發(fā)明背景補(bǔ)體系統(tǒng)在免疫復(fù)合物的清除以及在對(duì)感染試劑、外來(lái)抗原、病毒-感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答中起著重要作用。然而，補(bǔ)體還參與病理性的炎癥以及自身免疫疾病。因此，對(duì)過(guò)度或不受控制的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)激活加以抑制可以對(duì)患有這樣的疾病和病情的患者提供臨床益處。補(bǔ)體系統(tǒng)包括兩個(gè)不同激活途徑：經(jīng)典途徑和旁路途徑(V.M.Holers,InClinicalImmunology:PrinciplesandPractice,R.R.Rich編輯,MosbyPress；1996,363-391)。經(jīng)典途徑為鈣/鎂-依賴的級(jí)聯(lián)，其通常由抗原-抗體復(fù)合物的形成激活。旁路途徑為鎂-依賴的級(jí)聯(lián)，其通過(guò)某些易感表面(例如酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁多糖以及某些生物聚合物材料)上C3的沉積和活化而被激活。補(bǔ)體途徑的激活產(chǎn)生補(bǔ)體蛋白質(zhì)的生物活性片段，例如C3a、C4a和C5a過(guò)敏毒素以及C5b-9膜攻擊復(fù)合物(MAC)，它們介導(dǎo)炎癥活動(dòng)，包括白細(xì)胞趨化反應(yīng)，巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的活化，血管通透性，細(xì)胞溶解以及組織損傷。D因子為旁路補(bǔ)體途徑激活必不可缺的高特異性絲氨酸蛋白酶。其裂解結(jié)合C3b的B因子，產(chǎn)生C3b/Bb酶，其為旁路途徑C3/C5蛋白轉(zhuǎn)化酶的活性組分。D因子可能是用于抑制的合適靶，因?yàn)樵谌酥衅溲獫{濃度非常低(1.8μg/ml)，并且已經(jīng)證明其為旁路補(bǔ)體途徑激活的限速酶(P.H.Lesavre和H.J.Muller-Eberhard.J.Exp.Med.，1978；148：1498-1510；J.E.Volanakis等,NewEng.J.Med.，1985；312：395-401)。在動(dòng)物模型和體外研究中已經(jīng)顯示，下調(diào)補(bǔ)體活性對(duì)治療一些疾病指征有效，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎小球腎炎(Y.Wang等,Proc.Natl.Acad.Sci.；1996,93:8563-8568)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Y.Wang等,Proc.Natl.Acad.Sci.；1995,92:8955-8959)、心肺體外循環(huán)和血液透析(C.S.Rinder,J.Clin.Invest.,1995；96:1564-1572)、器官移植中的超急性排斥(T.J.Kroshus等,Transplantation,1995；60:1194-1202)、心肌梗死(J.W.Homeister等,J.Immunol.,1993；150:1055-1064；H.F.Weisman等,Science,1990；249:146-151)、再灌注損傷(E.A.Amsterdam等,Am.J.Physiol.,1995；268:H448-H457)、以及成人呼吸窘迫綜合征(R.Rabinovici等,J.Immunol.,1992；149:1744-1750)。此外，其他炎性病癥和自身免疫/免疫復(fù)合物疾病也與補(bǔ)體激活緊密相關(guān)(V.M.Holers，ibid.，B.P.Morgan.Eur.J.Clin.Invest.，1994：24：219-228)，包括燙傷、嚴(yán)重哮喘、過(guò)敏性休克、腸炎、蕁麻疹、血管性水腫、脈管炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、膜增殖性腎小球腎炎和干燥綜合癥(Sjogren's綜合癥)。在補(bǔ)體-介導(dǎo)的病癥領(lǐng)域需要抗體療法，而本發(fā)明人源化的抗體提供了有效滿足該需求的高親和力抗體。發(fā)明概述一般地，本發(fā)明涉及包含小鼠抗體166-32的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的抗體，小鼠抗體166-32是能夠抑制與D因子有關(guān)的生物活性的抗體。例如，在18μg/ml濃度時(shí)(相當(dāng)于血液中人D因子摩爾濃度的約1.5倍；抗-D因子抗體與D因子的摩爾比約1.5：1)，可以觀察到該抗體顯著抑制旁路補(bǔ)體的活性(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)6,956,107)。本發(fā)明還涉及小鼠Mab166-32的人源化抗體。本發(fā)明包括這些抗體的可變重鏈和輕鏈的氨基酸序列以及其相應(yīng)的核酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括這些抗體的CDR序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括包含本發(fā)明抗體的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明抗體序列的細(xì)胞系和載體。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括制備和使用本發(fā)明抗體和組合物的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是這些人源化抗體在制備治療與過(guò)度或不受控制的補(bǔ)體激活有關(guān)的病癥的藥物或組合物中的應(yīng)用。所述病癥包括心肺體外循環(huán)期間的補(bǔ)體激活，由急性心肌梗塞、動(dòng)脈瘤、中風(fēng)、出血性休克、擠壓傷、多器官衰竭、低血容量性休克(hypobolemicshock)、腸局部缺血或引起局部缺血的其他事件后的缺血-再灌注而引起的補(bǔ)體激活。還顯示補(bǔ)體激活與炎性病癥有關(guān)，如嚴(yán)重?zé)齻?、?nèi)毒素血癥、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征、血液透析、過(guò)敏性休克、嚴(yán)重哮喘、血管性水腫、克羅恩氏病、鐮刀形紅細(xì)胞貧血病、鏈球菌感染后腎小球腎炎和胰腺炎。病癥可以是不良藥物反應(yīng)、藥物過(guò)敏、IL-2誘導(dǎo)的血管滲漏綜合癥或放射攝影造影劑過(guò)敏的結(jié)果。它還包括自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默氏病和多發(fā)性硬化。補(bǔ)體激活還與移植排斥有關(guān)。此外，補(bǔ)體激活與眼病如年齡-相關(guān)的黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病有關(guān)。附圖簡(jiǎn)述圖1A和1B描述了小鼠MAb166-32可變重鏈(圖1A)和可變輕鏈(圖1B)的氨基酸序列。圖2A和2B描述了小鼠MAb166-32可變重鏈(圖2A)和可變輕鏈(圖2B)的核酸序列。圖3描述了小鼠MAb166-32重鏈的比對(duì)。圖4描述了小鼠MAb166-32輕鏈的比對(duì)。圖5描述了每一個(gè)人源化抗體克隆#56、#111、#250和#416的可變重鏈和可變輕鏈的氨基酸序列。圖6描述了人源化抗體Fab克隆#56、#111、#250和#416的溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖7描述了人源化抗體Fab克隆#56、#111、#250和#416對(duì)旁路補(bǔ)體激活的抑制。圖8A-B(可變重鏈(VH)共有框架)和圖9A-B(可變輕鏈(VL)共有框架)描述了示例性的受者人共有框架序列，其可用于實(shí)施本發(fā)明并具有如下序列標(biāo)識(shí)符：(圖8A-B)人VH亞組I共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO：28)、人VH亞組I共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：29-31)、人VH亞組II共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO：32)、人VH亞組II共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：33-35)、人VH亞組III共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO：36)、人VH亞組III共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：37-39)、人VH亞組VII共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO：55)、人VH亞組VII共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：56-58)、人VH受體框架減去KabatCDR(SEQIDNO：40)、人VH受體框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：41-42)、人VH受體2框架減去KabatCDR(SEQIDNO：43)和人VH受體2框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：44-46)以及(圖9A-B)人VLκ亞組I共有框架(SEQIDNO：47)、人VLκ亞組II共有框架(SEQIDNO：48)、人κ亞組III共有框架(SEQIDNO：49)和人κ亞組IV共有框架(SEQIDNO：50)。發(fā)明詳述定義本文全篇中所用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)解釋為具有對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言常規(guī)和典型的意義。然而，申請(qǐng)人希望給予下列術(shù)語(yǔ)如下特定定義。短語(yǔ)“基本一致”相對(duì)于抗體鏈多肽序列而言可以被解釋為抗體鏈與參考多肽序列有至少約70％、80％、90％或95％的序列一致性。對(duì)于核酸序列，該術(shù)語(yǔ)可以被解釋為核苷酸序列與參考核酸序列有至少約85％、90％、95％或97％的序列一致性。術(shù)語(yǔ)“一致性”或“同源性”應(yīng)解釋成是指，在比對(duì)序列并引入空隙(如果需要，以使整個(gè)序列達(dá)到最大的序列一致性百分比)之后，并且不考慮保守替代作為序列一致性的一部分時(shí)，候選序列中和與其比較的對(duì)應(yīng)序列中的殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。N端或C端延伸或插入不應(yīng)被理解成是減少了一致性或同源性。用于比對(duì)的方法和計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域所熟知的。用序列分析軟件可以測(cè)定序列一致性。術(shù)語(yǔ)“抗體”以其最廣的意義使用，并且特定地包括：?jiǎn)慰寺】贵w(包括全長(zhǎng)的單克隆抗體)、多克隆抗體和多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。抗體(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w對(duì)特定靶表現(xiàn)出結(jié)合特異性，而免疫球蛋白則包括抗體以及缺乏靶特異性的其它抗體樣分子。天然抗體和天然免疫球蛋白通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)組成。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端是恒定區(qū)。此處所用的“抗-人D因子抗體”指以抑制或基本上降低補(bǔ)體激活的方式特異性結(jié)合人D因子的抗體。在抗體可變區(qū)語(yǔ)境中所用的術(shù)語(yǔ)“可變”指：在抗體之間可變區(qū)的某些部分在序列上有很大的不同，并且這些部分在每個(gè)特定抗體對(duì)其特定靶的結(jié)合和特異性中有作用。然而，可變性并非均勻地分布在抗體可變區(qū)中。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(也稱為高變區(qū)(HVR))的三個(gè)節(jié)段中。可變區(qū)中更高度共有的部分稱為框架(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包含四個(gè)FR區(qū)，它們大多數(shù)采取β折疊構(gòu)型，由三個(gè)CDR連接，該三個(gè)CDR連接形成環(huán)連接且在某些情況下形成β折疊的一部分。每條鏈中的多個(gè)CRD通過(guò)FR區(qū)連接在相鄰近的位置，并且和另一條鏈的CDR一起形成抗體的靶結(jié)合部位(參見(jiàn)Kabat等)。除非另外指明，如此處所用的，免疫球蛋白氨基酸殘基的編號(hào)是根據(jù)Kabat等(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，NationalInstituteofHealth，Bethesda，Md.1987)的免疫球蛋白氨基酸殘基編號(hào)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行的。術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”在此使用時(shí)指其序列高度可變的和/或形成結(jié)構(gòu)限定環(huán)的抗體可變區(qū)的區(qū)域。通常，抗體包括6個(gè)高變區(qū)：3個(gè)在VH中(H1、H2、H3)，3個(gè)在VL中(L1、L2、L3)。本發(fā)明使用并包括許多高變區(qū)描述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是基于序列可變性的且最常用(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。而Chothia指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM高變區(qū)代表KabatCDR和Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，并且為OxfordMolecμlar的AbM抗體模型軟件所使用?！敖佑|”高變區(qū)是基于可獲得的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)分析。來(lái)自每個(gè)這些高變區(qū)的殘基記錄如下。Kabat編號(hào)H1H31-H35H26-H35H26-H32H30-H35Chothia編號(hào)高變區(qū)可包括如下“延伸的高變區(qū)”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。每個(gè)這些定義的可變區(qū)殘基根據(jù)上文的Kabat進(jìn)行編號(hào)?！翱蚣堋被颉癋R”殘基為此處定義的除高變區(qū)殘基或CDR殘基以外的可變區(qū)殘基。術(shù)語(yǔ)“如Kabat編號(hào)的可變區(qū)殘基”或“如Kabat編號(hào)的氨基酸位點(diǎn)”及其變體，指Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991)中用于抗體編譯的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的編號(hào)系統(tǒng)。利用該編號(hào)系統(tǒng)，事實(shí)上線性的氨基酸序列相應(yīng)于對(duì)可變區(qū)FR或CDR的截短或插入可包含更少的或額外的氨基酸。例如，重鏈可變區(qū)可包括H2的殘基52后的單個(gè)氨基酸插入(根據(jù)Kabat為殘基52a)以及重鏈FR殘基82后插入的殘基(例如根據(jù)Kabat為殘基82a、82b和82c等等)。對(duì)于給定的抗體，可通過(guò)將該抗體序列的同源區(qū)域與“標(biāo)準(zhǔn)的”Kabat編號(hào)序列進(jìn)行比對(duì)來(lái)確定其Kabat殘基編號(hào)。Kabat編號(hào)系統(tǒng)通常在提及可變區(qū)中的殘基(大約輕鏈的殘基1-107以及重鏈的殘基1-113)時(shí)使用(例如,Kabat等,SequencesofImmunologicalInterest,第五版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))?！癊U編號(hào)系統(tǒng)”或“EU索引”通常在提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時(shí)使用(例如，上文Kabat等中報(bào)道的EU索引；重鏈恒定區(qū)中的鉸鏈區(qū)大約為重鏈的殘基216-230(EU編號(hào)))?！叭鏚abat中的EU索引”指人IgG1EU抗體的殘基編號(hào)。除非此處另有說(shuō)明，抗體可變區(qū)中的殘基編號(hào)的參照物指通過(guò)Kabat編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)的殘基。除非此處另有說(shuō)明，抗體恒定區(qū)中的殘基編號(hào)的參照物指通過(guò)EU編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)的殘基(例如，參見(jiàn)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/640,323，EU編號(hào)的圖)。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”指全長(zhǎng)抗體的一部分，通常是靶結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。短語(yǔ)抗體的“功能性片段或類似物”為具有與全長(zhǎng)抗體相同的定性生物學(xué)活性的化合物。例如，抗-人D因子抗體的功能性片段或類似物為可以以阻止或基本上降低補(bǔ)體激活的方式結(jié)合D因子的一種化合物。如此處所用的，對(duì)于抗體“功能性片段”是指Fv、F(ab)和F(ab’)2片段。“Fv”片段是含有全部靶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價(jià)關(guān)聯(lián)的一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚物(VH-VL二聚物)組成。在該構(gòu)型中，各可變區(qū)中的三個(gè)CDR相互作用，從而形成VH-VL二聚物表面上的靶結(jié)合位點(diǎn)。6個(gè)CDR共同賦予抗體靶結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或Fv的一半，只包含對(duì)靶有特異性的三個(gè)CDR)也能識(shí)別并結(jié)合抗原?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包括VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其使sFv形成靶結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。Fab片段含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段和Fab片段不同，因?yàn)樵谥劓淐H1區(qū)的羧基端增加了幾個(gè)殘基(包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸)。通過(guò)裂解F(ab’)2胃蛋白酶消化產(chǎn)物的鉸鏈半胱氨酸處的二硫鍵，產(chǎn)生Fab’片段?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)方式也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。此處所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從一群基本均一的抗體中獲得的抗體，即該群體中包含的各個(gè)抗體是相同的，除了很少量可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體是高特異性的，針對(duì)單個(gè)靶位點(diǎn)。而且，與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑不同，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)靶上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于它們是通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)來(lái)合成的，不會(huì)被其它免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表示抗體是從基本均一的抗體群中獲得的特性，不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來(lái)制備抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離獲得。用于本發(fā)明的單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或可用重組方法制得?！叭嗽椿毙问降姆侨?如小鼠)抗體是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如抗體的Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或其它靶結(jié)合亞序列)，它們含有來(lái)自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗體包含了基本上所有的(至少一個(gè)、通常兩個(gè))可變區(qū)，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。人源化抗體還可以包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常是所選的人免疫球蛋白模板的Fc部分。用于人源化非-人抗體的方法為本領(lǐng)域所熟知。通常，人源化抗體具有引入的來(lái)自非-人來(lái)源的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非-人的氨基酸殘基常常稱為“引入”殘基，其通常取自“引入”可變區(qū)?？苫旧细鶕?jù)Winter和其同事的方法[Jones等,Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等,Nature,332:323-329(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988)]，通過(guò)用一個(gè)或多個(gè)嚙齒類CDR取代人抗體的相應(yīng)序列來(lái)進(jìn)行人源化。因此，所述“人源化”抗體為嵌合抗體(美國(guó)專利號(hào)4,816,567)，其中并不是完整的人可變區(qū)均被來(lái)自非-人物種的相應(yīng)序列代替。實(shí)際上，人源化抗體通常為人抗體，其中一些CDR殘基和可能一些FR殘基由來(lái)自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基代替。在一些情況下，當(dāng)抗體將被用于治療人時(shí)，選擇用于制備人源化抗體的人可變區(qū)(輕鏈和重鏈)對(duì)于降低抗原性和/或HAMA應(yīng)答(人抗小鼠抗體)很重要。HAMA應(yīng)答的降低或消除通常為臨床開(kāi)發(fā)合適治療劑的重要方面。參見(jiàn)例如.，Khaxzaeli等,J.Natl.CancerInst.(1988),80:937；Jaffers等,Transplantation(1986),41:572；Shawler等,J.Immunol.(1985),135:1530；Sears等,J.Biol.ResponseMod.(1984),3:138；Miller等,Blood(1983),62:988；Hakimi等,J.Immunol.(1991),147:1352；Reichmann等,Nature(1988),332:323；Junghans等,CancerRes.(1990),50:1495。如此處所述的，本發(fā)明提供了人源化抗體，使得HAMA應(yīng)答得到降低或消除?？蛇M(jìn)一步利用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法獲得這些抗體的變體，其中一些進(jìn)一步如下文所述。根據(jù)所謂的“最佳擬合”方法，基于已知的人可變區(qū)序列的完整文庫(kù)篩查嚙齒類抗體可變區(qū)的序列。鑒定最接近于嚙齒類V結(jié)構(gòu)域序列的人V結(jié)構(gòu)域序列，并且其內(nèi)部的人框架區(qū)(FR)接受人源化抗體(Sims等,J.Immunol.151:2296(1993):Chothia等,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一種方法利用源自特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列的特定框架區(qū)。相同的框架可用于若干不同的人源化抗體(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等,J.Immunol.151:2623(1993))。例如，來(lái)自此處所述的抗體的氨基酸序列可用作起始(親本)序列，用于使框架和/或高變序列多樣化。所選的連接起始高變序列的框架序列在此指受者人框架。雖然該受者人框架可以是來(lái)自或源自人免疫球蛋白(其VL和/或VH區(qū)域)，但該受者人框架可以來(lái)自或源自人的共有框架序列，因?yàn)檫@樣的框架區(qū)已被證實(shí)在人患者中具有最低的或沒(méi)有免疫原性。對(duì)于本發(fā)明目的而言，“受者人框架”為這樣的框架，其包含源自人免疫球蛋白框架的VL或VH框架的氨基酸序列，或來(lái)自人共有框架的氨基酸序列?！霸醋浴比嗣庖咔虻鞍卓蚣芑蛉斯灿行蛄锌蚣艿氖苷呷丝蚣芸梢园ㄆ湎嗤陌被嵝蛄谢蚩梢园按嬖诘陌被嵝蛄懈淖儭．?dāng)存在之前存在的氨基酸改變時(shí)，優(yōu)選存在不超過(guò)5個(gè)并且優(yōu)選4個(gè)或更少、或3個(gè)或更少的之前存在的氨基酸改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，VH受者人框架的序列與VH人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，VL受者人框架的序列與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。“人共有框架”為代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列選擇中最常出現(xiàn)的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來(lái)自可變區(qū)序列的亞組。通常，序列亞組為如Kabat等中的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VL，該亞組為Kabat等中的kappaI亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VH，該亞組為Kabat等中的kappaIII亞組。如果受者源自人免疫球蛋白，可以任選地如下選擇人框架序列：通過(guò)比對(duì)供者框架序列與人框架序列集合中不同的人框架序列基于人框架序列與供者框架序列的同源性進(jìn)行選擇，并且選擇最同源的框架序列作為受者。受者人框架區(qū)以來(lái)自或源自公共數(shù)據(jù)庫(kù)中可獲得的人抗體胚系序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，此處的人共有框架來(lái)自或源自VH亞組VII和/或VLκ亞組I共有框架序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備抗-D因子抗體的人框架模板可包括來(lái)自下述模板的框架序列，該模板包含VH鏈中的VI-4.1b+(VH7家族)與JH4d組合(圖3)和/或VL鏈中的DPK4(VκI家族)與JK2組合(圖4)。因此，VH受者人框架可以包括一種、兩種、三種或所有下列框架序列：包含QX1QLVQSGX2ELKKPGASVKVSCKAS(SEQIDNO：27的氨基酸1-25)的FR1，其中X1為I或V，X2為P或S；包含WVX3QAPGQGLE(SEQIDNO：27的氨基酸36-46)的FR2，其中X3為K或R；包含RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAX4YYCX5R(SEQIDNO：27的氨基酸67-98)的FR3，其中X4為T(mén)或V，X5為E或A；包含WGQGTLVTVSS(SEQIDNO：8的氨基酸105-115或SEQIDNO：27的氨基酸105-115)的FR4。VH共有框架的例子包括：人VH亞組I共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO：28)；人VH亞組I共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：29-31)；人VH亞組II共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO：32)；人VH亞組II共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：33-35)；人VH亞組Ⅲ共有框架減去KabatCDR(SEQⅢDNO：36)；人VH亞組Ⅲ共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：37-39)；人VH亞組VII共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO：55)；人VH亞組VII共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：56-58)；人VH受者框架減去KabatCDR(SEQIDNO：40)；人VH受者框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：41-42)；人VH受者2框架減去KabatCDR(SEQIDNO：43)；或人VH受者2框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO：44-45)；在一個(gè)實(shí)施方案中，VH受者人框架包括一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或所有下列框架序列：包含QVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKAS(SEQIDNO：8的氨基酸1-25)的FR1，包含WVRQAPGQGLE(SEQIDNO：8的氨基酸36-46)的FR2，包含RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCER(SEQIDNO：8的氨基酸67-98)的FR3，RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCE(SEQIDNO：8的氨基酸67-97)，RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC(SEQIDNO：8的氨基酸67-96)，RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCS(SEQIDNO：51)，或RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCSR(SEQIDNO：52)，包含WGQGTLVTVSS(SEQIDNO：8的氨基酸105-115或SEQIDNO：27的氨基酸105-115)的FR4。VL受者人框架可以包括一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或所有下列框架區(qū)序列：包含DIQX6TQSPSSLSX7SVGDRVTITC(SEQIDNO：26的氨基酸1-23)的FR1，其中X6為V或M，X7為M或A；包含WYQQKPGKX8PKLLIX9(SEQIDNO：26的氨基酸35-49)的FR2，其中X8為P或V，X9為S或Y；包含GVPSRFSX10SGSGX11DFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQIDNO：26的氨基酸57-88)的FR3，其中X10為S或G，X11為A或T；包含F(xiàn)GQGTKX12EIK(SEQIDNO：54)的FR4，其中X12為V或L。VL共有框架的例子包括：人VLκ亞組I共有框架(SEQIDNO：47)；人VLκ亞組II共有框架(SEQIDNO：48)；人VLκ亞組III共有框架(SEQIDNO：49)；或人VLκ亞組IV共有框架(SEQIDNO：50)。在一個(gè)實(shí)施方案中，VL受者人框架可以包括一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或所有下列框架序列：包含DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQIDNO：7的氨基酸1-23)的FR1，包含WYQQKPGKVPKLLIS(SEQIDNO：7的氨基酸35-49)的FR2，包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQIDNO：7的氨基酸57-88)的FR3，包含F(xiàn)GQGTKLEIK(SEQIDNO：7的氨基酸98-107)的FR4，或FGQGTKVEIK(SEQIDNO：53)。雖然受者的序列可以與所選的人框架序列相同，無(wú)論該人框架序列來(lái)自人免疫球蛋白或是人共有框架，本發(fā)明預(yù)期受者序列可以包括相對(duì)于人免疫球蛋白序列或人共有框架序列而言之前存在的氨基酸取代。這些之前存在的取代優(yōu)選為最少的；通常相對(duì)于人免疫球蛋白序列或共有框架序列僅4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或1個(gè)氨基酸不同。將非-人抗體的高變區(qū)殘基摻入VL和/或VH受體人框架中。例如，可以摻入對(duì)應(yīng)于KabatCDR殘基、Chothia高變環(huán)殘基、Abm殘基和/或接觸殘基的殘基。任選地，以下延伸的高變區(qū)殘基可被摻入：24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR的抗體，所述HVR選自(a)HVR-H1，其包含選自SEQIDNO：13和SEQIDNO：25的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQIDNO：14的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含選自SEQIDNO：15和SEQIDNO：20的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQIDNO：16的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含選自SEQIDNO：17、SEQIDNO：21和SEQIDNO：24的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含選自SEQIDNO：18、SEQIDNO：22和SEQIDNO：19的氨基酸序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR的抗-D因子抗體，所述HVR選自(a)HVR-H1，其包含與選自SEQIDNO：13和SEQIDNO：25的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含與SEQIDNO：14的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含與選自SEQIDNO：15和SEQIDNO：20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含與SEQIDNO：16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含與選自SEQIDNO：17、SEQIDNO：21和SEQIDNO：24的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含與選自SEQIDNO：18、SEQIDNO：22和SEQIDNO：19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，含有與參照序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的HVR包含取代、插入或缺失，但包含那些氨基酸序列的抗體保留結(jié)合D因子的能力。在一些實(shí)施方案中，在選自SEQIDNO：13、SEQIDNO：25、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：20、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：21、SEQIDNO：23、SEQIDNO：18、SEQIDNO：22和SEQIDNO：24的參照序列中總共有1至10個(gè)氨基酸被取代、插入或缺失。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR的抗體，所述HVR選自(a)HVR-H1，其包含選自SEQIDNO：13和SEQIDNO：25的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQIDNO：14的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含選自SEQIDNO：15和SEQIDNO：20的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQIDNO：16的氨基酸序列；(e)的HVR-L2，其包含選自SEQIDNO：17、SEQIDNO：21和SEQIDNO：24的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含選自SEQIDNO：18、SEQIDNO：22和SEQIDNO：19的氨基酸序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含選自SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10、SEQIDNO：12的重鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含選自SEQIDNO：5、SEQIDNO：7、SEQIDNO：9和SEQIDNO：11的輕鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：6的重鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：5的輕鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：6的重鏈可變區(qū)和含有SEQIDNO：5的輕鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：8的重鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：7的輕鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：8的重鏈可變區(qū)和含有SEQIDNO：7的輕鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：10的重鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：9的輕鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：10的重鏈可變區(qū)和含有SEQIDNO：9的輕鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：12的重鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：11的輕鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含含有SEQIDNO：12的重鏈可變區(qū)和含有SEQIDNO：11的輕鏈可變區(qū)的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含重鏈可變區(qū)的抗-D因子抗體，該重鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO：6、8、10和12的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，與參照序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列包含取代、插入或缺失，但包含該氨基酸序列的抗體保留結(jié)合D因子的能力。在一些實(shí)施方案中，在選自SEQIDNO：6、8、10或12的序列中，總共有1至10個(gè)氨基酸被取代、插入或缺失。在一些實(shí)施方案中，所述取代、插入或缺失存在于HVR以外的區(qū)域(即在FR中)。在一些實(shí)施方案中，抗-D因子抗體包含含有選自SEQIDNO：6、8、10或12的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含輕鏈可變區(qū)的抗-D因子抗體，該輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO：5、7、9和11的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，與參照序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列包含取代、插入或缺失，但包含那些氨基酸序列的抗體保留結(jié)合D因子的能力。在一些實(shí)施方案中，在選自SEQIDNO：5、7、9和11的序列中，總共有1至10個(gè)氨基酸被取代、插入或缺失。在一些實(shí)施方案中，該取代、插入或缺失存在于HVR以外的區(qū)域(即在FR中)。在一些實(shí)施方案中，抗-D因子抗體包含具有選自SEQIDNO：5、7、9和11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。抗-D因子抗體可以包含任何合適的框架可變區(qū)序列，條件是該抗體保留結(jié)合D因子的能力。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含的重鏈可變區(qū)框架序列是Vl.4.1b+和JH4d的組合(參見(jiàn)圖3)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含人亞組VII重鏈框架區(qū)共有序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含的重鏈可變區(qū)框架序列包含F(xiàn)R1，其包含SEQIDNO：8的氨基酸1-25；FR2，其包含SEQIDNO：8的氨基酸36-46；FR3，其包含SEQIDNO：8的氨基酸67-98；和FR4，其包含SEQIDNO：8的氨基酸105-115。在這些抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重鏈可變區(qū)序列包含位點(diǎn)40和/或88(Kabat編號(hào))處的取代。這些抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，位點(diǎn)40為半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)和/或位點(diǎn)88為半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含的輕鏈可變區(qū)框架序列是DPK4和JK2的組合(參見(jiàn)圖4)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含人κI(κI)輕鏈框架共有序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含的輕鏈可變區(qū)框架序列包含F(xiàn)R1，其包含SEQIDNO：7的氨基酸1-23；FR2，其包含SEQIDNO：7的氨基酸35-49；FR3，其包含SEQIDNO：7的氨基酸57-88；和FR4，其包含SEQIDNO：7的氨基酸98-107。在這些抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述輕鏈可變框架序列包含位點(diǎn)15、43和/或104(Kabat編號(hào))處的一個(gè)或多個(gè)取代。這些抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，位點(diǎn)15為半胱氨酸(C)或纈氨酸(V)，位點(diǎn)43為半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)和/或位點(diǎn)104為纈氨酸(V)或亮氨酸(L)。進(jìn)一步地，抗-D因子抗體可以包含任何合適的恒定區(qū)序列，條件是該抗體保留結(jié)合D因子的能力。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體至少包含重鏈恒定區(qū)的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含α、δ、ε、γ或μ重鏈的一種或其組合的重鏈恒定區(qū)。取決于其重鏈恒定區(qū)(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分為不同的類別或同種型。存在五種類別的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分別具有命名為α、δ、ε、γ和μ的重鏈?；谠贑H序列和功能方面的相對(duì)微小的差別，將γ和α類別進(jìn)一步分成亞類，例如人表達(dá)下列亞類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含的重鏈恒定區(qū)在對(duì)效應(yīng)子功能(例如結(jié)合親和力)產(chǎn)生預(yù)期效果的氨基酸位點(diǎn)處包含取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含的重鏈恒定區(qū)在對(duì)效應(yīng)子功能(例如結(jié)合親和力)不產(chǎn)生預(yù)期效果的氨基酸位點(diǎn)處包含取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含IgG類型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重鏈恒定區(qū)，并且進(jìn)一步包含位點(diǎn)114(Kabat編號(hào)；相當(dāng)于EU編號(hào)的118)、168(Kabat編號(hào)；相當(dāng)于EU編號(hào)的172)、172(Kabat編號(hào)；相當(dāng)于EU編號(hào)的176)和/或228(EU編號(hào))處的取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)類型的重鏈恒定區(qū)，并且進(jìn)一步包含位點(diǎn)114處的取代，其中位點(diǎn)114為半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)，位點(diǎn)168為半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)，位點(diǎn)172為半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)和/或位點(diǎn)228為脯氨酸(P)、精氨酸(R)或絲氨酸(S)。進(jìn)一步地，例如在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含輕鏈恒定區(qū)的至少一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含κ或λ輕鏈的一種或其組合的輕鏈恒定區(qū)，因?yàn)榛谳p鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的輕鏈可分類到兩種明顯不同類型(稱為κ和λ)中的一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含的輕鏈恒定區(qū)在對(duì)效應(yīng)子功能(例如結(jié)合親和力)產(chǎn)生預(yù)期效果的氨基酸位點(diǎn)處包含取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含的輕鏈恒定區(qū)在對(duì)效應(yīng)子功能(例如結(jié)合親和力)不產(chǎn)生預(yù)期效果的氨基酸位點(diǎn)出包含取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含κ類型的輕鏈恒定區(qū)，并且進(jìn)一步包含位點(diǎn)110、144、146和/或168(Kabat編號(hào))處的取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-D因子抗體包含κ類型的輕鏈恒定區(qū)，并且進(jìn)一步包含位點(diǎn)110處的取代，其中位點(diǎn)110為半胱氨酸(C)或纈氨酸(V)；位點(diǎn)144的取代，其中位點(diǎn)144為半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)；位點(diǎn)146的取代，其中位點(diǎn)146為異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)；和/或位點(diǎn)168的取代，其中位點(diǎn)168為半胱氨酸(C)或絲氨酸(S)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了與小鼠抗166-32和/或人源化抗-D因子抗體克隆#56、#111、#250或#416和/或包含人源化抗-D因子抗體克隆#56、#111、#250或#416的可變區(qū)或HVR序列的抗體競(jìng)爭(zhēng)的抗體。本發(fā)明還提供了與小鼠抗166-32和/或人源化抗-D因子抗體克隆#56、#111、#250或#416和/或包含人源化抗-D因子抗體克隆#56、#111、#250或#416的可變區(qū)或HVR序列的抗體結(jié)合相同表位的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體對(duì)D因子的單價(jià)親和力(例如該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)較低，例如比嵌合抗體的單價(jià)親和力(例如該嵌合抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)低至少1倍或2倍，該抗體包含SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)、或由SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)組成，或基本上由SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗-D因子抗體，其中該抗體對(duì)D因子的二價(jià)親和力(例如該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)較低，例如比嵌合抗體的二價(jià)親和力(例如該嵌合抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)低至少1倍或2倍，該抗體包含SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)、或由SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)組成，或基本上由SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體對(duì)D因子的單價(jià)親和力(例如該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)較高，例如比嵌合抗體的單價(jià)親和力(例如該嵌合抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)高至少1倍或2倍，該抗體包含SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)、或由SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)組成或基本上由SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體對(duì)D因子的二價(jià)親和力(例如該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)較高，例如比嵌合抗體的二價(jià)親和力(例如該嵌合抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)高至少1倍或2倍，該抗體包含SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)、或由SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)組成或基本上由SEQIDNO：2的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO：1的重鏈可變區(qū)組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為1.0nM(1.0×10-9M)或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為0.5nM(0.5×10-9M)或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為1.0pM(1.0×10-12M)或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為0.5pM(0.5×10-12M)或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)為1.0nM(1.0×10-9M)或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)為0.5nM(0.5×10-9M)或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)為1.0pM(1.0×10-12M)或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)為0.5pM(0.5×10-12M)或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)在0.5mM(0.5×10-6M)和0.5pM(0.5×10-12M)之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)在15nM(15×10-9M)和0.1nM(0.1×10-9M)之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)在5.5nM(5.5×10-9M)和1nM(1×10-9M)之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)在0.5pM(0.5×10-12M)和2mM(2×10-12M)之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)在0.5mM(0.5×10-6M)和0.5pM(0.5×10-12M)之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)在10nM(10×10-9M)和0.05nM(0.05×10-9M)之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)在5.5nM(5.5×10-9M)和1nM(1×10-9M)之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)在0.5pM(0.5×10-12M)和2pM(2×10-12M)之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約0.37nM(3.7×10-9M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約0.33nM(3.3×10-9M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約0.51nM(5.1×10-9M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約2.7nM(2.7×10-9M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約1.4nM(1.4×10-9M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約1.4pM(1.4×10-12M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)為約1.1pM(1.1×10-12M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約0.19nM(0.19×10-9M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)為約0.08nM(0.08×10-9M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約12.3nM(12.3×10-9M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)為約9.0nM(9.0×10-9M)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約1.4pM(1.4×10-12M)+/-0.5。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)為約1.1pM(1.1×10-12M)+/-0.6。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約0.19nM(0.19×10-9M)+/-0.1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)為約0.08nM(0.08×10-9M)+/-0.01。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)為約12.3nM(12.3×10-9M)+/-2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗-D因子抗體，其中該抗體以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)為約9.0nM(9.0×10-9M)+/-1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約3.7nM(3.7×10-9M)+/-2的單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約3.3nM(3.3×10-9M)+/-2的單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約5.1nM(5.1×10-9M)+/-2的單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約2.7nM(2.7×10-9M)+/-2的單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約1.4nM(1.4×10-9M)+/-2的單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約1.4pM(1.4×10-12M)+/-2的單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約1.1pM(1.1×10-12M)+/-2的二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約0.19nM(0.19×10-9M)+/-2的以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約0.08nM(0.08×10-9M)+/-2的以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約12.3nM(12.3×10-9M)+/-2的以其單價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為Fab片段對(duì)D因子的親和力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-D因子抗體可以具有約9.0nM(9.0×10-9M)+/-2的以其二價(jià)形式對(duì)D因子的親和力(例如，該抗體作為IgG對(duì)D因子的親和力)。如本領(lǐng)域公認(rèn)的，可利用任何各種測(cè)定法測(cè)定配體對(duì)其受體的結(jié)合親和力，并且通過(guò)各種定量值表示。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力(bindingaffinity)可以表示為Kd值并且反映固有的結(jié)合親和力(例如具有最小化的活動(dòng)性(avidity)影響)。通常并且優(yōu)選在體外測(cè)量結(jié)合親和力，可以用無(wú)細(xì)胞的或細(xì)胞相關(guān)的裝置。如此處更詳細(xì)描述的，可通過(guò)人源化抗體的單價(jià)結(jié)合親和力值(例如，以Fab形式)與對(duì)照/比較抗體(例如具有供者高變區(qū)序列的小鼠抗體)的單價(jià)結(jié)合親和力值(例如，以Fab形式)的比例對(duì)結(jié)合親和力的倍數(shù)差異進(jìn)行定量，其中所述結(jié)合親和力值在類似的測(cè)定條件下測(cè)定。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力的倍數(shù)差異被確定為Fab形式的人源化抗體與所述對(duì)照/比較Fab抗體的Kd值的比例。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，如果本發(fā)明的抗體(A)具有比對(duì)照抗體(M)的親和力低“3倍”的親和力，則如果A的Kd值為3×，M的Kd值將為1×，并且A的Kd與M的Kd的比值將為3：1。反之，在一個(gè)實(shí)施方案中，如果本發(fā)明的抗體(C)具有比對(duì)照抗體(R)的親和力高“3倍”的親和力，則如果C的Kd值為1×，R的Kd值將為3×，并且C的Kd與R的Kd的比值將為1：3。本領(lǐng)域已知的任何多種測(cè)定法，包括此處所述的那些，可用于獲得結(jié)合親和力的測(cè)量值，包括例如Biacore、放射免疫測(cè)定法(RIA)與ELISA。此外，本發(fā)明抗體的Kd值可以根據(jù)所用具體測(cè)定法的條件而不同。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力的測(cè)定可以在下述測(cè)定法中實(shí)現(xiàn)，其中固定Fab或抗體，并且測(cè)定配體(即D因子)的結(jié)合，或者固定Fab或抗體的配體(即D因子)，并且測(cè)定Fab或抗體的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力的測(cè)定可以在下述測(cè)定法中實(shí)現(xiàn)，其中再生條件可以包括(1)pH為1.5，10mM甘氨酸或4MMgCl2和(2)pH在1.0和pH7.5之間，包括pH1.5、pH5.0、pH6.0和pH7.2。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力的測(cè)定可以用下述測(cè)定法實(shí)現(xiàn)，其中結(jié)合條件可以包括(1)PBS或HEPES緩沖鹽水和(2)Tween-20，即0.1％Tween-20。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力的測(cè)定可以在下述測(cè)定法中實(shí)現(xiàn)，其中配體(即D因子)的來(lái)源可以從市場(chǎng)上獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力的測(cè)定可以在下述測(cè)定法中實(shí)現(xiàn)，其中(1)固定Fab或抗體并且測(cè)定配體(即D因子)的結(jié)合，(2)再生條件包括pH7.2，4MMgCl2和(3)結(jié)合條件包括HEPES緩沖鹽水，pH7.2，含有0.1％Tween-20。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力的測(cè)定可以在下述測(cè)定法中實(shí)現(xiàn)，其中(1)固定配體(即D因子)并且測(cè)定Fab或抗體的結(jié)合，(2)再生條件包括pH1.5，10mM甘氨酸和(3)結(jié)合條件包括PBS緩沖液。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”包括子代。也應(yīng)理解，由于有意或無(wú)意的突變，所有子代也許在DNA內(nèi)容上不精確相同。在原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出的具有相同功能或生物活性的不同子代也被包括在內(nèi)。本發(fā)明所用的“宿主細(xì)胞”通常是原核或真核宿主。術(shù)語(yǔ)“載體”指含有DNA序列的DNA構(gòu)建物，該DNA序列與能使該DNA在合適宿主中表達(dá)的合適的調(diào)控序列操作性連接。所述調(diào)控序列包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、控制該轉(zhuǎn)錄的任選的操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆粒、或簡(jiǎn)單地是潛在的基因組插入物。一旦轉(zhuǎn)化到合適宿主中，該載體能不依賴于宿主基因組進(jìn)行復(fù)制和起作用，或在一些情況下，其本身整合入基因組中。在本說(shuō)明書(shū)中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”有時(shí)可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是目前最常用的載體形式。然而，本發(fā)明還包括具有等同功能的其它形式的載體，它們是本領(lǐng)域中已知的。此處所用的詞語(yǔ)“標(biāo)記物”指直接或間接與分子或蛋白質(zhì)例如抗體偶聯(lián)的可被檢測(cè)的化合物或組合物。標(biāo)記物自身可以被檢測(cè)到(例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者，如果是酶標(biāo)記物，它們可催化底物化合物或組合物發(fā)生可檢測(cè)的化學(xué)轉(zhuǎn)變。如此處所用的，“固相”指本發(fā)明抗體可粘附于其上的非水性基質(zhì)。固相的例子在此包括：部分或完全由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷形成的固相。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)上下文，固相可包括測(cè)試板的孔；而在其它實(shí)例中是純化柱(例如親和層析柱)?？贵w的制備宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化此處用于克隆或在載體中表達(dá)DNA的合適的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或更高等的真核細(xì)胞。用于此目的合適的原核生物包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性生物，例如腸細(xì)菌如大腸桿菌(E.coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)和志賀氏菌屬(Shigella)，以及芽胞桿菌屬(Bacilli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和鏈霉菌屬(Streptomyces)。一個(gè)優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主為大腸桿菌294(ATCC31,446)，雖然其他菌株如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,537)以及大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也合適。這些例子為示例性的而不是限制性的。除原核生物之外，真核微生物如絲狀真菌或酵母為抗體-編碼載體的合適克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在較低級(jí)的真核宿主微生物當(dāng)中為最常使用的。然而，許多其他屬、種和菌株通?？色@得并在本發(fā)明中有用，如非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克盧費(fèi)氏酵母(Kluyveromyces)；假絲酵母(Candida)；木霉(Trichoderma)；粗糙鏈孢(Neurosporacrassa)；以及絲狀真菌如脈孢菌(Neurospora)、青霉(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)和曲霉屬(Aspergillus)宿主，如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。用于糖基化抗體表達(dá)的合適的宿主細(xì)胞源自多細(xì)胞生物。原則上，任何高級(jí)真核細(xì)胞培養(yǎng)物都是可使用的，無(wú)論其來(lái)自脊椎動(dòng)物或是無(wú)脊椎動(dòng)物培養(yǎng)物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞，Luckow等，Bio/Technology6，47-55(1988)；Miller等，GeneticEngineering，Setlow等編輯，第8卷，277-279頁(yè)(Plenampublishing1986)；Mseda等，Nature315，592-594(1985)。各種桿狀病毒株和變體和來(lái)自如草地夜蛾(caterpillar)、埃及伊蚊(mosquito)、黑尾果蠅(fruitfly)和家蠶宿主的相應(yīng)的可感染昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞已被鑒定。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒株(例如，苜蓿丫紋夜蛾(Autographacalifornica)NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株)是公眾可獲得的，這些病毒可用作本發(fā)明中所述的病毒，尤其可用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。另外，也可用棉、玉米、土豆、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為宿主。脊椎動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)手段。參見(jiàn)TissueCμlture，AcademicPress，Kruse和Patterson編輯(1973)。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系例子是：猴腎細(xì)胞；人胚腎細(xì)胞系；乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠足細(xì)胞；人宮頸癌細(xì)胞(HELA)；犬腎細(xì)胞；；人肺細(xì)胞；人肝細(xì)胞；小鼠乳房腫瘤和NS0細(xì)胞。為了生產(chǎn)抗體用上述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞培養(yǎng)在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基經(jīng)適當(dāng)修改以適合誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。用于產(chǎn)生本發(fā)明抗體變體的宿主細(xì)胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。商業(yè)上可獲得的培養(yǎng)基如Ham’sF10(Sigma)、最低必需培養(yǎng)基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，Ham等，Meth.Enz.，58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.，102：255(1980)，美國(guó)專利No.4,767,704；4,657,866；4,560,655；5,122,469；5,712,163或6,048,728中所述的任一培養(yǎng)基可用作(本發(fā)明)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。所有這些培養(yǎng)基中可以按需添加入激素和/或其它生長(zhǎng)因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(如X氯化物，其中X是鈉、鈣、鎂；和磷酸鹽)、緩沖劑(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM藥)、微量元素(定義為最終濃度通常在微摩爾范圍內(nèi)的無(wú)機(jī)化合物)以及葡萄糖或等價(jià)能源。另外也可加入合適濃度的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件，如溫度、pH等，與前述選擇宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)所用條件一樣，這對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的?？贵w純化當(dāng)采用重組技術(shù)時(shí)，抗體可產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)(周質(zhì)空間內(nèi))或被直接分泌到培養(yǎng)基中。如果抗體突變體產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)，則第一步是除去宿主細(xì)胞或裂解片段的顆粒碎片，例如通過(guò)離心或超離心除去。Carter等，Bio/Technology10：163-167(1992)描述了分泌入大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的分離過(guò)程。簡(jiǎn)言之，在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下融解細(xì)胞漿狀物約30分鐘。離心除去細(xì)胞碎片。若抗體突變體被分泌到培養(yǎng)基中，則通常首先用商業(yè)上購(gòu)得的蛋白濃縮濾膜(例如Amicon或MilliporePellicon超濾裝置)濃縮該表達(dá)系統(tǒng)的上清液。在前述任何步驟中均可加入抑制蛋白水解的蛋白酶抑制劑(如PMSF)，還可加入抗生素來(lái)防止外來(lái)污染物的生長(zhǎng)。例如，可用羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來(lái)純化從細(xì)胞中制得的抗體組合物，其中親和層析是優(yōu)選的純化方法。蛋白A作為親和配體的合適性取決于抗體突變體中免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用來(lái)純化以人IgG1、IgG2或IgG4重鏈為基礎(chǔ)的抗體(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。對(duì)于所有小鼠同種型和人IgG3，建議采用蛋白G(Guss等，EMBOJ.5：1567-1575(1986))。親和配體附著的基質(zhì)通常是瓊脂糖，但是也可采用其它基質(zhì)。機(jī)械上穩(wěn)定的基質(zhì)，如控制孔徑的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯能達(dá)到比瓊脂糖更快的流速，并使操作時(shí)間縮短。當(dāng)抗體突變體包含CH3區(qū)時(shí)，可用BakerbondABXTM樹(shù)脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)來(lái)純化。根據(jù)待回收的抗體突變體，還可采用其它蛋白純化方法，如在離子交換柱上分級(jí)分離、乙醇沉淀、反向HPLC、硅膠層析、肝素SEPHAROSETM層析、陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(如聚天冬氨酸柱)層析、聚焦層析、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。在初步純化后，可對(duì)包含目的抗體突變體和污染物的混合物進(jìn)行低pH疏水作用層析，采用pH約2.5-4.5的洗脫緩沖液，最好是在低鹽濃度(如約0-0.25M鹽濃度)下進(jìn)行。藥物制劑將具有所需純度的多肽與本領(lǐng)域中通常采用的任選的“藥學(xué)上可接受”載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(所有這些均稱為“賦形劑”)例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑、非離子性洗滌劑、抗氧化劑和其它各種添加劑)(參見(jiàn)Remington’sPharmaceuticalSciences，16版，Osol，A.編輯(1980)混合，制成多肽或抗體的藥物制劑，以用于作為凍干制劑或水性溶液保藏。這些添加劑必須在所采用的劑量和濃度下對(duì)接受者沒(méi)有毒性。緩沖劑有助于將pH維持在大致為生理?xiàng)l件的范圍內(nèi)。緩沖劑的濃度最好在大約2mM至50mM內(nèi)。適用于本發(fā)明的緩沖劑包括有機(jī)和無(wú)機(jī)酸及其鹽，例如檸檬酸鹽緩沖液(例如檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖液(例如琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、延胡索酸鹽緩沖液(例如延胡索酸-延胡索酸單鈉混合物)、延胡索酸鹽緩沖液(例如延胡索酸-延胡索酸鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸單鈉-延胡索酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩沖液(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖液(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)、以及乙酸鹽緩沖液(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，也可以是磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液和三甲胺如(Tris)。加入防腐劑以阻止微生物生長(zhǎng)，加入量在0.2-1％(w/v)范圍內(nèi)。用于本發(fā)明的合適的防腐劑包括苯酚、芐醇、間甲酚、對(duì)羥苯甲酸甲酯、對(duì)羥苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯基氯化銨、苯扎鹵(例如氯、溴、碘)銨、氯化己烷雙胺、對(duì)羥苯甲酸烷酯(如對(duì)羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯甲酸丙酯)、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。等滲劑有時(shí)稱為“穩(wěn)定劑”，可以添加以確保本發(fā)明的液體組合物的等滲性，其包括多羥基糖醇，優(yōu)選三羥或更多羥基的糖醇，例如甘油、丁四醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。穩(wěn)定劑指廣義的賦形劑，其功能從填充劑到溶解治療劑或有助于防止變性或粘附在容器壁上的添加劑。典型的穩(wěn)定劑可以是多羥基糖醇(如上所述)；氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸、L-亮氨酸、2-苯基丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機(jī)糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、木蘇糖、甘露糖、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)多醇如環(huán)己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如尿素、谷胱苷肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即小于10個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮單糖(單糖是例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二糖如乳糖、麥芽糖、蔗糖和三糖如蜜三糖；多糖如葡聚糖。穩(wěn)定劑的含量范圍為每份重量活性蛋白中有0.1-10,000重量份。添加非離子表面活性劑或洗滌劑(也稱為“潤(rùn)濕劑”)有助于溶解治療劑以及保護(hù)治療劑避免受攪動(dòng)引起的凝集，它還使得當(dāng)制劑暴露于遭受應(yīng)力的剪切表面時(shí)不會(huì)引起蛋白變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic.RTM.多元醇、聚氧乙烯山梨糖醇單醚(吐溫.RTM.-20、吐溫.RTM.-80等)。非離子性表面活性劑的含量約為0.05mg/ml至1.0mg/ml，較佳的約0.07mg/ml至約0.2mg/ml。其它各種賦形劑包括填充劑(如淀粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶劑。本發(fā)明的制劑還含有待治療特定適應(yīng)癥所需的多種活性化合物，優(yōu)選相互間沒(méi)有不利影響的有互補(bǔ)活性的那些化合物。例如，理想地還可以提供免疫抑制劑。這些分子適于以組合形式存在，其量對(duì)期望的目的有效。在膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微珠、微乳劑、納顆粒和納膠囊)或巨乳劑中，活性組分還可被包裹在例如通過(guò)團(tuán)聚技術(shù)或界面聚合制得的微膠囊(例如羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中。這些技術(shù)公開(kāi)在Remington’sPharmaceuticalSciences,16版(1980),A.Osal編輯。用于體內(nèi)給藥的制劑必須無(wú)菌。這很容易例如通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢灾频镁忈屩苿＞忈屩苿┑暮线m例子包括含有抗體突變體的固體疏水聚合物半滲透基質(zhì)，其中所述基質(zhì)是成形制品，如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利號(hào)3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不能降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射的微珠)、和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能夠在100天內(nèi)持續(xù)釋放分子，但是某些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間卻較短。當(dāng)包裹在膠囊內(nèi)的抗體長(zhǎng)時(shí)間停留在體內(nèi)時(shí)，它們會(huì)由于暴露在37℃潮濕環(huán)境下而變性或凝聚，從而導(dǎo)致生物活性喪失，且免疫原性可能會(huì)改變?？梢愿鶕?jù)涉及的機(jī)理來(lái)設(shè)計(jì)合理策略加以穩(wěn)定。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚的機(jī)理是通過(guò)硫代-二硫鍵互換而形成了分子間S-S鍵，則可通過(guò)修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制含水量、采用合適的添加劑和開(kāi)發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)達(dá)到穩(wěn)定化。在治療特定疾病或狀況中，治療性多肽、抗體或其片段的有效量將取決于疾病或狀況的性質(zhì)，并且能用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來(lái)確定。在可能的時(shí)候，希望首先在體外測(cè)定本發(fā)明藥物組合物的劑量-反應(yīng)曲線，然后在人體內(nèi)測(cè)試前在有用的動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)定。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)皮下注射給予治療性多肽、抗體或其片段的水溶液。每劑的范圍在大約0.5μg至50μg/千克體重，或更優(yōu)選從3μg至約30μg/千克體重。皮下給藥的劑量方案可以從一月一次到每日一次，這取決于許多臨床因素，包括疾病類型、疾病嚴(yán)重程度以及患者對(duì)治療劑的敏感程度。人源化抗體的應(yīng)用本發(fā)明的人源化抗體可用于診斷實(shí)驗(yàn)，例如檢測(cè)特定細(xì)胞、組織或血清中感興趣靶的表達(dá)。對(duì)于診斷性應(yīng)用，抗體突變體通常用可檢測(cè)基團(tuán)作標(biāo)記?？刹捎迷S多標(biāo)記物。定量測(cè)定熒光變化的技術(shù)如上所述?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)被電激發(fā)，然后可發(fā)出可測(cè)定(例如通過(guò)化學(xué)發(fā)光計(jì))的光或提供能量給熒光接受器。酶標(biāo)記物的例子包括螢光素酶(如螢火蟲(chóng)螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶；美國(guó)專利號(hào)4,737,456)、熒光素、2,3-二氫酞嗪二酮、蘋(píng)果酸脫氫酶、脲酶、過(guò)氧化物酶(如辣根過(guò)氧化物酶(HRPO))、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶等。O’Sμllivan等，MethodforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjμgatesforuseinEnzymeImmunoassay，MethodsinEnzym.(Ed.J.Langone&H.VanVunakis)，Academicpress，NewYork，73：147-166(1981)中將描述了將酶偶聯(lián)于抗體的技術(shù)。有時(shí)，標(biāo)記可以與抗體變體間接偶聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道實(shí)現(xiàn)這一目的的各種方法。例如，抗體變體可以與生物素偶聯(lián)，而上述三大類標(biāo)記物則與親和素偶聯(lián)，或兩者互換。生物素選擇性地結(jié)合親和素，從而通過(guò)這一間接方式將標(biāo)記物和抗體變體偶聯(lián)起來(lái)。或者，為了間接地偶聯(lián)標(biāo)記物和抗體變體，可使抗體變體與小的半抗原(如洋地黃毒苷(digloxin))偶聯(lián)，而上述不同類型的標(biāo)記物中的一種則與抗該半抗原的抗體變體(如抗洋地黃毒苷抗體)偶聯(lián)。這樣，就間接地將標(biāo)記物和抗體變體偶聯(lián)起來(lái)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，不標(biāo)記抗體變體，該抗體變體的存在可用與之結(jié)合的標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)。本發(fā)明的抗體可用于任何已知的實(shí)驗(yàn)方法，如競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，直接和間接夾心實(shí)驗(yàn)和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。Zola，MonoclonalAntibodies：AManualofTechniques)，147-158頁(yè)(CRCPress，Inc.1987)。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)依賴于標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品與測(cè)試樣品競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限量抗體變體的能力。測(cè)試樣品中靶的量與結(jié)合抗體的標(biāo)準(zhǔn)品的量成反比。為了便于確定已結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品的量，抗體通常在競(jìng)爭(zhēng)前后為不溶性的。這樣就能方便地將已結(jié)合抗體的標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品從仍未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品中分離出來(lái)。夾心實(shí)驗(yàn)包括采用兩種抗體，每種抗體能結(jié)合待檢測(cè)蛋白的不同的免疫原性部分或表位。在夾心測(cè)定法中，待分析的測(cè)試樣品與固定在固相載體上的第一抗體結(jié)合，然后，第二抗體與測(cè)試樣品結(jié)合，從而形成了不溶性的三組分復(fù)合物。例如見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,376,110。第二抗體本身可用可檢測(cè)物質(zhì)標(biāo)記(直接夾心測(cè)定法)，或可利用標(biāo)記了可檢測(cè)物質(zhì)的抗免疫球蛋白抗體來(lái)測(cè)定(間接夾心測(cè)定法)。例如，一類夾心測(cè)定法是ELISA測(cè)定法，在該種情況下，可檢測(cè)物是酶。對(duì)于免疫組織化學(xué)，腫瘤樣品可以是新鮮的或冷凍的，或可包埋在石蠟中并用防腐劑(例如福爾馬林)來(lái)固定?？贵w也可用于體內(nèi)診斷實(shí)驗(yàn)。通常，抗體用放射性核素(如.sup.111In、.sup.99Tc、.sup.14C、.sup.131I、.sup.3H、.sup.32P或.sup.35S)標(biāo)記，這樣通過(guò)免疫閃爍顯影可確定腫瘤的位置。例如，本發(fā)明的高親和力抗-lgE抗體可用于檢測(cè)存在于例如哮喘患者肺中IgE的量。本發(fā)明的多肽或抗體可以試劑盒形式提供，即，將預(yù)定劑量的試劑與進(jìn)行診斷實(shí)驗(yàn)的說(shuō)明書(shū)組合包裝。當(dāng)抗體變體用酶標(biāo)記時(shí)，試劑盒將包括酶所需的底物和輔因子(如提供可檢測(cè)的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的底物前體)。另外，還可包括其它添加劑，如穩(wěn)定劑、緩沖液(如封閉緩沖液或裂解緩沖液)等。各種試劑的相對(duì)量可以變化很大，使得提供的溶液中試劑濃度能使實(shí)驗(yàn)的靈敏度基本上達(dá)到最優(yōu)。特別是，試劑可以干粉形式(通常是凍干的)提供，包括在溶解時(shí)能提供濃度合適的試劑溶液的賦形劑?？贵w的體內(nèi)應(yīng)用預(yù)期本發(fā)明的多肽或抗體可用來(lái)治療哺乳動(dòng)物。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，將抗體給予非人哺乳動(dòng)物以獲得臨床前數(shù)據(jù)。示例性的待治療非人哺乳動(dòng)物包括非人的靈長(zhǎng)類、狗、貓、嚙齒類動(dòng)物和其它能進(jìn)行臨床前研究的哺乳動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物可以是已經(jīng)建立的待用抗體來(lái)治療的疾病動(dòng)物模型，或者可用來(lái)研究目的抗體毒性的動(dòng)物模型。在每個(gè)實(shí)施方案中，可在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行劑量逐步增加的研究。抗體或多肽可通過(guò)任何合適的方法施用，包括腸胃外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、和鼻內(nèi)給藥，如果需要局部免疫抑制治療，可以在病變區(qū)內(nèi)施用。胃腸外輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、或皮下施用。另外，抗體突變體可通過(guò)脈沖注入的方式施用，特別是伴隨減少抗體突變體的劑量。優(yōu)選通過(guò)注射施用藥物劑量，最優(yōu)選是靜脈內(nèi)或皮下注射施用，這部分地取決于是瞬時(shí)施用還是不斷地施用。為了預(yù)防或治療疾病，抗體或多肽的合適劑量取決于待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度和病程、給予抗體突變體是出于預(yù)防目的還是治療目的、以往的治療、患者的臨床病史以及對(duì)抗體的反應(yīng)、和治療醫(yī)師的判斷。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，無(wú)論是通過(guò)例如一次或多次分開(kāi)施用還是連續(xù)輸注，施用于患者的抗體初始候選劑量大約是0.1mg/kg至150mg/kg(例如0.1-20mg/kg)。根據(jù)上述因素，典型的每日劑量可以在大約1mg/kg至100mg/kg或以上的范圍內(nèi)。對(duì)于幾天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的重復(fù)施用，根據(jù)病征，應(yīng)維持治療直至疾病癥狀受到所需的抑制。然而，可采用其它劑量方案。這種治療的進(jìn)程很容易用常規(guī)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)來(lái)監(jiān)測(cè)。示例性的劑量方案公開(kāi)在WO94/04188中?？贵w組合物可以以與良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐相一致的方式配制、按劑量給藥或施用。在本文上下文中考慮的因素包括待治療的特定的疾病、待治療的特定的哺乳動(dòng)物、患者個(gè)體的臨床狀況、病因、遞送試劑的部位、施用方法、施用方案以及醫(yī)生所知的其它因素。所施用的抗體的“治療有效量”將由這些考慮因素決定，并且是預(yù)防、改進(jìn)或治療疾病或失調(diào)所需的最少量。抗體不需要但任選地可以與目前使用的一種或多種試劑配制在一起，以預(yù)防或治療所討論的疾病。所述其他試劑的有效量取決于制劑中抗體的量、疾病或治療的類型、以及上述的其它因素。這些試劑的用量和施用途徑通常和上文所用的相同，或者約為上文所用劑量的1-99％。識(shí)別D因子作為其靶的本發(fā)明抗體可用于治療補(bǔ)體介導(dǎo)的病癥。這些病癥與過(guò)度的或不受控制的補(bǔ)體激活有關(guān)。它們包括：心肺體外循環(huán)期間的補(bǔ)體激活；急性心肌梗塞、動(dòng)脈瘤、中風(fēng)、出血性休克、擠壓傷、多器官衰竭、低血容量性休克、腸局部缺血后的局部缺血再灌注引起的補(bǔ)體激活。病癥還可以包括的疾病或病情為炎癥病情，如嚴(yán)重?zé)齻?、?nèi)毒素血癥、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征、血液透析、過(guò)敏性休克、嚴(yán)重哮喘、血管性水腫、克羅恩氏病、鐮刀形紅細(xì)胞貧血病、鏈球菌感染后腎小球腎炎和胰腺炎。所述病癥可以是不良藥物反應(yīng)、藥物過(guò)敏、IL-2誘導(dǎo)的血管滲漏綜合癥或放射攝影造影劑過(guò)敏的結(jié)果。所述病癥還包括自身免疫性疾病如全身性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默氏病和多發(fā)性硬化。補(bǔ)體激活還與移植排斥有關(guān)。最近已表明補(bǔ)體激活和眼病如年齡相關(guān)的黃斑變性，糖尿病性視網(wǎng)膜病之間強(qiáng)烈相關(guān)。實(shí)施例提供下列實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，而非進(jìn)行限制。實(shí)施例1：D因子小鼠MAb166-32的人源化。將小鼠mAb166-32的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中可利用的人抗體系序列比較。在如上述步驟1中確定模板時(shí)使用一些標(biāo)準(zhǔn)，包括全長(zhǎng)、框架區(qū)內(nèi)類似的CDR位點(diǎn)、整體同源性、CDR的大小等。所有這些標(biāo)準(zhǔn)一起提供結(jié)果用于選擇最優(yōu)的人模板，如166-32MAb重鏈和輕鏈序列與圖3和4中描述的各個(gè)人模板序列之間的序列比對(duì)所示。在這種情況下，用多個(gè)人框架模板設(shè)計(jì)所述抗體。選擇用于VH鏈的人模板為VI-4.1b+(7-04.1基因座)(登錄號(hào)#X62110)(VH7家族)與JH4d(參見(jiàn)圖3)的組合。選擇用于VL鏈的人模板為DPK4(VKI家族)與JK2的組合(參見(jiàn)圖4)。一旦選擇了模板，通過(guò)DNA合成與重疊PCR構(gòu)建Fab文庫(kù)。文庫(kù)由用各自選擇的人模板合成的MAb166-32CDR組成。編碼部分VH與VL序列的重疊核苷酸在約63至約76個(gè)核苷酸范圍內(nèi)被合成，其具有18至21個(gè)核苷酸重疊。構(gòu)建表達(dá)抗D因子抗原的人源化Fab文庫(kù)的載體，并且轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10B中，隨后在XL-1B細(xì)菌菌苔上鋪板。用規(guī)模(獨(dú)立克隆的數(shù)目)和多樣性(突變體的分布)來(lái)評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量。具有輕鏈和重鏈雙插入的單個(gè)克隆在測(cè)序的20個(gè)中為約14個(gè)?？蚣軘[動(dòng)突變體均勻分布。PCR擴(kuò)增VL和VH基因，利用包含框架區(qū)FR1的序列和與前導(dǎo)序列末端退火的突出端序列(GeneⅢ)的生物素化正向引物，以及來(lái)自保守恒定區(qū)(CK或CH1)的反向引物，在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下進(jìn)行。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或通過(guò)商業(yè)的PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物以去除未反應(yīng)的生物素化引物和非特異性PCR。實(shí)施例2：文庫(kù)篩選用捕獲過(guò)濾挖出法(CaptureFilterLift)進(jìn)行初步篩選。實(shí)際的篩選規(guī)模比理論文庫(kù)的規(guī)模大3倍。候選者進(jìn)一步通過(guò)單點(diǎn)ELISA實(shí)驗(yàn)篩選。基于Fab濃度，利用D因子直接抗原滴定法進(jìn)一步確定最好的結(jié)合劑。捕獲挖出篩選用捕獲過(guò)濾挖出法進(jìn)行Fab結(jié)合D因子的初步篩選。高效價(jià)的噬菌體在37℃中植于平皿中并且孵育直至使用(約6-8小時(shí))。山羊抗-人κ在10mlPBST中稀釋至10μg/ml；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的斑點(diǎn)挖取流程制備用于挖取斑點(diǎn)的硝酸纖維素濾膜，隨后浸入振蕩器上的10ml封閉緩沖液中2小時(shí)。濾膜用PBST漂洗3次。濾膜用于斑點(diǎn)菌苔并且在RT孵育大約15-24小時(shí)。隨后從平皿移去濾膜并且用TBST漂洗3次。D因子(50μg/ml)在PBST中稀釋至0.1μg/ml并且每個(gè)濾膜添加4ml。濾膜在振蕩器上溶液中RT孵育2小時(shí)，隨后漂洗3次，每次5分鐘。稀釋的166-222-HRP(用PBST以1：10,000稀釋)以每個(gè)濾膜4ml的體積添加并且在振蕩器上溫育1小時(shí)。濾膜漂洗4次。干燥濾膜并隨后浸入TMB底物中，接著浸入水中以終止反應(yīng)。鑒定陽(yáng)性克隆。實(shí)施例3：?jiǎn)吸c(diǎn)ELISA篩選用單點(diǎn)ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第二次篩選。用山羊抗-人Fab包被ImmμlonII平皿(1：12,000，50μl/孔)，RT過(guò)夜。第二天用平皿洗滌劑洗滌平皿4次。以每孔l00μl的體積添加封閉緩沖液并且平皿在RT孵育1小時(shí)。隨后洗滌平皿4次。所要篩選的每種Fab以每孔50μl的體積添加(或者來(lái)自15ml周質(zhì)制備物或上清)并且在RT溫育1小時(shí)。洗滌平皿4次，隨后添加0.01μg/ml的50μl/孔生物素化的D因子。在RT孵育平皿1小時(shí)后洗滌4次。添加鏈親和素-HRP(PBST中1：10,000)并且在RT溫育1小時(shí)。洗滌平皿5次，隨后通過(guò)以50μl/孔添加TMB底物而顯影。當(dāng)其很好地顯影(10-45分鐘)時(shí)添加50μl體積的終止緩沖液并且在450nm讀取平皿。實(shí)施例4：人源化抗D因子克隆的測(cè)序?qū)εc人D因子具有良好結(jié)合親和力的16個(gè)人源化克隆測(cè)序(參見(jiàn)表1)。這當(dāng)中，輕鏈中的位點(diǎn)2(100％人)和49(100％小鼠)和重鏈中的位點(diǎn)93(100％小鼠)為高度保守的，表明其對(duì)于維持抗體的結(jié)合能力很重要。表1.來(lái)自人源化文庫(kù)的人源化克隆的氨基酸序列分析VK241343496469VH29389397鼠TVMPSSAIPKTE人IMAVYGTVSRVA7IMMVSSTIPKVE30IVAVSSAVPKTE45IVMVSGAISRVE46IVMVSSTISRVE47IVAVSSTISRVE48IVMVSSTVPRVE50IVMVSGAVPRTE51IMMVSGTISKTE56IVAVSGTVPKTE57IMMVSSAVSRVE58IVMPSGAVPRVE59IVAPSSTVPKVE60IVMPSGTVPRVE63IVMVSSTVSRTE74IVMVSSTISRVE通過(guò)BIAcore分析和溶血抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)估克隆#56。BIAcore分析表明克隆#56具有與嵌合的166-32Fab類似的對(duì)人D因子的親和力(參見(jiàn)表4)。溶血抑制實(shí)驗(yàn)表明克隆#56比嵌合的166-32Fab更加有效力(參見(jiàn)圖6)?？寺?56含有輕鏈框架中的兩個(gè)小鼠殘基以及重鏈中的四個(gè)小鼠殘基(參見(jiàn)表1)?；谶@些結(jié)果，進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。表2.夾自人源化/CDR3優(yōu)化文庫(kù)的優(yōu)化抗體的氨基酸序列分析通過(guò)BIAcore分析表征克隆#111和#114(參見(jiàn)表4)?？寺?104、#111、#114和#130還通過(guò)溶血抑制實(shí)驗(yàn)來(lái)表征(參見(jiàn)圖6)。這些克隆具有比嵌合的166-32更高的親和力，并且如通過(guò)溶血抑制實(shí)驗(yàn)所示，對(duì)抑制旁路途徑比嵌合的Fab更有效(圖7)?？寺?111含有與克隆#56相同的兩個(gè)輕鏈中的小鼠殘基(位點(diǎn)4和49)。如克隆#56中發(fā)現(xiàn)的，其在重鏈位點(diǎn)97處也含有保守的小鼠殘基?？寺?111的輕鏈和重鏈中均存在一個(gè)有益的突變。從兩個(gè)獨(dú)立的篩選文庫(kù)(人源化文庫(kù)和人源化/CDR3優(yōu)化文庫(kù))，發(fā)現(xiàn)最好克隆具有類似的共有序列殘基。為了進(jìn)一步優(yōu)化克隆#111的親和力，通過(guò)將單突變同時(shí)引入CDR-H1和CDR-L2中來(lái)構(gòu)建抗體文庫(kù)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)將編碼單突變的寡核苷酸退火至克隆#111的模板，用定點(diǎn)誘變方法構(gòu)建所述文庫(kù)。對(duì)人D因子具有很高親和力的總共24個(gè)克隆被測(cè)序。在這24個(gè)克隆當(dāng)中，鑒定一些冗余有益突變。選擇克隆#250、#315、#345和#416用于BIAcore分析(參見(jiàn)表4)。BIAcore數(shù)據(jù)表明這些克隆比原始克隆#111對(duì)人D因子的親和力更高?？寺?250、#315、#348和#416也在溶血抑制實(shí)驗(yàn)中(參見(jiàn)圖6)和旁路途徑的抑制中(圖7)測(cè)試。實(shí)施例5：AP溶血實(shí)驗(yàn)利用溶血抑制實(shí)驗(yàn)和BIAcore分析測(cè)定人源化克隆的生物學(xué)功能(參見(jiàn)以下實(shí)施例6)。根據(jù)下列流程進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)。從20ml鹽水(0.9％NaCl)中1∶20稀釋的兔紅血細(xì)胞(RRBC)(0.5ml+9.5mlGVB/Mg-EGTA緩沖液)(大約1:2×104稀釋)，取20μl通過(guò)Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。細(xì)胞濃度隨后調(diào)整至約2-5×104細(xì)胞/ml。每個(gè)平皿接受約500×106/平皿RRBC或約1mlRRBC/平皿(500×106/2-5×104)。細(xì)胞稀釋于6mlGVB/Mg-EGTA緩沖液/平皿，在4℃以1360rpm×4分鐘離心而混合并洗滌3次。RRBC小團(tuán)沉淀物懸浮于3mlGVB/Mg-EGTA緩沖液/平皿中并且保存于冰上。在使用之前融解來(lái)自-80℃冰箱的人血清。血清稀釋于GVB/Mg-EGTA緩沖液中至20％的濃度，5ml/平皿(最終為10％)并且保存于冰上。表3樣品在5-6℃振蕩30秒且隨后在37℃振蕩40分鐘。樣品在振蕩時(shí)冷卻至5-6℃且隨后在4℃，2,000rpm離心3分鐘。轉(zhuǎn)移大約80μl上清液至平底96孔平皿并且利用標(biāo)準(zhǔn)的平皿讀數(shù)器讀取590nm的OD值。如下計(jì)算抑制百分比：％抑制＝{[(S-SB)-(U-SB)]/(S-SB)}×100％。(U＝樣品1、2或3(分別為表3的第1、2或3列))。實(shí)施例6：通過(guò)BiaCore動(dòng)力學(xué)分析抗-人D因子Fab固定：人D因子(AdvancedResearchInc，0.1mg/ml)利用胺-偶聯(lián)方法直接固定在CM5芯片上(BiaCore)。流程簡(jiǎn)要描述如下：(1)恒流(PBS)為5μl/min。(2)注入35μlEDC/NHS(1：1)。(3)注入pH4.5的35μl乙酸鹽緩沖液中的人D因子。(4)注入35μl乙醇胺阻斷激活的組。(5)用5μlpH1.5的10mM甘氨酸凈化表面。配體(人D因子)固定水平為約1,000RU。利用α人D因子(huDi，40μl，31.5μg/ml)檢驗(yàn)產(chǎn)生約900RU的相對(duì)應(yīng)答。動(dòng)力學(xué)分析：所有抗-人D因子Fab稀釋于PBS緩沖液中。每個(gè)樣品用連續(xù)稀釋的方式制備：12.5nM、25nM、50nM、75nM、100nM、125nM和150nM，以高采集率的40μl脈沖注入。通過(guò)施加5μlpH1.5的10mM甘氨酸脈沖實(shí)現(xiàn)再生。通過(guò)在擬一階動(dòng)力學(xué)下利用BIAvaluation3.0版本將Fab結(jié)合痕跡擬合至1：1結(jié)合模型而獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果在以下表4中呈現(xiàn)。通過(guò)全局?jǐn)M合程序獲得所有的數(shù)據(jù)。表4BIAcore結(jié)果Fab克隆本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或僅僅利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定此處所述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等同方案。所述等同方案由下列權(quán)利要求所涵蓋。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3