本發(fā)明屬于環(huán)境生物技術(shù)和工程領(lǐng)域，具體涉及一種殼聚糖/微介分子篩固定化漆酶制備方法、一種含酚廢水的降解方法。

背景技術(shù)：

漆酶是一類(lèi)含銅多酚氧化酶，其利用分子氧為電子受體將其還原成水。漆酶的底物相當(dāng)寬泛，能催化氧化水中多種難降解有機(jī)污染物，工業(yè)中的一個(gè)重要的應(yīng)用是酚類(lèi)的除去，此外還包括酚類(lèi)衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、激素、生物色素和多環(huán)芳烴等。

漆酶的研究已經(jīng)越來(lái)越引起環(huán)境微生物學(xué)學(xué)者的重視，但是仍存在一些問(wèn)題，如催化效率低，使用成本過(guò)高等，阻礙了漆酶的在水處理工業(yè)界的廣泛應(yīng)用。

固定化酶是將游離酶用物理或化學(xué)方法處理，使之不溶于水，能在一定的空間范圍內(nèi)起酶催化作用，固定化酶與游離酶相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：不僅能保持酶催化高效和專(zhuān)一性，而且能大大提高酶的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，可回收，易分離，能夠重復(fù)使用，使用效率高，成本低等。固定化酶可以用于各種類(lèi)型的反應(yīng)器，特別在工業(yè)廢水處理等方而的應(yīng)用前景更為廣闊。

固定化酶制備方法物理法包括吸附法、包埋法等，其優(yōu)點(diǎn)在于酶不參加化學(xué)反應(yīng)，整體結(jié)構(gòu)完整，催化活性得到很好保留。目前使用的載體有：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔性玻璃、環(huán)氧乙烷丙烯酸顆粒和親水性微濾膜、硅膠、多孔玻璃、介孔SiO₂、納米材料等。

固定化酶制備化學(xué)法包括結(jié)合法、交聯(lián)法等。結(jié)合法又分為離子結(jié)合法和共價(jià)結(jié)合法，是將酶通過(guò)化學(xué)鍵連接到天然的或合成的高分子載體上，使用偶聯(lián)劑通過(guò)酶表面的基團(tuán)將酶交聯(lián)起來(lái)，而形成相對(duì)分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。

含酚廢水主要來(lái)自合成苯酚、合成染料、有機(jī)農(nóng)藥和酚醛樹(shù)脂生產(chǎn)過(guò)程。主要污染物有酚基化合物，如苯酚、甲酚、二甲酚和硝基甲酚等。目前國(guó)內(nèi)含酚廢水的處理技術(shù)有物理法、化學(xué)法和生物法。其中物理法包括焚燒法、萃取法、蒸汽法、吸附法等；化學(xué)法有化學(xué)氧化法、高級(jí)氧化法(UV、Fenton)、化學(xué)沉淀法、離子交換法、液膜法等；生物法包括活性污泥法、生物濾池法、接觸氧化法等。上述方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，尋求穩(wěn)定、可靠和安全含酚廢水的處理方法仍是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種殼聚糖/微介分子篩固定化漆酶制備方法，以具有微介雙孔ZSM-5分子篩為載體，采用物理吸附固定化漆酶，以殼聚糖包裹固定化漆酶的ZSM-5分子篩，制作固定化小球，不易脫落，穩(wěn)定性好。

本發(fā)明還提供了一種含酚廢水的的降解方法，利用殼聚糖/微介分子篩固定化漆酶，降解效率高。

本發(fā)明提供的一種殼聚糖/微介分子篩固定化漆酶制備方法，包括以下步驟:

(1)改性ZSM-5沸石；

(2)將改性得到的ZSM-5分子篩與漆酶粗酶液混合，離心分離留沉淀，用緩沖溶液洗滌沉淀，得到Lac@ZSM-5；

(3)將殼聚糖CS與醋酸HAC溶液混合，得到CS/HAC膠體溶液；

(4)將CS/HAC膠體溶液與Lac@ZSM-5混合，得到漿狀混合物；

(5)將漿狀混合物逐滴加入到NaOH溶液中，得Lac@ZSM-5/CS小球，于pH為4.5的緩沖溶液中靜置過(guò)夜，充分溶漲，用蒸餾水洗滌至中性，置于冰箱冷藏中低溫干燥，得到殼聚糖/微介分子篩固定化漆酶小球。

進(jìn)一步的，步驟(1)改性方法為：將ZSM-5沸石，置于NaOH溶液中，攪拌，干燥后，過(guò)濾后洗滌，再干燥，得到具有微介雙孔結(jié)構(gòu)分布的改性ZSM-5分子篩。

進(jìn)一步的，步驟(1)中ZSM-5沸石與NaOH溶液的用量比為1:50-80g/mL；所述ZSM-5沸石的硅鋁比(SiO₂/Al₂O₃)＝18-30；相對(duì)結(jié)晶度：Na型>85％；孔徑：NaOH溶液的濃度為0.3-0.5mol/L；所述攪拌為室溫條件下攪拌20-40min；第一次干燥于50℃處理3-4h；過(guò)濾是指0.45um的過(guò)濾膜過(guò)濾；第二次干燥：110℃真空干燥箱中干燥10-12h。

步驟(2)中改性得到的ZSM-5分子篩與漆酶粗酶液的用量比為1:1g/mL；漆酶粗酶液的酶量為800-1000U/mL；混合條件為：25℃攪拌10-12h；所述緩沖溶液為pH為4.5的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液。

步驟(2)離心分離具體方法為：將ZSM-5分子篩與漆酶粗酶液混合后的溶液離心，離心機(jī)4000r/min、離心5-10min；

步驟(2)中確定產(chǎn)物的方法為：離心后，取上清液1mL加入1.0mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液中，至檢測(cè)不到酶活(無(wú)紫外吸收)，即得到固定漆酶的Lac@ZSM-5樣品。所述1mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液制備方法為：取愈創(chuàng)木酚0.061g，用1ml的乙醇進(jìn)行溶解用緩沖溶液定容至500mL得到。

步驟(3)具體為：在25-50℃稱(chēng)取殼聚糖CS溶解于溶于0.1mol/L的醋酸溶液HAC中，攪拌2-3h后，得到CS/HAC膠體溶液；殼聚糖CS與醋酸溶液的用量比為1:80-120g/mL；所述殼聚糖脫乙酰度85％。

步驟(4)具體為：Lac@ZSM-5與CS/HAC膠體溶液的用量比為1：40-60g/ml。

步驟(4)中，CS/HAC膠體溶液與Lac@ZSM-5混合過(guò)程為，先在40-60KHz的超聲波浴中30min；再在50r/min速度下攪拌30min制得漿狀混合物。

步驟(5)中NaOH溶液濃度0.25mol/L；所述Lac@ZSM-5/CS小球直徑1-2mm。

檢測(cè)殼聚糖/微介分子篩固定化漆酶(Lac@ZSM-5/CS)活性400-520U/g；Lac@ZSM-5/CS小球的酶學(xué)性質(zhì)如下：最適pH值為4.5，在pH值為3.0-6.5間均能保持較高相對(duì)活性(59.5％-86.4％)，最適溫度是55℃，溫度為35-65℃時(shí)相對(duì)酶活約為77.5-89.2％，6批次后酶相對(duì)活性保留約42.3％；測(cè)得Lac@ZSM-5/CS小球的米氏常數(shù)K_m為2.182mmol/L(游離漆酶為2.054mmol/L)。

一種含酚廢水的降解方法，包括以下步驟：

將Lac@ZSM-5/CS小球投入到含酚廢水中，攪拌后，加入NaOH溶液將pH調(diào)至9.0-10.0，終止反應(yīng)。

具體的，含酚廢水濃度為40-60mg/L；Lac@ZSM-5/CS小球的堆積體積/廢水的體積＝35-45％。所述攪拌是指25℃下攪拌反應(yīng)2-3h。

所述含酚廢水為含苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚或2，4-二氯苯酚的廢水。

所述NaOH溶液的濃度為0.1mol/L。

降解檢測(cè)：

用苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、2，4-二氯苯酚四種物質(zhì)配置濃度均為50mg/L的混合酚廢水；向廢水中投加Lac@ZSM-5/CS小球(小球的堆積體積/廢水的體積＝35-45％)，在室溫25℃下磁力攪拌反應(yīng)2.5h，反應(yīng)后的溶液用0.1mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至9.0-10.0，終止反應(yīng)；

過(guò)濾調(diào)節(jié)過(guò)后的溶液，用HPLC檢測(cè)苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚和2,4-二氯苯酚的濃度，計(jì)算去除率。經(jīng)過(guò)計(jì)算四種物質(zhì)的降解率分別為36.8-40.2％、82.5-87.5％、30,7-33.2％和73.4-85.2％。

本發(fā)明以具有微介雙孔ZSM-5分子篩為載體，采用物理吸附固定化漆酶，以殼聚糖包裹固定化漆酶的ZSM-5分子篩，制作固定化小球，解決了分子篩對(duì)漆酶吸附良好性能但對(duì)酶負(fù)載不穩(wěn)固易脫落，殼聚糖具有良好的生物兼容性和適應(yīng)性但是酶固定化面積小固定化效率低缺點(diǎn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的殼聚糖/微介分子篩固定化漆酶特點(diǎn)為：(1)以ZSM-5分子篩作為骨架，可明顯增強(qiáng)載體的力學(xué)強(qiáng)度；外包裹殼聚糖，可使酶不易從載體上滲出；分子篩比表面大，可極大地提升固定化漆酶容量，同時(shí)殼聚糖表面多孔疏松結(jié)構(gòu)、介孔與微孔良好的相通性，不僅可縮短污染物和生成物在分子篩孔道中的擴(kuò)散距離，而且能明顯提高傳質(zhì)性能，強(qiáng)化污染物的降解速率；(2)固定化酶對(duì)強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境的抵抗能力強(qiáng)，在pH值為3.0-6.5間均能保持較高相對(duì)活性(59.5％-86.4％)，溫度為35-65℃時(shí)相對(duì)酶活約為77.5-89.2％，6批次后酶相對(duì)活性保留約42.3％，活力回收率高，表明Lac@ZSM-5/CS小球的具有較好的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和一定的操作穩(wěn)定性。；(3)固定化漆酶用于含混合酚廢水的處理有明顯的效果，對(duì)苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚和2,4-二氯苯酚的濃度具有較好的去除率，是一種可靠、安全含酚廢水的處理新方法。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種殼聚糖/微介分子篩固定化漆酶制備方法，包括以下步驟:

(1)取5.0g商用ZSM-5沸石(硅鋁比(SiO₂/Al₂O₃)＝18-30；相對(duì)結(jié)晶度：Na型>85％；孔徑：)，置于250mL的0.4mol/L的NaOH溶液中，室溫條件下攪拌40min；轉(zhuǎn)入真空干燥箱，于50℃處理3h，過(guò)0.45um濾膜過(guò)濾，用去離子水洗滌，置于110℃真空干燥箱中干燥12h，得到改性ZSM-5分子篩；

(2)取5.0g改性ZSM-5分子篩與5mL 820U/mL的漆酶粗酶液于25℃攪拌10h，用離心機(jī)4000r/min、離心5min進(jìn)行分離；用pH為4.5的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液洗滌沉淀，取上清液1mL加入1.0mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液中，至檢測(cè)不到酶活，得到Lac@ZSM-5。

(3)在50℃稱(chēng)取2.5g殼聚糖(脫乙酰度85％)溶解于溶于200ml的0.1mol/L的醋酸溶液中，攪拌2h后，得到膠體溶液。

(4)往該溶液中加入5g Lac@ZSM-5，保持在頻率為40KHZ的超聲波浴中30min，繼續(xù)高速攪拌30min制得漿狀混合物。

(5)用針形注射器滴加該漿狀混合物到0.25mol/L NaOH溶液中，得到直徑約1mm的固定化漆酶小球，將小球加入100mL錐形瓶中,用緩沖液充分溶漲，靜置過(guò)夜，用蒸餾水洗滌至中性，置于冰箱冷藏中低溫干燥，然后于4℃下保存。進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定：最適pH值為4.5，最適溫度是55℃，6批次后酶相對(duì)活性保留約45.3％。

用鄰苯二酚、間苯二酚、2,4-二氯苯酚三種物質(zhì)配置濃度均為40mg/L的混合含酚廢水。向廢水中投加固定化漆酶小球(小球的堆積體積/廢水的體積＝40％)在室溫25℃下磁力攪拌反應(yīng)2.5h，反應(yīng)后的溶液用0.1mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至9.0，終止反應(yīng)；過(guò)濾調(diào)節(jié)過(guò)后的溶液，將固定化漆酶小球?yàn)V出后，通過(guò)HPLC檢測(cè)鄰苯二酚、間苯二酚和2,4-二氯苯酚的濃度，經(jīng)過(guò)計(jì)算三種物質(zhì)的降解率分別為83.8％、32.2％和77.9％。

固定化漆酶載體酶活測(cè)定：取4mL、1mmol/L的愈創(chuàng)木酚于試管中，加入1g固定化漆酶，混合均勻后于30℃水浴反應(yīng)30min，測(cè)定其在波長(zhǎng)465nm下吸光度(OD₄₆₅)值。對(duì)照管中加入1g未固定化漆酶載體和4mL底物，酶活的計(jì)算公式如下式所示，定義1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1umol底物所需的固定漆酶量為一個(gè)漆酶活力單位(U/g)：

其中式中：—(愈創(chuàng)木酚)＝1.21L/(mol/cm)；

Δt—為酶反應(yīng)時(shí)間，min；

ΔOD—為吸光度的變化值；

V—為比色皿中溶液的總體積，mL；

m—為參加反應(yīng)固定化漆酶的質(zhì)量，g；

N—為酶液稀釋倍數(shù)；

L—為比色皿光徑，cm；

固定化酶載體酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定：

熱穩(wěn)定性：制備所得Lac@ZSM-5/CS小球置于30℃-70℃的水浴中保溫90min，取樣檢測(cè)其酶活性；

pH穩(wěn)定性：制備所得Lac@ZSM-5/CS小球，懸浮于不同pH的緩沖溶液中，室溫條件下保存3小時(shí)，取樣檢測(cè)其酶活性。

操作穩(wěn)定性：采用Lac@ZSM-5/CS小球與底物進(jìn)行反應(yīng)6-10次，取樣檢測(cè)其酶活性。

其中：為便于考察變量對(duì)酶活的影響，以同組實(shí)驗(yàn)中酶活最高值為100％進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

K_m的值的計(jì)算：按Linewaever-Burk雙倒數(shù)法，以底物濃度的倒數(shù)為為橫坐標(biāo)，以酶反應(yīng)初速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，即反應(yīng)后測(cè)定吸光度值A(chǔ)，以吸光度值的倒數(shù)1/A代表其反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V作為縱坐標(biāo)(3min)，以底物的濃度倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo)，作圖以求出自由漆酶和固定化漆酶的K_m值。

$v=\frac{V\[S\]}{Km+\[S\]}$

其中，v-反應(yīng)初速度(微摩爾濃度變化/min)；

V-最大反應(yīng)速度(微摩爾濃度變化/min)；

[S]-底物濃度(mol/L)；

K_m-米氏常數(shù)(mol/L)。

HPLC分析條件：使用日本島津：LC-20A HPLC系統(tǒng)，色譜柱：WondaSil C18-WR 4.6×250mm，5μm。檢測(cè)器：SPD-M20A，分析條件：流動(dòng)相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0-15min，55％；15-18min，55％；18-20min，30％)，等梯度洗脫流速1mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)277nm。

實(shí)施例2

一種殼聚糖/微介分子篩固定化漆酶制備方法，包括以下步驟:

(1)10.0g商用ZSM-5沸石(硅鋁比(SiO₂/Al₂O₃)＝18-30；相對(duì)結(jié)晶度：Na型>85％；孔徑：)，置于600mL的0.5mol/L的NaOH溶液中，室溫條件下攪拌40min；轉(zhuǎn)入真空干燥箱，于50℃處理4h，過(guò)0.45um濾膜過(guò)濾，用去離子水洗滌，置于110℃真空干燥箱中干燥12h，得到改性ZSM-5分子篩；

(2)取5.0g改性ZSM-5分子篩與10mL 930U/mL的漆酶粗酶液于25℃攪拌12h，用離心機(jī)4000r/min、離心7min進(jìn)行分離；用pH為4.5的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液洗滌沉淀，取上清液1mL加入1.0mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液中，至檢測(cè)不到酶活，得到固定漆酶的樣品。

(3)在50℃稱(chēng)取5g殼聚糖(脫乙酰度85％)溶解于溶于400ml的0.1mol/L的醋酸溶液中，攪拌2h后，得到膠體溶液。

(4)往該溶液中加入10g上述固定化酶樣品，保持在頻率為40KHZ的超聲波浴中約30min，繼續(xù)高速攪拌30min制得漿狀混合物。

(5)用針形注射器滴加該漿狀混合物到0.25mol/L NaOH溶液中，得到直徑約1mm的固定化漆酶小球，將小球加入100mL錐形瓶中,用緩沖液充分溶漲，靜置過(guò)夜，用蒸餾水洗滌至中性，置于冰箱冷藏中低溫干燥，然后于4℃下保存。

進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定：最適pH值為4.5，最適溫度是55℃，6批次后酶相對(duì)活性保留約47.7％；用苯酚、間苯二酚、2,4-二氯苯酚三種物質(zhì)配置濃度均為50mg/L的混合含酚廢水。向廢水中投加固定化漆酶小球(小球的堆積體積/廢水的體積＝35％)，在室溫25℃下磁力攪拌反應(yīng)2.5h，反應(yīng)后的溶液用0.1mol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至9.0，終止反應(yīng)；過(guò)濾調(diào)節(jié)過(guò)后的溶液，將固定化漆酶小球?yàn)V出后，通過(guò)HPLC檢測(cè)鄰苯二酚、間苯二酚和2,4-二氯苯酚的濃度，經(jīng)過(guò)計(jì)算三種物質(zhì)的降解率分別為38.3％、86.2％和83.1％。