本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人α-防御素5改造體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗生素耐藥是威脅人類健康的重大科學(xué)問題。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌等廣譜甚至超廣譜耐藥菌的出現(xiàn)使得一些感染的治療相當(dāng)棘手，成為這些感染患者死亡的重要危險(xiǎn)因素。目前耐藥菌突變的速度快于新型抗菌藥物的研發(fā)速度，人類對(duì)于一些耐藥菌感染無能為力，面臨“后抗生素時(shí)代”的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，探尋新型的抗菌藥物，尤其是對(duì)廣譜和超廣譜耐藥菌具有殺菌能力的新藥，已經(jīng)迫在眉睫。

陽離子抗菌肽是一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，是生物體對(duì)抗外界微生物侵襲的一道重要的免疫防線。陽離子抗菌肽的抗菌作用具有殺菌快速、作用廣譜和難以形成抗性的特點(diǎn)，這使得其成為理想的候選新型抗生素。陽離子抗菌肽作用機(jī)理是其帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面結(jié)合，嵌入細(xì)菌的細(xì)胞膜內(nèi)，形成孔洞，破壞其細(xì)胞膜的連續(xù)性，使其細(xì)胞質(zhì)外流，最終導(dǎo)致細(xì)菌的死亡，區(qū)別于傳統(tǒng)抗生素的殺菌靶點(diǎn)如蛋白體、RNA酶等，殺菌效果直接快速強(qiáng)大，且不易誘導(dǎo)傳統(tǒng)的依賴基因突變、水解酶產(chǎn)生等的耐藥性。一些抗菌肽作為抗耐藥細(xì)菌的抗菌素，已進(jìn)入臨床試驗(yàn)(M.Zasloff，Nature，2002，415，389-395)。

人α-防御素5(human defensin-5，HD-5)是一種主要表達(dá)于腸道粘膜的天然陽離子抗菌肽，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等多種細(xì)菌及真菌均具有較強(qiáng)的殺菌作用。此外，HD-5還可以通過調(diào)節(jié)腸道局部炎癥因子的釋放發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。因此，HD-5在腸道免疫屏障中發(fā)揮極其重要作用。

盡管目前HD-5的提取及人工合成已較成熟，但是由于完全仿生天然的HD-5抗菌活性容易受到諸多機(jī)體內(nèi)環(huán)境因素的影響，如生理濃度的氯化鈉的存在即可極大地降低其抗菌活性，限制其成為適宜產(chǎn)業(yè)化開發(fā)生產(chǎn)、臨床應(yīng)用的新型抗菌藥物。

因此，本發(fā)明根據(jù)HD-5的理化性質(zhì)對(duì)HD-5進(jìn)行改造，克服HD-5的功能缺陷，使其有望成為應(yīng)用于臨床的新型抗菌藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種人α-防御素5改造體，在人α-防御素5的C端連接不同長度的脂肪酸鏈，使其成為陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，獲取了作用穩(wěn)定、高效、適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)且具備多種功能的人工抗菌肽。

人α-防御素5改造體，由人α-防御素5在C末端添加氨基酸殘基并修飾連接脂肪酸改造獲得，所添加的氨基酸殘基中至少有一個(gè)氨基酸殘基具有游離氨基，所述游離氨基上修飾連接碳原子數(shù)為8-24的脂肪酸。

本發(fā)明的改造以HD-5為模板，HD-5由32個(gè)氨基酸殘基組成，其中有6個(gè)半胱氨酸，按N端到C端的順序排列，第1個(gè)和第6個(gè)、第2個(gè)和第4個(gè)、第3個(gè)和第5個(gè)半胱氨酸之間分別兩兩形成二硫鍵，一共3個(gè)二硫鍵。本發(fā)明在其C端進(jìn)行了延伸，最終得到了本發(fā)明的改造體。

研究表明，對(duì)HD-5的C端進(jìn)行脂肪酸鏈修飾，能夠顯著提高人α-防御素5的殺菌活性，而且C端修飾得到的改造體較N端修飾具備更強(qiáng)的殺菌能力。

本發(fā)明改造體具備殺菌力強(qiáng)而溶血率低的特點(diǎn)。作為優(yōu)選，所述脂肪酸的碳原子數(shù)為12-14個(gè)。更為優(yōu)選的，所述脂肪酸為肉豆蔻酸或月桂酸。

本發(fā)明通過在C端添加氨基酸延長肽鏈，利于脂肪酸的修飾。作為優(yōu)選，添加的氨基酸殘基的數(shù)量為2-5個(gè)。

脂肪酸的修飾是通過脂肪酸的羧基與C端氨基酸殘基上的游離氨基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。因此，HD-5改造體C端添加氨基酸至少有一個(gè)為至少帶有兩個(gè)氨基的氨基酸，如Lys，其中α氨基用于合成肽鏈的肽鍵，側(cè)鏈上氨基用于脂肪酸鏈的修飾。

作為優(yōu)選，所述改造體的肽鏈由34個(gè)氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為：

Ala¹-Thr²-Cys³-Tyr⁴-Cys⁵-Arg⁶-Thr⁷-Gly⁸-Arg⁹-Cys¹⁰-Ala¹¹-Thr¹²-Arg¹³-Glu¹⁴-Ser¹⁵-Leu¹⁶-Ser¹⁷-Gly¹⁸-Val¹⁹-Cys²⁰-Glu²¹-Ile²²-Ser²³-Gly²⁴-Arg²⁵-Leu²⁶-Tyr²⁷-Arg²⁸-Leu²⁹-Cys³⁰-Cys³¹-Arg³²-Gly³³-Lys³⁴。

作為優(yōu)選，所述改造體的C端羧基酰胺化。

本發(fā)明將上述序列第34位的Lys的C-末端酰胺化，且ε氨基上連接肉豆蔻?；蛟鹿瘐；謩e命名為HD-5Myr和HD-5Lau，研究表明，改造體HD-5Myr和HD-5Lau對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有殺滅作用。HD-5Myr和HD-5Lau可以形成膠束結(jié)構(gòu)，膠束結(jié)構(gòu)的形成使這些肽的單體聚集成納米級(jí)別的顆粒，形成多聚體形式，使正電荷更加集中，其與細(xì)菌的結(jié)合能力更強(qiáng)，從而發(fā)揮更強(qiáng)大的殺菌作用。

本發(fā)明還提供了所述的人α-防御素5改造體在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

針對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 25923，HD-5Myr的LD₉₀值約為HD-5的1/4，HD-5Lau的LD₉₀值約為HD-5的1/3；針對(duì)大腸桿菌ATCC 25922，HD-5Myr的LD₉₀值小于HD-5的1/8，HD-5Lau的LD₉₀值小于HD-5的1/6，表明HD-5Myr和HD-5Lau的殺菌作用強(qiáng)于HD-5。針對(duì)臨床分離的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌菌株MRSA-1，HD-5Myr的LD₉₀值約為HD-5的1/15，HD-5Lau的LD₉₀值約為HD-5的1/4。

HD-5、HD-5Myr和HD-5Lau針對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的LD₉₀值遠(yuǎn)低于金黃色葡萄球菌株ATCC 25923的LD₉₀值，表明其抗菌機(jī)制區(qū)別于傳統(tǒng)的抗生素。因此，可將本發(fā)明的改造體HD-5Myr和HD-5Lau應(yīng)用于制備抗耐藥菌藥物。

在耐鹽能力方面，HD-5Myr顯著強(qiáng)于HD-5Lau和HD-5，即使在生理濃度下(氯化鈉濃度135mM-145mM)仍能發(fā)揮較強(qiáng)的殺菌作用，因此，HD-5Myr可作為抗菌的有效成分應(yīng)用于制備靜脈注射藥物中。

本發(fā)明還提供了所述的人α-防御素5改造體在制備免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。

研究表明，改造體HD-5Myr和HD-5Lau能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子IL-1β，IL-1β在免疫調(diào)節(jié)過程中起重要作用。因此，可將其應(yīng)用到制備免疫調(diào)節(jié)劑中。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含有效量的人α-防御素5改造體和藥學(xué)上可接受的載體。

所述HD-5改造體的血藥濃度達(dá)到25μg/ml時(shí)，即可發(fā)揮高效的殺菌作用，且溶血率較低，是一種理想的代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的抗菌藥物。

本發(fā)明具備的有益效果：

(1)本發(fā)明在人α-防御素5的C末端進(jìn)行延伸和修飾，有效增強(qiáng)其抗菌活性，尤其是針對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，有望成為代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的抗菌藥物。

(2)本發(fā)明得到的改造體HD-5Myr和HD-5Lau可以形成膠束結(jié)構(gòu)，膠束結(jié)構(gòu)的形成使正電荷更加集中，其與細(xì)菌的結(jié)合能力更強(qiáng)，從而發(fā)揮更強(qiáng)大的殺菌作用。

(3)本發(fā)明在人α-防御素5的C末端增加Gly和Lys，并進(jìn)行肉豆蔻酸修飾，顯著提高改造體的耐鹽性。

(4)本發(fā)明的改造體能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，可將其應(yīng)用到免疫調(diào)節(jié)藥物的制備中。

附圖說明

圖1為HD-5及本發(fā)明改造體HD-5Myr和HD-5Lau的透射電鏡圖，其中A為HD-5，B為HD-5Myr，C為HD-5Lau。

圖2為實(shí)施例5中HD-5及改造體在不同氯化鈉濃度條件下的抗菌活性結(jié)果圖。

圖3為實(shí)施例6中HD-5及改造體對(duì)人紅細(xì)胞的溶血作用結(jié)果圖。

圖4為實(shí)施例7中HD-5及改造體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞IL-1β成熟體的釋放結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但下述實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，任何在本發(fā)明基礎(chǔ)上做出的改變和變化，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

HD-5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具體為：

Ala¹-Thr²-Cys³-Tyr⁴-Cys⁵-Arg⁶-Thr⁷-Gly⁸-Arg⁹-Cys¹⁰-Ala¹¹-Thr¹²-Arg¹³-Glu¹⁴-Ser¹⁵-Leu¹⁶-Ser¹⁷-Gly¹⁸-Val¹⁹-Cys²⁰-Glu²¹-Ile²²-Ser²³-Gly²⁴-Arg²⁵-Leu²⁶-Tyr²⁷-Arg²⁸-Leu²⁹-Cys³⁰-Cys³¹-Arg³²，其中，Cys³和Cys³¹、Cys⁵和Cys²⁰、Cys¹⁰和Cys³⁰之間分別形成分子內(nèi)二硫鍵。

本發(fā)明的改造體HD-5Myr和HD-5Lau是在HD-5分子基礎(chǔ)上，在其C-端進(jìn)行改造而獲得的。HD-5Myr和HD-5Lau的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

HD-5Myr由34個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為3976.8Da。

HD-5Myr的氨基酸序列為：

Ala¹-Thr²-Cys³-Tyr⁴-Cys⁵-Arg⁶-Thr⁷-Gly⁸-Arg⁹-Cys¹⁰-Ala¹¹-Thr¹²-Arg¹³-Glu¹⁴-Ser¹⁵-Leu¹⁶-Ser¹⁷-Gly¹⁸-Val¹⁹-Cys²⁰-Glu²¹-Ile²²-Ser²³-Gly²⁴-Arg²⁵-Leu²⁶-Tyr²⁷-Arg²⁸-Leu²⁹-Cys³⁰-Cys³¹-Arg³²-Gly³³-Lys³⁴-NH₂，其中，Cys³和Cys³¹、Cys⁵和Cys²⁰、Cys¹⁰和Cys³⁰之間分別形成分子內(nèi)二硫鍵。第34位為一個(gè)Lys，其ε氨基上連接一個(gè)肉豆蔻?；?/p>

HD-5Lau由34個(gè)氨基酸組成，分子量為3948.7Da。

HD-5Lau的氨基酸殘序列為：

Ala¹-Thr²-Cys³-Tyr⁴-Cys⁵-Arg⁶-Thr⁷-Gly⁸-Arg⁹-Cys¹⁰-Ala¹¹-Thr¹²-Arg¹³-Glu¹⁴-Ser¹⁵-Leu¹⁶-Ser¹⁷-Gly¹⁸-Val¹⁹-Cys²⁰-Glu²¹-Ile²²-Ser²³-Gly²⁴-Arg²⁵-Leu²⁶-Tyr²⁷-Arg²⁸-Leu²⁹-Cys³⁰-Cys³¹-Arg³²-Gly³³-Lys³⁴-NH₂，其中，Cys³和Cys³¹、Cys⁵和Cys²⁰、Cys¹⁰和Cys³⁰之間分別形成分子內(nèi)二硫鍵。第34位為一個(gè)Lys，其ε氨基上連接一個(gè)月桂?；?。

此外，在HD-5基礎(chǔ)上，在其N-端進(jìn)行改造，獲得的改造體，命名為MyrHD-5。MyrHD-5由33個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為3849.6Da。

MyrHD-5的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具體為：

Gly¹-Ala²-Thr³-Cys⁴-Tyr⁵-Cys⁶-Arg⁷-Thr⁸-Gly⁹-Arg¹⁰-Cys¹¹-Ala¹²-Thr¹³-Arg¹⁴-Glu¹⁵-Ser¹⁶-Leu¹⁷-Ser¹⁸-Gly¹⁹-Val²⁰-Cys²¹-Glu²²-Ile²³-Ser²⁴-Gly²⁵-Arg²⁶-Leu²⁷-Tyr²⁸-Arg²⁹-Leu³⁰-Cys³¹-Cys³²-Arg³³，其中，Cys⁴和Cys³²、Cys⁶和Cys²¹、Cys¹¹和Cys³¹之間分別形成分子內(nèi)二硫鍵。第1位為一個(gè)Gly，其氨基上連接一個(gè)肉豆蔻酰基。

實(shí)施例2

上述實(shí)施例1的HD-5和HD-5Myr由“上海吉爾多肽有限公司”合成。上述實(shí)施例1的HD-5Lau和MyrHD-5由“杭州中肽生化有限公司”合成。

實(shí)施例3

抗菌肽的抗菌活性測定，比較實(shí)施例2合成的HD-5的改造體HD-5Myr、HD-5Lau及MyrHD-5與天然HD-5的抗菌作用的強(qiáng)弱。

依據(jù)Ericksen等2005年報(bào)道的檢測抗菌肽抗菌活性的方法(Ericksen B,et al.,Antibacterial activity and specificity of the six human{alpha}-defensins.Antimicrob Agents Chemother,2005)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將細(xì)菌接種在LB瓊脂平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落。挑取單菌落，接種到5mlLB培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)4-6小時(shí)。用無菌水洗滌2次。在多功能酶標(biāo)儀上測定600nm處的吸光值，1OD₆₀₀＝4×10⁸CFU/ml，將受試細(xì)菌用無菌水稀釋至2×10⁶CFU/ml。

在無菌96孔板中每孔加入50μl無菌水，然后在A1孔中加入稀釋到一定濃度的抗菌肽HD-5樣品?；靹蚝笕?0μl加入A2孔，依次倍比稀釋，最后從A6孔吸出50μl棄去。同樣的方法稀釋MyrHD-5、HD-5Myr和HD-5Lau樣品。對(duì)照孔為50μl無菌水。然后各個(gè)孔分別加入50μl的2×10⁶CFU/ml細(xì)菌。37℃恒溫振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。然后分別加入100μl的2倍濃度的LB培養(yǎng)基。在酶標(biāo)儀中恒溫37℃，并每間隔5分鐘測量一次600nm處吸光值。

將所得吸光值減去0時(shí)刻的吸光值，并取對(duì)數(shù)。于坐標(biāo)系中以時(shí)間為橫坐標(biāo)、以O(shè)D值的變化值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，所得的點(diǎn)在對(duì)數(shù)生長期中呈線性。根據(jù)此線性規(guī)律，計(jì)算出不同組的殺菌率。并依據(jù)各個(gè)不同濃度的殺菌率計(jì)算出殺滅90％的細(xì)菌時(shí)所需要的抗菌肽的濃度，稱之為LD₉₀。HD-5及MyrHD-5、HD-5Myr和HD-5Lau對(duì)不同菌種的的LD₉₀見下表1。

表1、抗菌肽HD-5及其改造體的抗菌活性

所述的大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)，MRSA-1為臨床分離得到的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌菌株。

由表1可見，HD-5Myr和HD-5Lau對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌及臨床分離菌株MRSA-1均具有殺滅作用，且改造體HD-5Myr和HD-5Lau的作用均強(qiáng)于野生肽HD-5。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的HD-5Myr和HD-5Lau的抗菌活性，無論是對(duì)革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌，抑或革蘭氏陰性大腸桿菌，還是臨床分離得到的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌，均明顯高于天然HD-5，而且HD-5Myr和HD-5Lau對(duì)MRSA的抗菌能力強(qiáng)于對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌菌株ATCC 25923，表明其抗菌機(jī)制可能區(qū)別于傳統(tǒng)抗生素。

MyrHD-5和HD-5Myr均為HD-5分子肉豆蔻?；揎椇蟮母脑祗w，MyrHD-5是在N端修飾，HD-5Myr是在C端修飾，而HD-5Myr的殺菌能力顯著強(qiáng)于MyrHD-5。且MyrHD-5殺滅大腸桿菌ATCC 25922菌株的能力甚至弱于HD-5。說明了對(duì)HD-5分子C端進(jìn)行脂肪酸修飾更有利于其發(fā)揮殺菌作用。

實(shí)施例4

抗菌肽HD-5的改造體HD-5Myr和HD-5Lau可以形成膠束結(jié)構(gòu)，更有利于其發(fā)揮殺菌作用。

分別取少許HD-5、HD-5Myr和HD-5Lau樣品滴在電鏡用銅網(wǎng)上，用濾紙吸掉多余樣品，室溫干燥后，使用醋酸雙氧鈾染色。后置于透射電子顯微鏡中觀察。

如附圖1A所示，在天然HD-5中未觀測到膠束結(jié)構(gòu)。如附圖1B中箭頭所示，HD-5Myr可以形成膠束結(jié)構(gòu)。如附圖1C中箭頭所示，大小均一的球狀顆粒物為膠束結(jié)構(gòu)，說明HD-5Lau可以形成膠束結(jié)構(gòu)。膠束結(jié)構(gòu)的形成使這些肽的單體聚集成納米級(jí)別的顆粒，形成多聚體形式，使正電荷更加集中，其與帶負(fù)電荷的細(xì)菌的結(jié)合能力更強(qiáng)，使其更有利于穿透細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而發(fā)揮更強(qiáng)的殺菌作用。

實(shí)施例5

抗菌肽HD-5及其改造體HD-5Myr和HD-5Lau的抗菌活性對(duì)鹽的耐受能力的強(qiáng)弱。

依據(jù)Ericksen等2005年報(bào)道的檢測抗菌肽抗菌活性的方法(Ericksen B,et al.,Antibacterial activity and specificity of the six human{alpha}-defensins.Antimicrob Agents Chemother,2005)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將大腸桿菌接種在LB瓊脂平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落。挑取單菌落，接種到5ml LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)4-6小時(shí)。用無菌水洗滌2次。在多功能酶標(biāo)儀上測定600nm處的吸光值，1OD₆₀₀＝4×10⁸CFU/ml，將受試細(xì)菌用無菌水稀釋至2×10⁶CFU/ml。

分別在A1至A6孔中加入25μl一定濃度的NaCl溶液。然后各個(gè)孔分別加入25μl的100μg/ml的HD-5溶液。同樣的方法用于HD-5Myr組和HD-5Lau組。對(duì)照孔為25μl不同濃度的鹽溶液與25μl無菌水的混合液。然后向各個(gè)孔中加入50μl的2×10⁶CFU/ml大腸桿菌(ATCC25922)。37℃恒溫振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。然后分別加入100μl的2倍濃度的LB培養(yǎng)基。在酶標(biāo)儀中恒溫37℃，并每間隔5分鐘測量一次600nm處吸光值。

將所得吸光值減去0時(shí)刻的吸光值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值的變化量為縱坐標(biāo)作圖。根據(jù)曲線到達(dá)某一個(gè)OD值的時(shí)間的長短，來推斷其0時(shí)刻的細(xì)菌存活量的多少，進(jìn)而推斷其殺菌作用受到鹽的影響的大小。

如附圖2所示，HD-5Myr的耐鹽能力顯著強(qiáng)于HD-5和HD-5Lau。即使在生理濃度氯化鈉溶液(135mM-145mM)情況下，HD-5Myr仍可以發(fā)揮較強(qiáng)的殺菌作用。

實(shí)施例6

抗菌肽HD-5及改造體HD-5Myr和HD-5Lau對(duì)人紅細(xì)胞的溶血作用測定

1)取新鮮人血，肝素化后離心取紅細(xì)胞層。

2)用PBS洗滌3次。

3)在EP管中分別加入終濃度分別為50μg/ml、25μg/ml的HD-5及改造體。陽性對(duì)照組加入等體積10％Triton X-100。陰性對(duì)照組加入等體積PBS。

4)分別加入4％的人紅細(xì)胞，37℃孵育1小時(shí)。

5)離心，取等量上清至96孔板中，測量540nm處的OD值，以陽性對(duì)照組為100％溶血，以陰性對(duì)照組為0％溶血，計(jì)算各孔的溶血率。

結(jié)果如附圖3所示，在遠(yuǎn)高于LD₉₀的濃度25μg/ml時(shí)，HD-5Myr的溶血率為6.83％，HD-5Lau的溶血率為2.24％。這說明改造體HD-5Myr和HD-5Lau均有較為廣闊的安全范圍，非常有利于在醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用。

實(shí)施例7

抗菌肽的改造肽發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用，促進(jìn)炎癥因子IL-1β的釋放

1)用加入10％的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基養(yǎng)THP-1細(xì)胞，在其對(duì)數(shù)期時(shí)，接種在24孔板上，每孔10⁶個(gè)細(xì)胞。加入終濃度為100nM的PMA刺激12小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。

2)用加入10％的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基換液，靜置24小時(shí)。

3)組別設(shè)置有：空白組、LPS刺激組、LPS+5mM ATP組(陽性對(duì)照組)、LPS+HD-5組、LPS+HD-5Myr組、LPS+HD-5Lau組。用或者不用終濃度為100ng/ml的脂多糖(LPS)刺激3h，然后使用1640培養(yǎng)基輕柔洗滌2次，再加入或者不加終濃度為10μg/ml及20μg/ml的HD-5Myr或HD-5Lau或終濃度為5mM的ATP，或者終濃度為100μg/ml及200μg/ml的HD-5，刺激3h后，收集各組的上清。

4)將各組等量的上清中的蛋白濃縮，用蛋白裂解液裂解后，用免疫印跡法比較不同組別間IL-1β成熟體的釋放情況。

如附圖4所示，LPS+5mM ATP組(陽性對(duì)照組)、LPS+HD-5組、LPS+HD-5Myr組、LPS+HD-5Lau組均有IL-1β成熟體的釋放，證明HD-5、HD-5Myr和HD-5Lau能夠促進(jìn)IL-1β成熟體的釋放，而HD-5Myr和HD-5Lau的濃度遠(yuǎn)低于HD-5，表明改造體HD-5Myr和HD-5Lau的免疫調(diào)節(jié)活性遠(yuǎn)高于HD-5。