用江蘇科倫多食品配料有限公司提供的型號(hào)為K2814的食品級(jí)檸檬酸鈉。葡萄糖酸鈉，CAS號(hào)：527-07-1，采用嘉興市龍嘯化工有限公司提供的食品級(jí)葡萄糖酸鈉。十二烷基二甲基叔胺，CAS號(hào)：112-18-5。十四烷基氯化吡啶，CAS號(hào)：2785-54-8。雙十二烷基二甲基溴化銨，CAS號(hào)：3282-73-3。實(shí)施例1透明質(zhì)酸提純工藝，包括以下步驟：(1)絮凝過濾：取25L發(fā)酵液采用乙酸調(diào)節(jié)pH至4.7，加熱至70℃后加入絮凝劑攪拌混合均勻進(jìn)行絮凝，絮凝劑的添加量為20mg/L，絮凝溫度為70℃，絮凝時(shí)間為45min，再進(jìn)行真空抽濾，得到24L濾液；(2)活性炭脫色：將24L濾液加熱至72℃后添加144g活性炭，以轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杳撋?5min后真空抽濾，得到24L脫色液；(3)乙醇沉淀：脫色液用2.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，加入72L95％乙醇沉淀，得到乙醇沉淀物；(4)絡(luò)合沉淀：將乙醇沉淀物用25L0.1mol/L氯化鈉溶液溶解，在以轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢钘l件下加入絡(luò)合劑，加入絡(luò)合劑后攪拌5min，再靜置1小時(shí)后母液上排，得絡(luò)合沉淀物；(5)解離沉淀：絡(luò)合沉淀物用0.1mol/L氯化鈉溶液洗滌3次，每次洗滌0.1mol/L氯化鈉溶液用量為1L，然后向沉淀中加入25L0.5mol/L氯化鈉溶液中以轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杞怆x16小時(shí)，真空抽濾，濾液再經(jīng)75L95％乙醇沉淀3小時(shí)，用無水乙醇脫水后，將沉淀物置于旋轉(zhuǎn)式真空干燥器中，在干燥溫度為50℃下真空干燥3小時(shí)，得到干燥后的沉淀物；(6)將干燥后的沉淀物采用超細(xì)研磨機(jī)(超細(xì)研磨機(jī)為無錫市飛鳴機(jī)械有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為CXM的超細(xì)研磨機(jī))進(jìn)行超細(xì)研磨至500nm。得到實(shí)施例1的納米級(jí)透明質(zhì)酸。所述步驟(1)中絮凝劑由海藻酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈉按質(zhì)量比為1：1：1攪拌混合均勻得到。所述步驟(4)中的絡(luò)合劑由下述重量份的原料制備而成：十二烷基二甲基叔胺3份、十四烷基氯化吡啶3份、雙十二烷基二甲基溴化銨3份、水91份。將十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶、雙十二烷基二甲基溴化銨加入水中攪拌混合均勻即得。實(shí)施例2與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于：所述步驟(1)中絮凝劑由檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈉按質(zhì)量比為1：1攪拌混合均勻得到。得到實(shí)施例2的納米級(jí)透明質(zhì)酸。實(shí)施例3與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于：所述步驟(1)中絮凝劑由海藻酸鈉、葡萄糖酸鈉按質(zhì)量比為1：1攪拌混合均勻得到。得到實(shí)施例3的納米級(jí)透明質(zhì)酸。實(shí)施例4與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于：所述步驟(1)中絮凝劑由海藻酸鈉、檸檬酸鈉按質(zhì)量比為1：1攪拌混合均勻得到。得到實(shí)施例4的納米級(jí)透明質(zhì)酸。實(shí)施例5與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于：所述步驟(3)中的絡(luò)合劑由下述重量份的原料制備而成：十四烷基氯化吡啶4.5份、雙十二烷基二甲基溴化銨4.5份、水91份。將十四烷基氯化吡啶、雙十二烷基二甲基溴化銨加入水中攪拌混合均勻即得。得到實(shí)施例5的納米級(jí)透明質(zhì)酸。實(shí)施例6與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于：所述步驟(3)中的絡(luò)合劑由下述重量份的原料制備而成：十二烷基二甲基叔胺4.5份、雙十二烷基二甲基溴化銨4.5份、水91份。將十二烷基二甲基叔胺、雙十二烷基二甲基溴化銨加入水中攪拌混合均勻即得。得到實(shí)施例6的納米級(jí)透明質(zhì)酸。實(shí)施例7與實(shí)施例1基本相同，區(qū)別僅僅在于：所述步驟(3)中的絡(luò)合劑由下述重量份的原料制備而成：十二烷基二甲基叔胺4.5份、十四烷基氯化吡啶4.5份、水91份。將十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶加入水中攪拌混合均勻即得。得到實(shí)施例7的納米級(jí)透明質(zhì)酸。測(cè)試?yán)?將實(shí)施例1-7得到的納米級(jí)透明質(zhì)酸得率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)算方法：得率(％)＝納米級(jí)透明質(zhì)酸質(zhì)量/25L發(fā)酵液中透明質(zhì)酸質(zhì)量×100，具體測(cè)試結(jié)果見表1。表1：得率結(jié)果表得率，％實(shí)施例197.0實(shí)施例289.2實(shí)施例392.1實(shí)施例491.3實(shí)施例591.2實(shí)施例689.8實(shí)施例790.6比較實(shí)施例1和實(shí)施例2-4，實(shí)施例1(海藻酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈉復(fù)配)得率明顯高于實(shí)施例2-4(海藻酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈉中任意二者復(fù)配)。比較實(shí)施例1與實(shí)施例5-7，實(shí)施例1(十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶、雙十二烷基二甲基溴化銨復(fù)配)得率明顯高于于實(shí)施例5-7(十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶、雙十二烷基二甲基溴化銨中任意二者復(fù)配)。當(dāng)前第1頁1 2 3