本發(fā)明屬于生物技術(shù)藥物領(lǐng)域，具體涉及一種跨血腦屏障蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體；本發(fā)明還涉及該蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國(guó)腦梗塞、腦出血等腦相關(guān)疾病的年新發(fā)患者在200萬(wàn)～250萬(wàn)之間，年死亡人數(shù)高達(dá)150萬(wàn)人，且仍以每年8.7％的速度遞增。超過(guò)500萬(wàn)腦損傷恢復(fù)期的幸存者(約占全國(guó)患者的75％)伴有不同程度智力障礙、感覺(jué)障礙、和運(yùn)動(dòng)障礙等嚴(yán)重殘疾。我國(guó)衛(wèi)生部經(jīng)濟(jì)研究所的調(diào)查表明，我國(guó)每年用于治療腦損傷的費(fèi)用達(dá)1000多億，這給社會(huì)和家庭帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但如何促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)，降低病殘率，提高恢復(fù)期患者的生活質(zhì)量，仍是一個(gè)亟待解決的世界性難題。

成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷后存在再生與修復(fù)困難，因?yàn)樵谀X缺血性損傷相關(guān)疾病、脊髓損傷、以及多種神經(jīng)病變的情況下，CNS功能恢復(fù)非常有限。目前認(rèn)為CNS再生困難的原因之一是促進(jìn)神經(jīng)再生的營(yíng)養(yǎng)因子不足。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一類(lèi)分泌蛋白，由N端信號(hào)肽序列、C端(含有發(fā)揮生物活性序列)及兩端間的N連接糖基化位點(diǎn)序列等組成。BDNF可明顯減少中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型大鼠的梗塞面積，增加皮質(zhì)神經(jīng)元對(duì)葡萄糖和氧的利用，通過(guò)減少氧化應(yīng)激損傷改善因缺血中風(fēng)引起的神經(jīng)元變性。在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的大分子蛋白藥物研究中，由于血腦、血脊屏障等的存在，大于6個(gè)氨基酸的多肽一般不能穿過(guò)這些屏障，難以達(dá)到有效的藥物治療濃度。因此，通過(guò)尋找合適的物質(zhì)修飾BDNF或充當(dāng)其載體，以借助血腦屏障上的內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，是比較可行的實(shí)現(xiàn)BDNF跨血腦屏障運(yùn)輸?shù)耐緩健?/p>

二十二碳六烯酸(DHA,C22:6,Δ4.7.10.13.16.19)，是ω-3不飽和脂肪酸家族中的重要成員，其末端連有一個(gè)羧基。多項(xiàng)研究證實(shí)，DHA對(duì)記憶、思維、智力等至關(guān)重要。DHA為機(jī)體自身代謝所需物質(zhì)，主要富集在大腦皮層中(含量高達(dá)20％)，是維持神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及腦組織正常功能化的一種主要物質(zhì)。就DHA代謝而言，血腦屏障能將其從血液中分離出來(lái)，使其跨過(guò)血腦屏障在腦組織中積累。研究證明，DHA在腦組織中積累可以保護(hù)腦組織免受癲癇發(fā)作時(shí)誘發(fā)的氧化應(yīng)激的影響，減少血小板凝集及血栓素的形成進(jìn)而能預(yù)防腦梗塞的發(fā)生，減輕因缺血性中風(fēng)造成的急性炎癥反應(yīng)及損傷，加速膽固醇的排泄，對(duì)高血壓和動(dòng)脈硬化等心血管疾病有一定的治療作用?；贒HA能自由跨越血腦屏障、能在腦組織中富集、有腦靶向性、有腦保護(hù)作用、能被機(jī)體自身代謝利用及無(wú)生物毒性的優(yōu)勢(shì)，其完全滿(mǎn)足跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)BDNF的要求。

目前尚無(wú)僅以DHA直接修飾蛋白構(gòu)建一種腦靶向且跨血腦屏障蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體的報(bào)道，更無(wú)利用人體所需的、生物安全性高的不飽和脂肪酸作為靶向轉(zhuǎn)運(yùn)載體和腦損傷治療物質(zhì)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種跨血腦屏障蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體，解決大于6個(gè)氨基酸的多肽一般不能穿過(guò)血腦、血脊屏障，難以達(dá)到有效的藥物治療濃度的問(wèn)題。

本發(fā)明的第二目的是提供一種跨血腦屏障蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體的制備方法。

本發(fā)明的第三目的是提供一種跨血腦屏障蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體的應(yīng)用。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種跨血腦屏障蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體，由以下部分組成：

靶向配體，為DHA；

示蹤基團(tuán)，為GFP，其氨基酸序列見(jiàn)序列表中1；

連接基團(tuán)，靶向配體上的羧基與帶有GFP示蹤信號(hào)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子氨基酸殘基側(cè)鏈上的氨基相連接；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的氨基酸序列見(jiàn)序列表中2。

本發(fā)明的特征還在于，

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的C端連接了GGGS-GFP；其中，GGGS為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與GFP之間的linker序列，GGGS的氨基酸序列見(jiàn)序列表中3。

DHA與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的摩爾比為100:1。

本發(fā)明所采用的第二個(gè)技術(shù)方案是，一種跨血腦屏障蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體的制備方法，具體包括按照以下步驟實(shí)施：

步驟1，以EDCI和HOBT為縮合劑活化DHA的羧基；

步驟2，將步驟1活化羧基后的DHA與帶有GFP示蹤信號(hào)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF^GFP+)氨基酸殘基側(cè)鏈上的氨基發(fā)生酸胺縮合反應(yīng)后，即得蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體。

本發(fā)明的特征還在于，

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的C端連接了GGGS-GFP；其中，GGGS為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與GFP之間的linker序列，GGGS的氨基酸序列見(jiàn)序列表中3。

步驟1的具體過(guò)程為：

在充滿(mǎn)氬氣的厭氧手套箱和冰浴條件下，以二甲基甲酰胺(DMF)做溶劑溶解DHA，攪拌(速度為100rpm)并向其中分別滴加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和1-羥基苯并三唑(HOBT)，滴加完后放置6～12h。

DHA與EDCI的摩爾比為1～2:1；HOBT與EDCI的摩爾比為1～1.5:1。

步驟2的具體過(guò)程為：

在充滿(mǎn)氬氣的厭氧手套箱和冰浴條件下，取步驟1活化羧基后的DHA，攪拌(速度為100rpm)并向其中滴加帶有GFP示蹤信號(hào)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF^GFP+)，進(jìn)行酸胺縮合反應(yīng)8-12h，3000rpm離心處理，PBS緩沖液洗滌后，即得轉(zhuǎn)運(yùn)體。

活化羧基后的DHA與帶有GFP示蹤信號(hào)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF^GFP+)的摩爾比為100:1。

本發(fā)明所采用的第三個(gè)技術(shù)方案是，跨血腦屏障蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療中應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是，用作蛋白修飾的DHA，本身是一種維持神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)及功能的重要物質(zhì)，對(duì)損傷腦組織起到一定的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用；靜脈注射后，機(jī)體能從血液中分離DHA修飾的蛋白并跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)，使其在腦組織中積累；入腦后，DHA及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)、治療損傷神經(jīng)細(xì)胞的多重作用。為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療提供了一種更加安全、高效、無(wú)創(chuàng)傷的蛋白藥物遞送方式，促進(jìn)損傷后神經(jīng)組織的再生和神經(jīng)功能恢復(fù)，具有腦靶向性好、生物安全性高和易透過(guò)血腦屏障的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為DHA^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白入腦熒光顯微結(jié)果；其中，1-A為正常對(duì)照組；1-B為DHA注射組；1-C為BDNF^GFP+注射組；1-D為DHA-BDNF^GFP+注射組；

圖2為DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體促進(jìn)MCAO大鼠缺血損傷恢復(fù)的量化結(jié)果；其中，2-A為正常對(duì)照組(假手術(shù)組，注射0.9％Nacl)；2-B為MCAO+0.9％Nacl注射組；2-C為MCAO+DHA注射組；2-D為MCAO+BDNF^GFP+注射組；2-E為MCAO+DHA-BDNF^GFP+注射組；2-F為大鼠大腦對(duì)側(cè)半球梗塞體積量化結(jié)果；

圖3為DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體改善MCAO大鼠缺血損傷后的學(xué)習(xí)功能；其中，3-A為潛伏期，3-B為游泳速度，3-C為游泳總距離；

圖4為DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體改善MCAO大鼠缺血損傷后的空間探索功能。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，采用設(shè)備為行業(yè)慣例設(shè)備，所使用的材料、試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

1：DHA與帶有GFP示蹤信號(hào)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF^GFP+)的連接：

步驟1，在充滿(mǎn)氬氣的厭氧手套箱和冰浴條件下，以DMF做溶劑溶解DHA，攪拌(速度為100rpm)并向其中分別滴加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和1-羥基苯并三唑(HOBT)，滴加完后放置6～12h。其中，DHA與EDCI的摩爾比為1～2:1；HOBT與EDCI的摩爾比為1～1.5:1。

步驟2，在充滿(mǎn)氬氣的厭氧手套箱和冰浴條件下，取步驟1活化羧基后的DHA，攪拌(速度為100rpm)并向其中滴加帶有GFP示蹤信號(hào)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF^GFP+)，進(jìn)行酸胺縮合反應(yīng)8-12h，3000rpm離心濃縮處理，PBS緩沖液洗滌后，洗滌修飾后的蛋白，除去EDCI和HOBT及未反應(yīng)的DHA后，即得轉(zhuǎn)運(yùn)體。其中，活化羧基后的DHA與帶有GFP示蹤信號(hào)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF^GFP+)的摩爾比為100:1。

2：DHA-BDNF^GFP+跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白入腦的鑒定

實(shí)驗(yàn)方法：

2.1、動(dòng)物分組：正常對(duì)照組(0.9％Nacl)、DHA注射組、BDNF^GFP+注射組及DHA-BDNF^GFP+注射組。

2.2、按2.5mg/kg的劑量通過(guò)尾靜脈注射給各組SD大鼠注射上述物質(zhì)。

2.3、注射12h后，麻醉處死，迅速取腦組織做冰凍切片，冷凍箱溫度為-15℃，樣品頭溫度為-10℃，切片厚度為3μm。

2.4、熒光顯微觀察并拍照

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖1中，1-A為正常對(duì)照組(0.9％Nacl)；1-B為DHA注射組；1-C為BDNF^GFP+注射組；1-D為DHA-BDNF^GFP+注射組。1-A～1-C圖在腦內(nèi)腦外均未出現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記，1-D圖在腦內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，示蹤結(jié)果說(shuō)明DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體成功跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白入腦。

3：DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體MCAO模型大鼠缺血損傷的恢復(fù)。

實(shí)驗(yàn)方法：

3.1、動(dòng)物分組：正常對(duì)照組(假手術(shù)組，0.9％Nacl)、MCAO組(0.9％Nacl)、MCAO+DHA注射組、MCAO+BDNF^GFP+注射組及MCAO+DHA-BDNF^GFP+注射組。

3.2、MCAO模型的制備(參照Z(yǔ)ea Longa等建立的大鼠大腦中動(dòng)脈內(nèi)栓線(xiàn)阻斷方法)：10％水合氯醛溶液，腹腔注射麻醉動(dòng)物。大鼠仰臥位固定，頸部正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離各層組織，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈。分離至頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈分叉后一段，置線(xiàn)備用。于頸內(nèi)、頸總動(dòng)脈處用動(dòng)脈夾夾閉，頸外動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端結(jié)扎。將頸外動(dòng)脈游離端拉至與頸內(nèi)動(dòng)脈成一條直線(xiàn)，將尼龍線(xiàn)由頸外動(dòng)脈插入并結(jié)扎，打開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈處動(dòng)脈夾，將尼龍線(xiàn)插入頸內(nèi)動(dòng)脈，繼續(xù)插入至顱內(nèi)至微感阻力，逐層縫合，尼龍線(xiàn)殘端留l cm長(zhǎng)于皮外。假手術(shù)組只進(jìn)行術(shù)前麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎及導(dǎo)入線(xiàn)栓。手術(shù)過(guò)程中室溫保持在24-25℃，生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行動(dòng)物呼吸及心電監(jiān)測(cè)。

3.3、局部腦血流量測(cè)定：大鼠俯臥位固定于立體定位儀上，開(kāi)顱窗，以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，選取前囟后2mm、右側(cè)3mm為測(cè)定點(diǎn)，周?chē)睆郊s3mm區(qū)域用牙科鉆打薄，定位并固定好探頭座。進(jìn)行MCAO手術(shù)，當(dāng)線(xiàn)插入ICA后先不插入顱內(nèi)，穩(wěn)定LDF讀數(shù)后，記錄5min內(nèi)血流值，以其平均值作為腦血流的基礎(chǔ)值。把線(xiàn)插入顱內(nèi)，當(dāng)血流值突然下降至基礎(chǔ)值的10％-20％時(shí)，提示中腦動(dòng)脈血流已被阻斷。

3.4、Bederson’s神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：動(dòng)物于給藥前及處死前進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)觀察，提鼠尾離開(kāi)地面，觀察前肢狀況；將大鼠置于水平地面，推動(dòng)其雙肩，觀察兩側(cè)抵抗力有無(wú)差異；大鼠置于地面，觀察其行走情況。采用四級(jí)評(píng)分法，分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明其神經(jīng)行為損傷越嚴(yán)重。

3.5、按2.5mg/kg的劑量通過(guò)尾靜脈注射0.9％Nacl、DHA、BDNF^GFP+及DHA-BDNF^GFP+，連續(xù)注射2周，測(cè)定腦梗塞體積。

3.6、腦梗塞體積的測(cè)定：斷頭處死大鼠，迅速取腦組織并置于-20℃10min，而后室溫下切除嗅球、小腦和低位腦干后，按圖譜所示間隔2mm切大腦連續(xù)冠狀粗切片。迅速將腦片置于含2％TTC的溶液中，37℃恒溫、避光孵育30min。經(jīng)TTC染色后，正常組織呈玫瑰紅色，梗塞組織未被染色而呈白色。拍照并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)軟件處理，計(jì)算每張腦片的梗塞面積，乘以每片腦片的厚度，每只動(dòng)物所有腦片梗塞面積乘以厚度相加，即為腦梗塞體積。梗塞體積以所占大腦對(duì)側(cè)半球的百分比率來(lái)表示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖2中2-A為正常對(duì)照組(注射0.9％Nacl的假手術(shù)組)；2-B為MCAO+0.9％Nacl注射組；2-C為MCAO+DHA注射組；2-D為MCAO+BDNF^GFP+注射組；2-E為MCAO+DHA-BDNF^GFP+注射組；2-F為大鼠大腦對(duì)側(cè)半球梗塞體積量化結(jié)果。結(jié)果顯示：與MCAO+0.9％Nacl組相比，單純注射BDNF^GFP+無(wú)減輕腦半球梗塞體積的作用；單純注射DHA，能減少腦梗塞體積，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體治療后，MCAO大鼠腦半球缺血損傷面積顯著減小(*，P<0.05)。

4：DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體改善MCAO大鼠缺血損傷后的學(xué)習(xí)記憶功能。

動(dòng)物分組、MCAO模型制備、藥物注射：同3.1、3.2和3.5。

實(shí)驗(yàn)方法：

4.1、將大鼠頭朝池壁放入水中，放入位置隨機(jī)取東、西、南、北四個(gè)象限之一。記錄動(dòng)物找到水下平臺(tái)的時(shí)間。在前幾次訓(xùn)練中，如果這個(gè)時(shí)間超過(guò)60s，則引導(dǎo)動(dòng)物到平臺(tái)。讓動(dòng)物在平臺(tái)上停留10s.

4.2、將大鼠擦干后，放在白熾燈下烤3min，放回籠內(nèi)。每只動(dòng)物每天訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練之間間隔25min，第1～6天和第8～13天連續(xù)訓(xùn)練，記錄大鼠的潛伏期、游泳速度和游泳總距離。

4.3、第7和14天，將平臺(tái)撤除，開(kāi)始60s的探查訓(xùn)練。記錄大鼠在原先放置平臺(tái)的目標(biāo)象限所花的時(shí)間，以此作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖3中3-A為潛伏期，3-B為游泳速度，3-C為游泳總距離。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照大鼠相比，MCAO模型鼠在水迷宮中空間記憶能力均顯著下降(^#，P<0.05)。DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體治療后與MCAO組相比，大鼠潛伏期變短，游泳速度呈上升趨勢(shì)，游泳總距離呈下降趨勢(shì)(*，P<0.05)，說(shuō)明DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體改善了MCAO大鼠腦缺血損傷后的學(xué)習(xí)記憶功能。

圖4為空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示：DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體治療后與MCAO組相比，大鼠在目標(biāo)象限停留比率增加(*，P<0.05)，說(shuō)明DHA-BDNF^GFP+蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體改善了MCAO鼠腦缺血損傷后的空間辨別能力。

實(shí)施例1

以DMF做溶劑，在充滿(mǎn)氬氣的手套箱中溶解10mg DHA；冰浴，100rpm攪拌滴加5.8mg EDCI和4.1mg HOBT；活化羧基8小時(shí)。在充滿(mǎn)氬氣的手套箱中，冰浴條件下，100rpm攪拌滴加BDNF^GFP+(DHA與BDNF^GFP+的摩爾比為100:1)發(fā)生酸胺縮合反應(yīng)，反應(yīng)8小時(shí)；3000rpm離心濃縮蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體，加PBS緩沖液，洗滌修飾后的蛋白，除去EDCI和HOBT及未反應(yīng)的DHA。

實(shí)施例2

以DMF做溶劑，在充滿(mǎn)氬氣的手套箱中溶解30mg DHA；冰浴，100rpm攪拌滴加11.6mg EDCI和9.8mg HOBT；活化羧基6小時(shí)。在充滿(mǎn)氬氣的手套箱中，冰浴條件下，100rpm攪拌滴加BDNF^GFP+(DHA與BDNF^GFP+的摩爾比為100:1)發(fā)生酸胺縮合反應(yīng)，反應(yīng)10小時(shí)；3000rpm離心濃縮蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體，加PBS緩沖液，洗滌修飾后的蛋白，除去EDCI和HOBT及未反應(yīng)的DHA。

實(shí)施例3

以DMF做溶劑，在充滿(mǎn)氬氣的手套箱中溶解60mg DHA；冰浴，100rpm攪拌滴加17.4mg EDCI和18.5mg HOBT；活化羧基12小時(shí)。在充滿(mǎn)氬氣的手套箱中，冰浴條件下，100rpm攪拌滴加BDNF^GFP+(DHA與BDNF^GFP+的摩爾比為100:1)發(fā)生酸胺縮合反應(yīng)，反應(yīng)12小時(shí)；3000rpm離心濃縮蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體，加PBS緩沖液，洗滌修飾后的蛋白，除去EDCI和HOBT及未反應(yīng)的DHA。