專利名稱：質(zhì)體adp/atp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性改變的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性提高的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物。所述細(xì)胞和植物顯示產(chǎn)量增加，優(yōu)選油和/或淀粉含量增加，并優(yōu)選合成直鏈淀粉含量提高的淀粉。
本發(fā)明還涉及ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物。這些細(xì)胞和植物合成直鏈淀粉含量降低的淀粉。
在農(nóng)業(yè)和林業(yè)領(lǐng)域，人們一直長(zhǎng)期努力提供產(chǎn)量增加的植物，這特別是為了保證持續(xù)增長(zhǎng)的世界人口的食物供應(yīng)和保證再生原材料的供應(yīng)。傳統(tǒng)作法是試圖通過(guò)育種獲得高產(chǎn)植物。然而，這種方法既費(fèi)時(shí)又成本高。而且，對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)植物種都要進(jìn)行相應(yīng)的育種計(jì)劃。
在一定程度上，通過(guò)植物的遺傳操作即在植物中有目的地導(dǎo)入和表達(dá)重組核酸分子，已獲得了進(jìn)展。該方法的優(yōu)點(diǎn)是它們通常不限于一個(gè)植物種，也可轉(zhuǎn)移至其它植物物種。
例如，在EP-A 0 511 979中，描述了原核天冬酰胺合成酶在植物細(xì)胞中表達(dá)導(dǎo)致生物量生產(chǎn)增加。WO 96/21737描述了例如通過(guò)表達(dá)不受調(diào)節(jié)的果糖-1,6-二磷酸酶，由于光合速率增加而增加植物產(chǎn)量。然而，仍然需要普遍適用的改善農(nóng)業(yè)和林業(yè)上目標(biāo)植物產(chǎn)量的方法。
而且，隨著植物所含物質(zhì)作為原材料的可再生來(lái)源起著越來(lái)越重要的作用，生物技術(shù)研究中的一個(gè)問(wèn)題是調(diào)整所述植物原材料以滿足加工業(yè)的要求。為了使再生原材料可在盡可能多的領(lǐng)域應(yīng)用，更需要獲得大范圍的物質(zhì)。此外，為了提高從植物中生產(chǎn)可再生來(lái)源的原材料的效率，必需增加所述植物內(nèi)含物質(zhì)的產(chǎn)量。
除了脂肪和蛋白質(zhì)外，油和多糖是主要的再生植物原材料。除了纖維素以外，多糖的主要形式是作為高等植物最重要的貯藏物質(zhì)之一的淀粉。其中，特別是馬鈴薯和玉米是人們感興趣的植物，因?yàn)樗鼈兪巧a(chǎn)淀粉的重要栽培作物。
除了在食品工業(yè)中應(yīng)用之外，植物界最重要的貯藏物質(zhì)之一多糖淀粉廣泛用作生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品的再生原材料。
淀粉工業(yè)對(duì)淀粉含量提高的植物有很大的興趣，通常，淀粉含量提高意味著干重增加。由于淀粉產(chǎn)量提高，干重增加可提升在淀粉工業(yè)中加工的該植物的價(jià)值(玉米、馬鈴薯、木薯、小麥、大麥、水稻等)。此外，因?yàn)楹懈叩矸哿康闹参锛?xì)胞或器官吸收脂肪或煎炸油更少因而可生產(chǎn)熱含量降低的“更健康”的產(chǎn)品，所以它們具有優(yōu)勢(shì)。所述特性在例如從玉米生產(chǎn)爆玉米花、脆玉米片或從馬鈴薯生產(chǎn)炸薯?xiàng)l、油炸土豆片或土豆油炸餡餅中極為重要。
對(duì)于工業(yè)加工馬鈴薯淀粉，干重(淀粉含量)是一個(gè)關(guān)鍵值，因?yàn)樗鼪Q定加工的成本。干重(淀粉含量)增加意味著產(chǎn)量相同時(shí)馬鈴薯塊莖的含水量降低。含水量降低導(dǎo)致運(yùn)輸費(fèi)用降低，烹調(diào)時(shí)所需確切烹調(diào)時(shí)間減少。
因此，看起來(lái)期望提供淀粉含量增加的植物細(xì)胞和植物，以及生產(chǎn)這種植物細(xì)胞和植物的方法。而且，看起來(lái)期望提供其直鏈淀粉和支鏈淀粉含量符合加工業(yè)要求的淀粉。在本文中，直鏈淀粉含量增加的淀粉和直鏈淀粉含量降低的淀粉都是有利的，因?yàn)樗鼈兛筛髯蕴貏e適用于特別的用途。
因此，本發(fā)明解決的問(wèn)題是提供與相應(yīng)未修飾野生型植物細(xì)胞和野生型植物相比，顯示產(chǎn)量增加，優(yōu)選油和/或淀粉產(chǎn)量，和/或合成直鏈淀粉含量改變了的淀粉的植物細(xì)胞和植物。
該問(wèn)題通過(guò)提供具有權(quán)利要求特征的實(shí)施方案來(lái)解決。
因此，本發(fā)明涉及經(jīng)過(guò)遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中遺傳修飾是導(dǎo)入外源核酸分子，其中與來(lái)自野生型植物的相應(yīng)未遺傳修飾植物細(xì)胞相比外源核酸分子的存在或表達(dá)在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中引起質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加。
在本文中，遺傳修飾可是任何導(dǎo)致質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加的任何遺傳修飾。例如，一種可能是所謂的“原位激活”，其中遺傳修飾是改變內(nèi)源ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的調(diào)節(jié)區(qū)，導(dǎo)致所述基因表達(dá)增加。這可通過(guò)例如采用同源重組在相應(yīng)基因前面導(dǎo)入一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)。
此外，可使用所謂的“激活標(biāo)簽”方法(見例如，Walden等，植物雜志(Plant J.)(1991),281-288；Walden等，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)26(1994),1521-1528)。所述方法基于通過(guò)增強(qiáng)子元件如花椰菜花葉病毒35S RNA啟動(dòng)子的增強(qiáng)子或章魚堿合成酶增強(qiáng)子激活內(nèi)源啟動(dòng)子。
但在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，遺傳修飾包括向植物細(xì)胞基因組導(dǎo)入編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外源核酸分子。
因此，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指本發(fā)明的植物細(xì)胞包含至少一個(gè)在基因組中穩(wěn)定整合的編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外源核酸分子，優(yōu)選核酸分子。
優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“外源核酸分子”是指編碼具有質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生物活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，該核酸分子在相應(yīng)植物細(xì)胞中不是天然存在的，或在植物細(xì)胞中不是天然以該精確的空間次序存在，或者所述核酸分子定位于植物細(xì)胞基因組中非天然存在的一個(gè)位置。優(yōu)選地，外源核酸分子是包含各種元件的重組分子，而且其組合或特定空間排列在植物細(xì)胞中不是天然存在的。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞含有至少一個(gè)編碼具有質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生物活性的蛋白質(zhì)的外源核酸分子，其中所述核酸分子優(yōu)選與確保在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA元件特別是啟動(dòng)子相連。
原則上，外源核酸分子可以是編碼表達(dá)后定位于質(zhì)體內(nèi)膜上的ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的任何核酸分子。在本文中，質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是催化轉(zhuǎn)運(yùn)ATP進(jìn)入質(zhì)體和ADP排出質(zhì)體的蛋白質(zhì)。這種核酸分子是已知的，來(lái)自例如擬南芥(Kampfenkel等，F(xiàn)EBS lett.374(1995),351-355；Genebank Acc.No.X94626和Acc.No.Z49227)或馬鈴薯(Genebank Acc.No.Y10821)。利用所述已知核酸分子本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法如異源篩選從其它生物特別是植物分離相應(yīng)序列。特別地，也可使用編碼ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并與確保在質(zhì)體內(nèi)膜上定位的導(dǎo)向序列連接的非植物核酸分子。在本文中，例如已知ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)自普氏立克次氏體(Williamson等，基因(Gene)80(1989),269-278)和砂眼衣原體。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，外源核酸分子編碼Arabidopsis thaliana的質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，特別是Kampfenkel等(1995,loc.cit.)所述的蛋白質(zhì)AATP1。
本發(fā)明的細(xì)胞可與天然存在的植物細(xì)胞區(qū)分開來(lái)，特別因?yàn)樗鼈兒兴黾?xì)胞中非天然存在的外源核酸分子，或所述分子整合在細(xì)胞基因組中非天然存在的位置，即處于另一種基因組環(huán)境中。此外，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可與天然存在的植物細(xì)胞區(qū)分開來(lái)，是因?yàn)樗鼈兒兄辽僖粋€(gè)拷貝的在其基因組中穩(wěn)定整合的外源核酸分子，可選擇地還有在細(xì)胞中天然存在所述分子的拷貝。如果導(dǎo)入細(xì)胞的核酸分子是細(xì)胞中天然存在分子的額外拷貝，則本發(fā)明的植物細(xì)胞可與天然存在的植物細(xì)胞區(qū)分開來(lái)，特別是因?yàn)樗鲱~外拷貝位于其非天然存在的基因組位置。例如這可通過(guò)Southern印跡分析測(cè)定。
本發(fā)明植物細(xì)胞還可優(yōu)選通過(guò)至少一種下列特征與天然存在的植物細(xì)胞區(qū)分開如果核酸分子是植物細(xì)胞異源的，則轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞顯示導(dǎo)入核酸分子的轉(zhuǎn)錄本，這可用例如Northern印跡分析檢測(cè)。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物細(xì)胞含有導(dǎo)入核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。這可通過(guò)免疫方法特別是Western印跡分析來(lái)檢測(cè)。
如果核酸分子是植物細(xì)胞同源的，則本發(fā)明的細(xì)胞可通過(guò)例如導(dǎo)入的外源核酸分子的額外表達(dá)與天然存在細(xì)胞區(qū)分開。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞含有外源核酸分子的更多轉(zhuǎn)錄本。這可通過(guò)例如Northern印跡分析檢測(cè)。
術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾”是指通過(guò)導(dǎo)入外源核酸分子使植物細(xì)胞在其遺傳信息上被修飾，而且外源核酸分子的存在或表達(dá)導(dǎo)致表型改變。在本文中，表型改變優(yōu)選指細(xì)胞一或多項(xiàng)功能的可測(cè)量的改變。例如由于導(dǎo)入的外源核酸分子的存在或表達(dá)，本發(fā)明的遺傳修飾植物細(xì)胞顯示質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“活性增加”是指細(xì)胞中質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)增加、質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)數(shù)量增加和/或質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加。
表達(dá)增加可通過(guò)例如由Northern印跡分析測(cè)量編碼ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄本的量來(lái)檢測(cè)。在本文中，增加優(yōu)選指與相應(yīng)非遺傳修飾的細(xì)胞相比轉(zhuǎn)錄本的量增加至少10％、優(yōu)選至少20％、更優(yōu)選至少50％、特別優(yōu)選至少75％。ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白量的增加可通過(guò)例如Western印跡分析來(lái)測(cè)定。在本文中，增加優(yōu)選指與相應(yīng)非遺傳修飾的細(xì)胞相比ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的量增加至少10％、優(yōu)選至少20％、更優(yōu)選至少50％、特別優(yōu)選至少75％。
質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性可通過(guò)例如從相應(yīng)組織分離質(zhì)體并采用硅油過(guò)濾法測(cè)定ATP轉(zhuǎn)入的Vmax-值來(lái)測(cè)定。各種類型質(zhì)體的純化參見Neuhaus等(生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)296(1993),395-401)。硅油過(guò)濾法參見Quick等(植物生理學(xué)(Plant Physiol.)109(1995),113-121)。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，對(duì)含有質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加的植物細(xì)胞的植物，內(nèi)含物質(zhì)和/或生物量的產(chǎn)量與相應(yīng)未修飾野生型植物相比增加了。例如，發(fā)現(xiàn)與未修飾的野生型植物相比根據(jù)本發(fā)明的植物的油含量和/或淀粉含量增加了和/或這些淀粉的直鏈淀粉含量也增加了。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“野生型植物”是指用作產(chǎn)生所述植物的起始材料的植物，即除了導(dǎo)入的遺傳修飾外其遺傳信息與本發(fā)明植物遺傳信息相同的植物。
術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量增加”是指與未修飾的野生型植物的植物細(xì)胞相比本發(fā)明植物細(xì)胞中內(nèi)含物質(zhì)部分優(yōu)選淀粉或油增加至少10％、優(yōu)選至少20％、更優(yōu)選至少30％、最優(yōu)選至少40％。
術(shù)語(yǔ)“淀粉含量增加”是指與未修飾的野生型植物的植物細(xì)胞相比根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞中淀粉部分增加至少10％、優(yōu)選至少20％、更優(yōu)選至少30％、最優(yōu)選至少40％。淀粉部分的測(cè)定根據(jù)附帶的實(shí)施例所述方法進(jìn)行。
按所附實(shí)施例描述的方法測(cè)定淀粉部分。
術(shù)語(yǔ)“直鏈淀粉含量增加”是指與未修飾的野生型植物的植物細(xì)胞相比本發(fā)明植物細(xì)胞所合成淀粉的直鏈淀粉含量增加至少10％、優(yōu)選至少20％、更優(yōu)選至少30％、最優(yōu)選至少40％。直鏈淀粉含量通過(guò)所附實(shí)施例所述方法測(cè)定。
如上所述，質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是定位于質(zhì)體內(nèi)膜上(Heldt等，F(xiàn)EBS Lett.5(1969),11-14；Pozueta-Romero等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)88(1991),5769-5773；Neuhaus，植物生理學(xué)101(1993)573-578；Schünemann等，植物生理學(xué)103(1993),131-137)催化轉(zhuǎn)運(yùn)ATP進(jìn)入質(zhì)體和ADP排出質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)。因此，質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為質(zhì)體基質(zhì)提供胞質(zhì)ATP。
Kampfenkel等(FEBS Lett.374(1995),351-355)最先從擬南芥(Neuhaus等，植物雜志11(1997),73-82)分離了編碼ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AATP1)的cDNA，該cDNA顯示與革蘭氏陰性細(xì)菌普氏立克次氏體的ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有很高的相似性(66.2％相似)。A.thaliana的AATP1-cDNA編碼由589個(gè)氨基酸組成的強(qiáng)烈疏水蛋白質(zhì)，它顯示12個(gè)潛在的跨膜螺旋(Kampfenkel等FEBS Lett.374(1995),351-355)。所述cDNA可在面包酵母和大腸桿菌中功能性表達(dá)。提取該蛋白質(zhì)并在蛋白脂質(zhì)體中重建之后，可測(cè)到ATP轉(zhuǎn)運(yùn)速率的增加(Neuhaus等，植物雜志11(1997),73-82)。利用抗擬南芥AATP1肽片段的抗體，可顯示ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AATP1位于葉綠體內(nèi)被膜中(Neuhaus等，植物雜志11(1997),73-82)。
迄今，質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)植物代謝的功能未能徹底闡明。已考慮了各種功能，如給質(zhì)體基質(zhì)供應(yīng)胞質(zhì)ATP可能對(duì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入質(zhì)體內(nèi)、氨基酸生物合成、脂肪酸代謝或淀粉代謝有影響(Flügge和Hinz,Eur.J.Biochem.160(1986),563-570；Tetlow等，Planta 194(1994),454-460；Hill和Smith,Planta 185(1991),91-96；Kleppinger-Sparace等，植物生理學(xué)98(1992),723-727)。
然而，完全令人驚奇的是，質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的增加導(dǎo)致在相應(yīng)轉(zhuǎn)基因植物中淀粉含量增加。同樣令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加對(duì)所產(chǎn)生淀粉的分子組成有影響。例如，與未修飾的馬鈴薯植物塊莖的淀粉相比，根據(jù)本發(fā)明的馬鈴薯植物塊莖的淀粉顯示直鏈淀粉增加。
迄今為止，一直假定淀粉的分子特性只是由淀粉合成酶如分支酶(E.C.2.4.1.18)、淀粉合成酶(E.C.2.4.1.21)和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(E.C.2.7.7.27)的相互作用決定。然而，完全令人吃驚的是，質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)對(duì)淀粉的結(jié)構(gòu)有影響。
本發(fā)明的植物細(xì)胞可來(lái)自任何植物物種，即既包括單子葉植物也包括雙子葉植物。優(yōu)選地，植物細(xì)胞來(lái)自農(nóng)業(yè)上的作物，即人類為了營(yíng)養(yǎng)或技術(shù)特別是工業(yè)目的而栽培的植物。通常優(yōu)選來(lái)自合成油和/或淀粉或者貯藏油和/或淀粉的植物的植物細(xì)胞。因此，本發(fā)明優(yōu)選涉及合成淀粉或貯藏淀粉的植物的植物細(xì)胞，所述植物例如谷類(黑麥、大麥、燕麥、小麥、小米、西米等)、水稻、豌豆、玉米、medullar pea、木薯、馬鈴薯、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵或蔬菜(番茄、菊苣、黃瓜、生菜等)。優(yōu)選馬鈴薯、向日葵、大豆、水稻的植物細(xì)胞。特別優(yōu)選玉米、小麥、油菜和水稻的植物細(xì)胞。
另外，本發(fā)明主題是含有上述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物可通過(guò)例如從本發(fā)明的植物細(xì)胞再生產(chǎn)生。原則上，轉(zhuǎn)基因植物可以是任何植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。優(yōu)選地，它們是有用的植物，即人類為了營(yíng)養(yǎng)或技術(shù)特別是工業(yè)目的而栽培的植物。這些植物可以是合成油和/或淀粉或者貯藏油和/或淀粉的植物。本發(fā)明優(yōu)選涉及諸如谷類(黑麥、大麥、燕麥、小麥、小米、西米等)、水稻、豌豆、玉米、medullar pea、木薯、馬鈴薯、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵或蔬菜(番茄、菊苣、黃瓜、生菜等)的植物。優(yōu)選馬鈴薯、向日葵、大豆、水稻。特別優(yōu)選玉米、小麥、油菜和水稻。
如上所述，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，與野生型植物相比在含有質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加的本發(fā)明植物細(xì)胞的淀粉貯藏植物中淀粉含量增加了，和/或與相應(yīng)未修飾野生型植物相比這些淀粉的直鏈淀粉含量也增加了。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明植物細(xì)胞的淀粉貯藏植物，其與未修飾的野生型植物相比顯示淀粉含量增加和/或與相應(yīng)的未修飾野生型植物相比所述淀粉的直鏈淀粉含量增加。
術(shù)語(yǔ)“淀粉貯藏植物”包括所有具有淀粉貯藏組織的植物如玉米、小麥、水稻、馬鈴薯、黑麥、大麥、燕麥。優(yōu)選水稻、大麥和馬鈴薯。特別優(yōu)選玉米和小麥。
在本文中，“產(chǎn)量”增加(“增加的產(chǎn)量”)、淀粉含量增加(“增加的淀粉含量”)、直鏈淀粉含量增加(“增加的直鏈淀粉含量”)和術(shù)語(yǔ)“野生型植物”在上述定義的含義內(nèi)使用，也在相同含義內(nèi)用于本發(fā)明下列實(shí)施方案。術(shù)語(yǔ)“增加的產(chǎn)量”優(yōu)選指內(nèi)含物質(zhì)和/或生物量的產(chǎn)生增加，特別是用每株植物的鮮重測(cè)量時(shí)如此。
產(chǎn)量的所述增加優(yōu)選涉及可收獲的植物部分如種子、果實(shí)、貯藏根、根、塊莖、花、芽、枝條、莖或木材。
根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)量增加是與相同基因型的相應(yīng)未轉(zhuǎn)化植物相比生物量和/或內(nèi)含物質(zhì)增加至少3％，如果所述植物在相同條件下栽培，與野生型植物相比優(yōu)選至少10％、更優(yōu)選至少20％、最優(yōu)選至少30％甚至40％。
與其它合成直鏈淀粉含量增加的淀粉的植物如玉米的amylose-extender和dull突變體相比，根據(jù)本發(fā)明的所述植物具有如下優(yōu)點(diǎn)除了直鏈淀粉含量增加外，它們顯示淀粉含量不降低甚至增加。
另外，本發(fā)明的主題是含有本發(fā)明植物細(xì)胞的油貯藏植物，其與未修飾的野生型植物細(xì)胞相比油含量增加，優(yōu)選在貯藏油的組織中油含量增加。
術(shù)語(yǔ)“油貯藏植物”包括所有能貯藏油的植物如油菜、蕓苔、大豆、向日葵、玉米、花生、小麥、棉花、油棕、橄欖樹和鱷梨。優(yōu)選玉米、小麥和大豆。特別優(yōu)選油菜和蕓苔。
術(shù)語(yǔ)“油含量增加”是指與未修飾的野生型植物的植物細(xì)胞相比本發(fā)明植物細(xì)胞油含量增加至少10％，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％，最優(yōu)選至少40％。
測(cè)定油含量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并參見例如Matthaeus和Bruehl,GIT Labor-Fachz.43(1999),151-152,154-155；Matthaeus,Laborpraxis 22(1998),52-55。油含量的測(cè)定也可通過(guò)非侵入近紅外光譜法來(lái)進(jìn)行，后者是一種分析方法(育種中常用)，參見Schulz等，J.Near Infrared Spectrosc.6(1998),A125-A130；Starr等,J.Agric.Sci.104(1985),317-323。
顯示油濃度增加的植物具有巨大的商業(yè)利益。例如，其谷粒顯示高水平的淀粉又具有增加含量的副產(chǎn)品油的玉米植物對(duì)于濕磨工業(yè)來(lái)說(shuō)有巨大的吸引力，因?yàn)樵摳碑a(chǎn)品具有很高的價(jià)值。飼料業(yè)也對(duì)油含量增加的飼料植物感興趣，因?yàn)檫@種植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值增加了。對(duì)于油料植物加工業(yè)，油含量的增加意味著油提取過(guò)程的效率增加。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生與野生型植物相比顯示產(chǎn)量增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中(a)通過(guò)導(dǎo)入外源核酸分子對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，而且該遺傳修飾導(dǎo)致質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的增加；和(b)從該細(xì)胞再生植物；和選擇性地(c)從根據(jù)(b)的植物產(chǎn)生后代植物。
本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物相比顯示淀粉含量增加和/或與相應(yīng)野生型植物相比其淀粉顯示直鏈淀粉含量增加，其中(a)通過(guò)導(dǎo)入外源核酸分子對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，而且該遺傳修飾導(dǎo)致質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的增加；和(b)從該細(xì)胞再生植物；和選擇性地(c)從根據(jù)(b)的植物產(chǎn)生后代植物。
另外，本發(fā)明的主題是產(chǎn)生與野生型植物相比顯示油含量增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中(a)通過(guò)導(dǎo)入外源核酸分子對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，而且該遺傳修飾導(dǎo)致質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的增加；和(b)從該細(xì)胞再生植物；和選擇性地(c)從根據(jù)(b)的植物產(chǎn)生后代植物。
對(duì)于根據(jù)步驟(a)導(dǎo)入植物細(xì)胞的修飾，上述關(guān)于本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物的討論同樣應(yīng)用如此。
根據(jù)步驟(b)的植物再生可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明方法步驟(c)的后代植物的產(chǎn)生可通過(guò)例如營(yíng)養(yǎng)繁殖(如通過(guò)插枝、塊莖、或愈傷組織培養(yǎng)和全株再生)或有性繁殖來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，有性繁殖以控制的方式進(jìn)行，即選擇有特定性狀的植物相互雜交和繁殖。
本發(fā)明還涉及可通過(guò)本發(fā)明方法獲得的植物。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的植物以及根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的含有本發(fā)明遺傳修飾細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖材料。在本文中，術(shù)語(yǔ)繁殖材料包括那些適于通過(guò)營(yíng)養(yǎng)或有性方式產(chǎn)生后代的植物的組成部分。例如，適于營(yíng)養(yǎng)繁殖的有插枝、愈傷組織培養(yǎng)物、根狀莖或塊莖。其它繁殖材料包括例如果實(shí)、種子、幼苗、原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物等。優(yōu)選地，繁殖材料是塊莖，特別優(yōu)選種子。
本發(fā)明還涉及編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸分子在產(chǎn)生與野生型植物相比產(chǎn)量增加的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸分子在產(chǎn)生與野生型植物相比在淀粉合成和/或貯藏組織中淀粉含量增加的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，或在產(chǎn)生與野生型植物的淀粉相比合成直鏈淀粉含量增加的淀粉的植物中的應(yīng)用。優(yōu)選采用上述關(guān)于本發(fā)明細(xì)胞的描述中提到的核酸分子。
本發(fā)明還涉及編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸分子在產(chǎn)生與野生型植物相比油含量增加的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的還涉及經(jīng)過(guò)遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中遺傳修飾導(dǎo)致與相應(yīng)野生型植物的未遺傳修飾植物細(xì)胞相比植物細(xì)胞內(nèi)源存在的質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低。
本文所用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指由于遺傳修飾特別是外源核酸分子的導(dǎo)入，本發(fā)明的植物細(xì)胞與相應(yīng)未修飾植物細(xì)胞相比在其遺傳信息上不同。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾”是指由于導(dǎo)入外源核酸分子使植物細(xì)胞在其遺傳信息上被修飾，而且外源核酸分子的存在或表達(dá)導(dǎo)致表型改變。優(yōu)選地，表型改變是指細(xì)胞的一或多個(gè)功能的可檢測(cè)的改變。例如本發(fā)明遺傳修飾的植物細(xì)胞顯示質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低。
ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低的所述本發(fā)明植物細(xì)胞的產(chǎn)生可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)導(dǎo)致編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)源基因的表達(dá)抑制的方法。這些方法包括例如表達(dá)相應(yīng)反義RNA、表達(dá)實(shí)現(xiàn)共抑制效應(yīng)的有義RNA、表達(dá)特異切割編碼ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄本的相應(yīng)構(gòu)建的核酶或所謂的“體內(nèi)誘變”。
為了降低本發(fā)明細(xì)胞中的ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，優(yōu)選表達(dá)反義RNA。
為了該表達(dá)，可使用含有編碼ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的全長(zhǎng)序列的DNA分子，包括可能存在的側(cè)翼序列，或使用僅含有編碼序列一部分的DNA分子，其中這些部分必須足夠長(zhǎng)以在細(xì)胞中導(dǎo)致反義效應(yīng)。通常，序列長(zhǎng)度可達(dá)最小15bp長(zhǎng)，優(yōu)選100-500bp長(zhǎng)，特別地，為了有效反義抑制，序列長(zhǎng)度超過(guò)500bp。通常采用比5000bp短的DNA分子，優(yōu)選小于2500bp。
也可使用與植物細(xì)胞中內(nèi)源存在的編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的序列高度同源的DNA序列。最小同源性應(yīng)大于約65％。優(yōu)選采用同源性在95％到100％之間的序列。
作為替代，本發(fā)明植物細(xì)胞中ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的降低也可通過(guò)共抑制效應(yīng)實(shí)現(xiàn)。該方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并參見例如Jorgensen (生物技術(shù)動(dòng)態(tài)(Trends Biotechnol.)8(1990),340-344),Niebel等(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995),91-103),Flavell等(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995),43-46),Palaqui和Vaucheret(植物分子生物學(xué)(Plant.Mol.Biol.)29(1995),149-159),Vaucheret等(Mol.Gen.Genet.248(1995),311-317),de Borne等(Mol.Gen.Genet.243(1994),613-621)和其它來(lái)源。
表達(dá)核酶以在細(xì)胞中降低特定蛋白質(zhì)活性是也本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并參見例如EP-B1 0 321 201。在植物細(xì)胞中表達(dá)核酶參見例如Feyter等(Mol.Gen.Genet.250(1996),329-338)。
另外，在本發(fā)明植物細(xì)胞中降低ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性也可通過(guò)所謂的“體內(nèi)誘變”來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中通過(guò)轉(zhuǎn)化細(xì)胞將雜合體RNA-DNA寡核苷酸(“chimeroplast”)導(dǎo)入細(xì)胞(Kipp,P.B.等，第5屆國(guó)際植物分子生物學(xué)大會(huì)的海報(bào)部分(Poster Session at the 5th International Congress ofPlant Molecular Biology),1997年9月21-27日，新加坡；R. A.Dixon和C.J.Arntzen，關(guān)于“轉(zhuǎn)基因植物中代謝改造”的會(huì)議報(bào)告(Meetingreport on "Metabolic Engineering in Transgenic Plants"),KeystoneSymposia,Copper Mountain,CO,USA,TIBTECH 15(1997),441-447；國(guó)際專利申請(qǐng)WO 95/15972；Kren等，肝臟病學(xué)(Hepatology)25(1997)，1462-1468；Cole-Strauss等，科學(xué)(Science)273(1996),1386-1389)。
RNA-DNA寡核苷酸的一部分DNA成分與內(nèi)源ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸序列同源，但與內(nèi)源ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白核酸序列相比顯示突變或含有包含于同源區(qū)中的異源區(qū)。通過(guò)RNA-DNA寡核苷酸的同源區(qū)與內(nèi)源核酸分子的堿基配對(duì)，然后同源重組，RNA-DNA寡核苷酸的DNA成分中包含的突變或異源區(qū)可轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的基因組中。這會(huì)導(dǎo)致質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低。
因此，特別地，本發(fā)明的主題是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其(a)含有能導(dǎo)致反義RNA合成的DNA分子，其中所述反義RNA可引起編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)源基因表達(dá)的降低；和/或(b)含有能導(dǎo)致共抑制RNA合成的DNA分子，所述共抑制RNA可引起編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)源基因表達(dá)的降低；和/或(c)含有能導(dǎo)致核酶合成的DNA分子，所述核酶可特異切割編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄本；和/或(d)由于體內(nèi)誘變，在至少一個(gè)編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)源基因中顯示突變或異源DNA序列的插入，其中突變或插入引起所述基因表達(dá)的降低或合成無(wú)活性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子。
在本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“活性降低”是指細(xì)胞中編碼ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)源基因的表達(dá)降低、ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)量減少和/或細(xì)胞中ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)生物活性降低。
表達(dá)降低可通過(guò)例如用Northern印跡分析測(cè)定編碼ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄本的量來(lái)確定。降低優(yōu)選指與未遺傳修飾的細(xì)胞相比轉(zhuǎn)錄本量降低至少30％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少70％，特別優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少95％。
ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)量減少可通過(guò)例如Western印跡分析測(cè)定。降低優(yōu)選指與未遺傳修飾的細(xì)胞相比ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)量降低至少30％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少70％，特別優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少95％。
令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，與來(lái)自野生型植物的相應(yīng)未修飾植物細(xì)胞相比質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)降低因而活性降低的植物細(xì)胞的淀粉含量降低了，而且與來(lái)自野生型植物的相應(yīng)未修飾植物細(xì)胞相比這些淀粉的直鏈淀粉含量也降低了。特別令人吃驚的是，本發(fā)明植物的淀粉具有修飾的結(jié)構(gòu)，因?yàn)槠駷橹挂恢奔俣ǖ矸鄣姆肿犹匦灾挥傻矸酆铣擅溉绶种?E.C.2.4.1.18)和淀粉合成酶(E.C.2.4.1.21)的相互作用決定。完全令人吃驚的是，質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)影響淀粉的結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“淀粉含量降低”是指與未修飾的野生型植物的植物細(xì)胞相比在本發(fā)明的植物細(xì)胞中淀粉含量降低至少15％，優(yōu)選至少30％，更優(yōu)選至少40％，最優(yōu)選至少50％。淀粉含量根據(jù)實(shí)施例中所述方法測(cè)定。
術(shù)語(yǔ)“直鏈淀粉含量降低”是指與未修飾的野生型植物相比在本發(fā)明的植物細(xì)胞中直鏈淀粉含量降低至少10％，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％，最優(yōu)選至少40％。直鏈淀粉含量根據(jù)實(shí)施例中所述方法測(cè)定。
術(shù)語(yǔ)“野生型植物”的意義由上文定義。
本發(fā)明的植物細(xì)胞可來(lái)自任何植物物種，即單子葉植物和雙子葉植物。優(yōu)選地，這些植物細(xì)胞來(lái)自農(nóng)業(yè)上的作物，即來(lái)自人類為了營(yíng)養(yǎng)或技術(shù)特別是工業(yè)目的栽培的植物。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明涉及合成淀粉或貯藏淀粉的植物的細(xì)胞，所述植物例如谷類(黑麥、大麥、燕麥、小麥、小米、西米等)、水稻、豌豆、玉米、medullar pea、木薯、馬鈴薯、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆和竹芋。特別優(yōu)選馬鈴薯的植物細(xì)胞。
另外，本發(fā)明的主題是含有上述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物可從本發(fā)明的植物細(xì)胞再生產(chǎn)生。該轉(zhuǎn)基因植物原則上可是任何植物物種的植物，即包括單子葉植物和雙子葉植物。優(yōu)選地，它們是來(lái)自農(nóng)業(yè)上的作物的植物細(xì)胞，即來(lái)自人類為了營(yíng)養(yǎng)或技術(shù)特別是工業(yè)目的而栽培的植物。優(yōu)選地，它們是合成淀粉或貯藏淀粉的植物，例如谷類(黑麥、大麥、燕麥、小麥、小米、西米等)、水稻、豌豆、玉米、medullarpea、木薯、馬鈴薯、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆和竹芋。特別優(yōu)選馬鈴薯。
與野生型植物的淀粉相比，本發(fā)明所述植物合成的淀粉顯示直鏈淀粉含量降低。術(shù)語(yǔ)“直鏈淀粉含量降低”和“野生型植物”定義見上。
而且，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，與相應(yīng)野生型植物的淀粉相比所述轉(zhuǎn)基因植物的淀粉顯示直鏈淀粉含量降低，其中(a)通過(guò)導(dǎo)入外源核酸分子對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，而且該遺傳修飾導(dǎo)致植物細(xì)胞中內(nèi)源存在的質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低；和(b)從根據(jù)步驟(a)產(chǎn)生的細(xì)胞再生植物；和選擇性地(c)從根據(jù)(b)產(chǎn)生的植物產(chǎn)生后代植物。
對(duì)于根據(jù)步驟(a)導(dǎo)入植物細(xì)胞的修飾，上述關(guān)于本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物的討論同樣應(yīng)用如此。
根據(jù)步驟(b)的植物再生可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明方法步驟(c)的后代植物的產(chǎn)生可通過(guò)例如營(yíng)養(yǎng)繁殖(如通過(guò)插枝、塊莖、或愈傷組織培養(yǎng)和全株再生)或有性繁殖來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，有性繁殖以控制的方式進(jìn)行，即選擇有特定性狀的植物相互雜交和繁殖。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物。
本發(fā)明還涉及可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的植物。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的植物以及根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的含有本發(fā)明遺傳修飾細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖材料。在本文中，術(shù)語(yǔ)繁殖材料包括那些適于通過(guò)營(yíng)養(yǎng)或有性方式產(chǎn)生后代的植物的組成部分。例如，適于營(yíng)養(yǎng)繁殖的有插枝、愈傷組織培養(yǎng)物、根狀莖或塊莖。其它繁殖材料包括例如果實(shí)、種子、幼苗、原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物等。優(yōu)選地，繁殖材料是種子，特別優(yōu)選塊莖。
另外，本發(fā)明還涉及編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸分子、其互補(bǔ)序列或所述分子的部分在產(chǎn)生與野生型植物的淀粉相比合成直鏈淀粉含量減少的淀粉的植物中的應(yīng)用。優(yōu)選采用與顯示ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加的本發(fā)明細(xì)胞相關(guān)的上述核酸分子。
已知多種技術(shù)可用于在植物宿主細(xì)胞中導(dǎo)入DNA。這些技術(shù)包括采用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉(zhuǎn)化劑用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、原生質(zhì)體融合、注射、DNA電穿孔、通過(guò)生物轟擊途徑導(dǎo)入DNA或其它可能的方法。
農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的使用已有詳細(xì)分析，并在下列文獻(xiàn)中有充分的描述EP 120516；Hoekema:The BinaryPlant Vector System Offetdrukkerij Kanters B.V.,Alblasserdam(1985),第Ⅴ章；Fraley等,Crit.Rev.Plant Sci.4,1-46和An等,EMBO J.4(1985),277-287。關(guān)于馬鈴薯的轉(zhuǎn)化，見例如Rocha-Sosa等,EMBO J.8(1989),29-33。
采用基于農(nóng)桿菌屬的載體轉(zhuǎn)化單子葉植物也有描述(Chan等，植物分子生物學(xué)22(1993),491-506；Hiei等，植物雜志6(1994)271-282；Deng等，中國(guó)科學(xué)(Science in China)33(1990),28-34；Wilmink等，植物細(xì)胞報(bào)道(Plant Cell Reports)11(1992),76-80；May等，Bio/Technology13(1995),486-492；Connor和Domisse,Int.J.Plant Sci.153(1992),550-555；Ritchie等，轉(zhuǎn)基因研究(Transgenic Res.)2(1993),252-265)。單子葉植物轉(zhuǎn)化的另一個(gè)系統(tǒng)是通過(guò)生物轟擊途徑轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux,植物生理學(xué)104(1994),37-48；Vasil等,Bio/Technology 11(1993),1553-1558；Ritala等，植物分子生物學(xué)24(1994),317-325；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79(1990),625-631)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、部分透化細(xì)胞的電穿孔、通過(guò)玻璃纖維導(dǎo)入DNA。特別地，玉米的轉(zhuǎn)化在文獻(xiàn)中有多次描述(見例如WO 95/06128,EP 0513849,EO 0465875,EP 292435；Fromm等，生物技術(shù)(Biotechnology)8(1990),833-844；Gordon-Kamm等，植物細(xì)胞〔PlantCell)2(1990),603-618；Koziel等，生物技術(shù)11(1993),194-200；Moroc等，Theor.Appl.Genet.80(1990),721-726)。
其它谷類的成功轉(zhuǎn)化也有描述，例如大麥(Wan和Lemaux,loc.cit.,Ritala等,loc.cit.,Krens等，自然(Nature)296(1982),72-74)和小麥(Nehra等，植物雜志5(1994),285-297)。
為了在植物細(xì)胞中表達(dá)編碼ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的有義或反義方向的核酸分子，所述核酸分子優(yōu)選與確保在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA元件相連。特別地，所述元件包括啟動(dòng)子。通常任何在植物中有活性的啟動(dòng)子都是適合的。
可選擇啟動(dòng)子以使表達(dá)組成型發(fā)生，或僅在特定組織、植物發(fā)育的特定時(shí)間點(diǎn)或外部因素確定的時(shí)間點(diǎn)發(fā)生。對(duì)于植物和核酸分子，啟動(dòng)子均可是同源或異源的。
適合的啟動(dòng)子是例如用于組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒35S RNA啟動(dòng)子和玉米泛素啟動(dòng)子、用于馬鈴薯塊莖特異表達(dá)的patatin基因啟動(dòng)子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989),23-29)和保證只在光合活躍組織中表達(dá)的啟動(dòng)子如ST-LS1啟動(dòng)子(Stockhaus等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊84(1987),7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989),2445-2451)或用于胚乳特異表達(dá)的小麥HMG啟動(dòng)子、USP啟動(dòng)子、菜豆蛋白啟動(dòng)子、玉米的玉米蛋白基因啟動(dòng)子(Pedersen等，細(xì)胞(Cell)29(1982),1015-1026；Quatroccio等，植物分子生物學(xué)15(1990),81-93)、谷蛋白啟動(dòng)子(Leisy等，植物分子生物學(xué)14(1990),41-50；Zheng等，植物雜志4(1993),357-366；Yoshihara等，F(xiàn)EBS Lett.383(1996),213-218)或shrunken-1啟動(dòng)子(Werr等，EMBO J.4(1985),1373-1380)。然而，也可使用僅在外部因素確定的時(shí)間點(diǎn)激活的啟動(dòng)子(見例如WO 9307279)。在本文中，特別感興趣的是允許簡(jiǎn)單誘導(dǎo)的熱激蛋白啟動(dòng)子。而且，可采用種子特異的啟動(dòng)子如Vicia faba的保證在Vicia faba和其它植物種子中特異性表達(dá)的USP啟動(dòng)子(Fiedler等，植物分子生物學(xué)22(1993),669-679；Bumlein等，Mol.Gen.Genet.225(1991),459-467)。
上述胚乳特異啟動(dòng)子的實(shí)施方案特別適于在胚乳中增加淀粉含量。與此相反，感興趣的是使用胚特異啟動(dòng)子增加油的含量，因?yàn)橛椭饕A藏在胚中。
因此，優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明采用保證在胚或種子中表達(dá)的啟動(dòng)子。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是玉米的球蛋白-1(glb1)啟動(dòng)子(Styer和Cantliffe，植物生理學(xué)6(1984),196-200)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，胚特異啟動(dòng)子來(lái)自植物，優(yōu)選Cuphea lanceolata、Brassica rapa或Brassica napus。特別優(yōu)選的是啟動(dòng)子pCIFatB3和pCIFatB4(WO95/07357)。它們分別是基因CIFatB3和CIFatB4的啟動(dòng)子，它們已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因油菜中成功地用于中等鏈脂肪酸的生物合成，因此對(duì)于本發(fā)明的方案具有適合的表達(dá)窗口。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，采用pCIGPDH啟動(dòng)子(WO 95/06733)、napin(參見例如Kridi，種子科學(xué)研究(Seed Sci.Res.)1(1991),209-219；Ellerstrom等，植物分子生物學(xué)32(1996),1019-1027；Stalberg等，Planta199(1996),515-519)或oleosin啟動(dòng)子(見例如Keddie，植物分子生物學(xué)(1994)327-340；Plant等，植物分子生物學(xué)25(1994),193-205)。
而且，可存在一個(gè)終止序列用作轉(zhuǎn)錄的正確終止和給轉(zhuǎn)錄本添加被認(rèn)為能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本的poly-A尾。所述元件見文獻(xiàn)(見例如Gielen等，EMBOJ.8(1989),23-29)，并可按需要互換。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物合成的淀粉與野生型植物合成的淀粉相比在理化上特別是在直鏈淀粉/支鏈淀粉比率上改變，優(yōu)選由于質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加或降低引起。特別地，與野生型淀粉相比，可針對(duì)所述淀粉膠的粘性和/或凝膠形成特性來(lái)改變所述淀粉。
因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生修飾淀粉的方法，包括從上述植物之一和/或所述植物淀粉貯藏部分提取淀粉的步驟。優(yōu)選地，所述方法還包括提取淀粉之前收獲栽培的植物和/或所述植物的淀粉貯藏部分，特別優(yōu)選地，還包括收獲前栽培本發(fā)明植物的步驟。從植物或植物貯藏淀粉的部分提取淀粉的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。而且，從各種淀粉貯藏植物提取淀粉的方法都有描述，見如“淀粉化學(xué)和技術(shù)(Starch:Chemistry andTechnology)”(編者Whistler,BeMiller和Paschall(1994)，第2版，Academic Press Inc.London Ltd；ISBN 0-12-746270-8；見例如第Ⅻ章，第412-468頁(yè)玉米和高粱淀粉生產(chǎn)(maize and sorghum starch:production)；Watson著；第ⅩⅢ章，第469-479頁(yè)木薯、竹芋和西米的淀粉生產(chǎn)(starches from tapioca,arrowroot and sago:production)；Corbishley和Miller著；第ⅩⅣ章，第491-506頁(yè)小麥的淀粉生產(chǎn)、修飾和用途(starch from wheat:production,modification and uses)；Knight和Oson著；第ⅩⅥ章，第507-528頁(yè)水稻的淀粉生產(chǎn)和用途(starch from rice:production and uses)；Rohmer和Klem著；玉米的淀粉(starch from maize):Eckhoff等，谷類化學(xué)(Cereal Chem.)73(1996)54-57，按工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)從玉米提取淀粉通常通過(guò)所謂“濕磨”來(lái)實(shí)現(xiàn))。通常采用的用于從植物材料提取淀粉之方法的器具是分離器、傾析器、水力旋流器、噴射干燥器和流化床干燥器。
另外，本發(fā)明的主題是可從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和繁殖材料獲得的淀粉和可通過(guò)上述本發(fā)明方法獲得的淀粉。
本發(fā)明的淀粉可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法修飾并以未修飾或修飾形式適于食品或非食品工業(yè)中的多種用途。
原則上，可能的用途可分為兩個(gè)領(lǐng)域。一個(gè)領(lǐng)域包括淀粉的水解產(chǎn)物，主要是通過(guò)酶或化學(xué)方法獲得的葡萄糖和葡聚糖結(jié)構(gòu)單元。它們用作供進(jìn)一步化學(xué)修飾和加工如發(fā)酵的初始材料。為了降低成本，水解方法的簡(jiǎn)便和便宜可能是重要的。目前，該方法基本是使用淀粉葡糖苷酶酶解。通過(guò)減少酶的使用將有可能節(jié)約成本。這可通過(guò)改變淀粉的結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)，如谷粒表面擴(kuò)大、低分支程度引起的更容易消化或限制所用酶接近的空間結(jié)構(gòu)。另一個(gè)領(lǐng)域即由于其聚合結(jié)構(gòu)淀粉與所謂的天然淀粉一樣使用，可再進(jìn)一步劃分成兩個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域1．在食品中的應(yīng)用淀粉是各種食品的典型添加物，其中它基本用作水性粘合添加物和/或引起粘性或凝膠形成提高。重要特性是流動(dòng)和吸附性能、溶脹和糊化溫度、粘性和增稠性、淀粉的溶解度、透明度和糊劑結(jié)構(gòu)、熱、剪切和酸抗性、退化傾向、膜形成能力、耐凍/融性、可消化性以及與例如無(wú)機(jī)或有機(jī)離子形成復(fù)合物的能力。
2．在非食品中的應(yīng)用另一個(gè)主要應(yīng)用領(lǐng)域是在各種生產(chǎn)過(guò)程中使用淀粉作為輔助劑或在技術(shù)產(chǎn)品中用作添加劑。使用淀粉作為輔助劑的主要應(yīng)用領(lǐng)域首先是紙和紙板工業(yè)。在該領(lǐng)域淀粉主要用于滯留(滯留固體)、對(duì)填充物和細(xì)微顆粒大小分級(jí)、使物質(zhì)凝固和脫水。此外，還利用淀粉在稠度、硬度、聲音、手感、光澤、平滑、撕裂強(qiáng)度以及表面的優(yōu)點(diǎn)。
2.1紙和紙板工業(yè)在紙生產(chǎn)過(guò)程中，可區(qū)分出4個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域，即表面、涂層、備料和噴霧。表面處理對(duì)淀粉的要求主要是高亮度、相應(yīng)粘性、高粘性穩(wěn)定性、良好的膜形成以及低產(chǎn)塵。當(dāng)用于固體內(nèi)容物涂層時(shí)，相應(yīng)粘性、高結(jié)合能力以及高色素親合力有重要作用。作為備料添加劑，在紙漿中快速、均一、不損耗的分散，高機(jī)械穩(wěn)定性和完全滯留是重要的。當(dāng)使用淀粉噴霧時(shí)，固體的相應(yīng)含量、高粘性和高結(jié)合能力也是重要的。
2.2粘合劑工業(yè)一個(gè)主要應(yīng)用領(lǐng)域是例如粘合劑工業(yè)，其中該應(yīng)用領(lǐng)域再分為4個(gè)領(lǐng)域用作純淀粉膠、在以特殊化學(xué)制品制備的淀粉膠中的應(yīng)用、使用淀粉作為合成樹脂和聚合分散相的添加劑以及使用淀粉作為合成粘合劑的增充劑。所有基于淀粉的粘合劑的90％用于生產(chǎn)瓦楞紙板、各種紙袋、紙和鋁的復(fù)合材料、紙盒和信封、郵票等的濕膠。
2.3紡織品和織物保養(yǎng)品作為輔助劑和添加劑的另一個(gè)用途是生產(chǎn)紡織品和織物保養(yǎng)品。在紡織品工業(yè)中，可區(qū)分下列4個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒌矸塾米魃蠞{劑，即作為平滑處理和加強(qiáng)去毛刺性能的輔助劑以對(duì)抗紡織中牽引的張力以及提高紡織過(guò)程中的耐磨強(qiáng)度，用作主要在質(zhì)量降低性預(yù)處理如漂白、染色等之后紡織品的整理劑，用作生產(chǎn)染料糊劑的增稠劑以避免染料擴(kuò)散，和用作縫紉紗線束縛劑的添加劑。
2.4建筑業(yè)而且，淀粉可用作建筑材料的添加劑。一個(gè)例子是石膏板板材的生產(chǎn)，其中在稀石膏漿中混合的淀粉與水一起糊化、在石膏板表面擴(kuò)散因而使紙板與該板粘合。其它應(yīng)用領(lǐng)域是將淀粉與泥灰和礦物纖維混合。
在混合好的混凝土中，淀粉可用于減緩硬化過(guò)程。
2.5土壤穩(wěn)定化另外，淀粉在生產(chǎn)土壤穩(wěn)定劑中是有利的，可用于在人工侵?jǐn)n土壤時(shí)臨時(shí)性保護(hù)土壤顆粒免于失水。根據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有知識(shí)，由淀粉和聚合物乳劑組成的混合產(chǎn)品可認(rèn)為具有與現(xiàn)有產(chǎn)品相同的降低沖蝕和結(jié)殼的作用；然而，它們便宜得多。
2.6在植物保護(hù)劑和肥料中的應(yīng)用另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是淀粉用于植物保護(hù)劑中以改變這些制品的特定性質(zhì)。例如，可使用淀粉改善植物保護(hù)劑和肥料的可潤(rùn)濕性以便定量釋放有效成分，將液體、揮發(fā)性和/或不良?xì)馕兜挠行С煞洲D(zhuǎn)換成微晶、穩(wěn)定、可變形的物質(zhì)，混合不相容組合物和由于分解減緩而延長(zhǎng)作用持續(xù)時(shí)間。
2.7藥品、醫(yī)療和化妝品工業(yè)淀粉也可用于藥品、醫(yī)療和化妝品工業(yè)領(lǐng)域。在制藥工業(yè)中，淀粉可用作片劑粘合劑或膠囊粘合劑的稀釋。此外，淀粉適于用作片劑的崩解劑，因?yàn)橥谭笏找后w并在短時(shí)間后溶脹以致活性成分釋放。由于性質(zhì)上的原因，其它應(yīng)用領(lǐng)域是醫(yī)療潤(rùn)滑和療傷撲粉。在化妝品領(lǐng)域，例如淀粉可用作粉末添加物如香水和水楊酸的載體。淀粉的一個(gè)相當(dāng)廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域是牙膏。
2.8淀粉作為煤和煤球的添加物淀粉也可用作煤和煤球的添加物。通過(guò)加入淀粉，煤可定量地結(jié)塊和/或制成高質(zhì)量的煤球，從而防止煤球過(guò)早分解。燒烤用煤添加了4％-6％淀粉，高熱煤含有約0.1％-0.5％淀粉。而且，淀粉適于作為粘結(jié)劑，因?yàn)樵诿汉兔呵蛑屑尤氲矸劭娠@著減低有害物質(zhì)的釋放。
2.9礦石和煤漿的加工另外，淀粉可用作礦石和煤漿的加工過(guò)程中的凝聚劑。
2.10鑄造材料的添加物另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是用作加工鑄造材料的添加物。對(duì)于各種鑄造工藝，需要從沙石混合粘合劑產(chǎn)生的核心。目前最常用的粘合劑是混合了改性淀粉、主要是溶脹淀粉的膨潤(rùn)土。加入淀粉的目的是增加流動(dòng)阻力以及改善結(jié)合強(qiáng)度。而且溶脹淀粉可符合更多的生產(chǎn)工藝的必要條件如冷水中的可分散性、再水合能力、與沙石的良好混合性和高度水結(jié)合能力。
2.11橡膠工業(yè)在橡膠工業(yè)中淀粉可用于改善技術(shù)和光學(xué)質(zhì)量。其原因是改善表面光澤、手感和外觀。為此，在冷固化之前將淀粉分散在粘性的橡膠物質(zhì)的橡膠處理表面。也可用于改善橡膠的可印刷性。
2.12皮革替代品的生產(chǎn)改性淀粉的另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是生產(chǎn)皮革替代品。
2.13合成聚合物中的淀粉在塑料市場(chǎng)存在下列應(yīng)用領(lǐng)域淀粉產(chǎn)品在工藝中的應(yīng)用(淀粉只是填充劑，合成聚合物和淀粉之間沒(méi)有直接鍵合)，或淀粉產(chǎn)物在聚合物的生產(chǎn)中應(yīng)用(淀粉和聚合物形成穩(wěn)定的鍵)。
使用淀粉作為純填充劑不能與其它物質(zhì)如滑石競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)特定淀粉性質(zhì)變得有效因而終產(chǎn)物的性質(zhì)明顯改變時(shí)這種情況就不同了。一個(gè)例子是淀粉產(chǎn)品在熱塑性材料如聚乙烯的加工過(guò)程中的應(yīng)用。由此，淀粉和合成聚合物通過(guò)共作用以1∶1的比例結(jié)合形成“母材料”，由此使用制成粒狀的聚乙烯采用常規(guī)技術(shù)可生產(chǎn)各種產(chǎn)品。淀粉在聚乙烯膜中的整合可造成增加空心體中物質(zhì)通透性，改善水蒸氣通透性，改善抗靜電性能，改善抗阻塞性能以及改善水染料的可印刷性。
另一種可能是淀粉在聚氨酯泡沫膠中的應(yīng)用。由于淀粉衍生物的適應(yīng)性以及加工技術(shù)的優(yōu)化，有可能特定控制合成聚合物和淀粉羥基之間的反應(yīng)。結(jié)果是由于淀粉的使用聚氨酯膜具有下列特性降低熱膨脹系數(shù)、減小收縮性、改善壓力/張力性能、增加水蒸氣通透性而不改變水的吸收、降低可燃性和破裂密度、可燃部分無(wú)液滴形成、無(wú)鹵化物和減緩老化。目前仍然存在的缺點(diǎn)是壓力和沖擊強(qiáng)度降低。
開發(fā)膜產(chǎn)品不是唯一選擇。也可利用含量為50％以上的淀粉生產(chǎn)固體塑料產(chǎn)品如罐、盆、碗等。而且，淀粉/聚合物混合物具有更容易生物降解的優(yōu)點(diǎn)。
另外，由于它們極易結(jié)合水，淀粉接枝聚合物具有極大的重要性。這些產(chǎn)品具有淀粉骨架和根據(jù)自由基鏈反應(yīng)機(jī)制在其上接枝的合成單體的側(cè)鏈。目前已有的淀粉接枝聚合物的特征是結(jié)合和保持水的能力改善，達(dá)到高粘度時(shí)每g淀粉1000g水。這些超吸收劑主要用于衛(wèi)生領(lǐng)域，如尿布和床單等產(chǎn)品，以及農(nóng)業(yè)部門如種子小球。
一方面，重組DNA技術(shù)修飾的新淀粉的應(yīng)用取決于結(jié)構(gòu)、含水量、蛋白含量、脂含量、纖維含量、灰/磷酸含量、直鏈淀粉/支鏈淀粉比、相對(duì)摩爾質(zhì)量的分布、支化度、顆粒大小和形狀以及結(jié)晶性，另一方面取決于導(dǎo)致下列性質(zhì)的特性流動(dòng)和吸附性能、糊化溫度、粘性、增稠性能、溶解度、糊劑結(jié)構(gòu)、透明性、熱、剪切和酸的耐性、退化傾向、凝膠形成的能力、耐凍/融性、形成復(fù)合物的能力、碘的結(jié)合、膜形成、粘合強(qiáng)度、酶穩(wěn)定性、可消化性和反應(yīng)性。
通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物遺傳操作產(chǎn)生修飾的淀粉可修飾該植物淀粉的特性，從而不再需要通過(guò)多種化學(xué)或物理方法進(jìn)行進(jìn)一步修飾。另一方面，用重組DNA技術(shù)修飾的淀粉可進(jìn)行進(jìn)一步化學(xué)修飾，這將為某些上述應(yīng)用領(lǐng)域產(chǎn)生進(jìn)一步的質(zhì)量改善。這些化學(xué)修飾是基本上是已知的。這些修飾特別是下列方法-熱處理
-酸處理-氧化和-酯化作用這些修飾導(dǎo)致形成磷酸、硝酸、硫酸、黃原酸、乙酸和檸檬酸淀粉。其它有機(jī)酸也可用于酯化-形成淀粉醚淀粉烷基醚、O-烯丙基醚、羥烷基醚、O-羧甲基醚、含氮淀粉醚、含磷淀粉醚和含硫淀粉醚。
-形成分支淀粉-形成淀粉接枝聚合物

圖1圖示質(zhì)粒pJT31(AATP1(擬南芥)有義鏈)；圖2圖示質(zhì)粒pJT32(AATP1(Solanum tuberosum)反義鏈)；圖3顯示擬南芥的AATP2氨基酸序列與AATP1(擬南芥)以及普氏立克次氏體的同源蛋白質(zhì)(Williamson等，基因80(1989),269-278)的比較；圖4根據(jù)von Heijne等(Eur.J.Biochem.180(1989),535-545)的方法進(jìn)行的AATP2(擬南芥)、AATP1(擬南芥)和立克次氏體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親水性分析。圖5顯示在ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白反義植物的葉和塊莖中AATP1(Solanum tuberosum)表達(dá)的Northern印跡分析；圖6顯示在ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過(guò)表達(dá)植物的葉和塊莖中AATP1(擬南芥)表達(dá)的Northern印跡分析；圖7胚特異基因表達(dá)的pTE200盒的示意圖。EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、NotⅠ、XbaⅠ、Sacl、KpnⅠ、ApaⅠ、SalⅠ和SfiⅠ標(biāo)出限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。為了實(shí)用的理由，SfiⅠ(A)和SfiⅠ(B)在識(shí)別的序列中具有不同的可變核苷酸序列?？s寫代碼如下PCIFatB4=CIFatB4啟動(dòng)子，tCIFatB4=CIFatB4終止子，amp=細(xì)菌的氨芐青霉素抗性，ColEⅠori=質(zhì)粒ColEⅠ的“復(fù)制起點(diǎn)”，fl(-)ori=噬菌體fl的“復(fù)制起點(diǎn)”。圖8 ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)盒pTE208的示意圖載體pTE200(圖7)的該衍生物攜帶有義方向的Solanum tuberosum質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼cDNA。圖9二元載體pMH000-0的示意圖。SfiⅠ、SalⅠ、ClaⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、NsiⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、Notl、KpnⅠ、BglⅡ、ApaⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ和BstEⅡ標(biāo)出限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。如上所述，SfiⅠ(A)和SfiⅠ(B)識(shí)別序列具有不同的可變核苷酸序列。這就防止了SfiⅠ酶切后起始質(zhì)粒的重新環(huán)化，并且使pTE200衍生物的表達(dá)盒定向插入成為可能。縮寫代碼如下RB,LB=右邊界區(qū)和左邊界區(qū)，t35S=CaMV 35S rna基因的終止信號(hào)，pat=膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶基因，p35S=CaMV 35S rna基因的啟動(dòng)子，p35S(min)=CaMV 35S rna基因的最小啟動(dòng)子，tp-sul=帶有轉(zhuǎn)運(yùn)肽的磺胺類藥物抗性基因，tnos=胭脂堿合成酶基因的終止信號(hào)，Sm/Sp=細(xì)菌的鏈霉素和壯觀霉素抗性，parA,parB和parR=具有廣譜宿主范圍如根癌農(nóng)桿菌和大腸桿菌的質(zhì)粒pVS1的質(zhì)粒多功能。
下列實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1細(xì)菌表達(dá)載體pJT118的構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥的AATP2蛋白在N端融合含有10個(gè)氨基酸的“組氨酸標(biāo)簽”。為此，通過(guò)PCR方法分離編碼擬南芥的全長(zhǎng)AATP2蛋白的cDNA。下列寡核苷酸用作有義引物，此外它還含有一個(gè)XhoⅠ限制性位點(diǎn)cgtgagagatagagagctcgagggtctgattcaaacc(SEQ ID NO:1)；包含堿基對(duì)66-102。
用另外攜帶一個(gè)BamHⅠ限制性位點(diǎn)的寡核苷酸作為反義引物gatacaacaggaatcctggatgaagc(SEQ ID NO:2)；包含堿基對(duì)1863-1835。獲得的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠法純化，用限制性酶XhoⅠ/BamHⅠ切割，導(dǎo)入質(zhì)粒pET16b(Novagene,Heidelberg，德國(guó))的閱讀框內(nèi)。這導(dǎo)致在編碼全長(zhǎng)擬南芥的AATP2蛋白質(zhì)的cDNA的N-端顯示一個(gè)10個(gè)氨基酸的組氨酸標(biāo)簽(His-AATP2)。所述載體稱為pJT118。PCR產(chǎn)物的序列通過(guò)測(cè)定兩條核苷酸鏈的序列來(lái)確定(Eurogentec)。大腸桿菌C43的轉(zhuǎn)化(Miroux和Walker,分子生物學(xué)雜志260(1996),289-298)按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。大腸桿菌C43允許動(dòng)物(Miroux和Walker,loc.cit.)和植物(Tjaden等，J.Biol.Chem.(1998))膜蛋白的異源表達(dá)。
載體pJT118轉(zhuǎn)化所述菌株后，用放射性標(biāo)記的ADP和ATP進(jìn)行攝取研究。可通過(guò)這些研究說(shuō)明His-AATP2可在大腸桿菌C43的細(xì)胞質(zhì)膜中功能性表達(dá)。這說(shuō)明AATP2實(shí)際上編碼ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。N末端組氨酸標(biāo)簽的存在導(dǎo)致大腸桿菌中擬南芥來(lái)源的AATP2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性較無(wú)N末端組氨酸標(biāo)簽的AATP2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性高(2x-3x)。
片段B除了側(cè)翼區(qū)外還含有擬南芥ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AATP1)的蛋白編碼區(qū)。所述區(qū)域按如上所述分離，并以有義方向與pBinAR的35S啟動(dòng)子融合。
片段C(215bp)含有根癌農(nóng)桿菌章魚堿合成酶基因的聚腺苷酸化信號(hào)。
質(zhì)粒pJT31的大小約14.2kb。
按Rocha-Sosa等(EMBO J.8(1989),23-29)所述利用農(nóng)桿菌將該質(zhì)粒導(dǎo)入馬鈴薯植物。轉(zhuǎn)化結(jié)果，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯顯示質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的增加。這用Northern印跡分析檢測(cè)(見圖6)。按標(biāo)準(zhǔn)方法從馬鈴薯植物的葉和塊莖組織分離RNA，將50ug RNA在瓊脂糖凝膠(1.5％瓊脂糖，1×MEN緩沖液，16.6％甲醛)上分離。電泳后通過(guò)毛細(xì)管印跡法用20×SSC將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜Hybond N(Amersham,UK)上。通過(guò)UV照射將RNA固定在膜上。將膜在磷酸雜交緩沖液中預(yù)雜交2小時(shí)(Sambrook等，loc.cit.)，然后加入放射性標(biāo)記探針雜交10小時(shí)。
通過(guò)插入該cDNA片段，形成由如下片段A、B和C構(gòu)成的表達(dá)盒(見圖2)片段A(540bp)含有花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。
片段B含有S.tuberosum ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AATP1 S.t.)的一個(gè)長(zhǎng)1265bp的區(qū)域。該區(qū)域以反義方向與pBinAR的35S啟動(dòng)子融合。
片段C(215bp)含有根癌農(nóng)桿菌章魚堿合成酶基因的聚腺苷酸化信號(hào)。
質(zhì)粒pJT32的大小約13.3kb。
按Rocha-Sosa等(EMBO J.8(1989),23-29)所述利用農(nóng)桿菌將該質(zhì)粒導(dǎo)入馬鈴薯植物。轉(zhuǎn)化結(jié)果，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯顯示質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的降低。這用Northern印跡分析檢測(cè)(見圖5)。按標(biāo)準(zhǔn)方法從馬鈴薯植物的葉和塊莖組織分離RNA，將50ug RNA在瓊脂糖凝膠(1.5％瓊脂糖，1×MEN緩沖液，16.6％甲醛)上分離。電泳后通過(guò)毛細(xì)管印跡法用20×SSC將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜Hybond N(Amersham,UK)上。通過(guò)UV照射將RNA固定在膜上。將膜在磷酸雜交緩沖液中預(yù)雜交2小時(shí)(Sambrook等，loc.cit.)，然后加入放射性標(biāo)記探針雜交10小時(shí)。
實(shí)施例4
分析轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物的淀粉、直鏈淀粉和糖含量可溶性糖含量的測(cè)量按Lowry和Passonneau在“靈活的酶法分析系統(tǒng)(A Flexible System of Enzymatic Analysis)”,Academic Press,NewYork,USA(1972)中所述進(jìn)行。淀粉含量的測(cè)定按Batz等(植物生理學(xué)100(1992),184-190)所述進(jìn)行。表1
直鏈淀粉含量的測(cè)定按Hovenkamp-Hermelink等(馬鈴薯研究(Potato Res.)31(1988),241-246)所述進(jìn)行
實(shí)施例5產(chǎn)生表達(dá)盒并轉(zhuǎn)化油菜植物pBluescript衍生質(zhì)粒的表達(dá)盒pTE200(Short等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)16,(1988),7583-7600)攜帶Cuphea lanceolata的硫酯酶基因CIFatB4(GenBank號(hào)AJ 131741)的啟動(dòng)子和終止子序列和用于插入各種有用基因的適當(dāng)多接頭序列。在可變識(shí)別區(qū)具有不相容核苷酸的外國(guó)SfiⅠ識(shí)別位點(diǎn)允許將包括有用基因的整個(gè)表達(dá)盒定向轉(zhuǎn)移至二元質(zhì)粒載體pMH000-0(pLH9000的進(jìn)一步發(fā)展)(Hausmann和Tpfer,(1999)第9章"Entwicklung von Plasmid-Vektoren"in Bioengineering fürRapssorten nach Ma β,D.Brauer,G.Rbbelen和R.Tpfer(編)，Vortrge für Planzenzüchtung，第45卷，155-172)的相應(yīng)限制位點(diǎn)中，并防止受體載體中DNA的重新環(huán)化。
為了產(chǎn)生表達(dá)盒pTE200，首先從含有C.lanceolata完整CIFatB4基因的基因組克隆CITEg16(WO95/07357)分離含有啟動(dòng)子的長(zhǎng)約3.3kb的SalⅠ-BbvⅠ片段。為此，切割并修飾啟動(dòng)子3’端的BbvⅠ限制性位點(diǎn)，以使該片段能被SalⅠ和SmaⅠ切割的pBluescript(stratagene)接受。通過(guò)切割、用T4聚合酶修飾然后再連接缺失該片段5’端第1211位核苷酸處的內(nèi)部EcoR限制性位點(diǎn)。
利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和特異寡核苷酸引物從CITEg16模板(WO95/07357)中擴(kuò)增終止子序列，并通過(guò)引物提供多接頭限制性位點(diǎn)(MCS)。引物的序列是5′GAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTCGAGAAGTGGCTGGGGGCCTTTCC3′(SEQ ID NO:3)=5′-引物(MCS:EcoRⅠ,PstⅠ,SmaⅠ,BamHⅠ,SpeⅡ XhoⅠ；CIFatB4終止子位置35-56)和5′TCTAGAGGCCAAGGCGGCCGCTTCAACGGACTGCAGTGC3 ′(SEQ ID NO:4)=3′-引物CIFatB4終止子位置22-39,MCS:NotⅠ,StyⅠ,SfiⅠ,XbaⅠ。用EcoRⅠ和NotⅠ切割擴(kuò)增產(chǎn)物并插入pBlueSfi BA(Hausmann和Tpfer,見上)的相應(yīng)限制性位點(diǎn)。攜帶啟動(dòng)子的片段用BamHⅠ打開、修飾、然后用SalⅠ切割以通過(guò)終止子前面的SalⅠ和HindⅢ限制性位點(diǎn)將其置于pBlueSfi BA載體中。結(jié)果獲得表達(dá)盒pTE200(見圖7)。
為了構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體，將Solanum tuberosum的AATP1cDNA(pTMⅠ,Tjaden等，The Plant Journal 16(1998)531-540)長(zhǎng)2270bp的EcoRⅠ片段連入用EcoRⅠ打開的載體pTE200中。方向通過(guò)限制性消化控制。結(jié)果是質(zhì)粒pTE208(圖8)。在后面的步驟中，pTE208的SfiⅠ片段以定向方式插入二元載體pMH000-0的多接頭限制性位點(diǎn)中(圖9)。結(jié)果獲得載體pMH 0208。
二元質(zhì)粒載體pMH000-0從pLH9000(Hausmann和Tpfer,見上)進(jìn)一步發(fā)展而來(lái)，具有供植物轉(zhuǎn)化的替代篩選標(biāo)記。在Asp718修飾至XhoⅠ限制性位點(diǎn)后，將磺胺類藥物基因(sul)與二磷酸核酮糖羧化酶小亞基轉(zhuǎn)入質(zhì)體的信號(hào)肽(tp)一起從前體質(zhì)粒pS001(Reiss等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊93,(1996),3094-3098)分離出來(lái)。在質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ修飾后，將XhoⅠ-SalⅠ片段插入pBluescript衍生質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因(pAnos)終止子前面的XhoⅠ和BamHⅠ限制性位點(diǎn)。在隨后的三片段連接中，將獲得的tpsul-pAnos片段(XhoⅠ-XbaⅠ)和pRT103pat(Tpfer等，酶學(xué)方法(Methods in Enzymol.)217,(1993),66-78)的XhoⅠ-HindⅢ片段和用XbaⅠ和HindⅢ打開的質(zhì)粒pK18(Pridmore，基因56,(1987),309-312)連接。結(jié)果，含有來(lái)自pRT103pat的CaMV35S rna基因終止子的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因以與tpsul-pAnos單位相反方向放置。將CaMV35S基因雙啟動(dòng)子作為pROA93子代(Ott et al.,Mol.Gen.Genet.221,(1990),121-124)的XhoⅠ片段插入抗性介導(dǎo)基因序列之間的XhoⅠ位點(diǎn)以完成所述雙選擇單位(抗除草劑Basta和磺胺類藥物磺胺嘧啶的抗性)。在鄰近多接頭中進(jìn)行相應(yīng)修飾后，獲得的雙選擇盒通過(guò)XbaⅠ和HindⅢ與pLH9000前體質(zhì)粒(Hausmann和Tpfer,見上)中的卡那霉素盒交換。結(jié)果獲得二元質(zhì)粒載體pMH000-0。
油菜品種Drakkar胚軸外植體的轉(zhuǎn)化按照De Block(Plant Physiol.91(1989),694-701)的程序利用攜帶二元載體pMH0208(ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有義)的農(nóng)桿菌(株系GV 3101 C58C1 Rifr)進(jìn)行。在選擇營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(磺胺類藥物)上再生芽，并種植在溫室中直到種子成熟。采用PCR和葉片檢測(cè)(對(duì)glufosinatammonium(Basta)的耐受性)，測(cè)定哪些植物含有轉(zhuǎn)基因。從所述植物收獲各種發(fā)育階段的成熟胚并保存在液氮中。
為了測(cè)定油含量，用非侵入近紅外光譜法分析轉(zhuǎn)基因油菜系和對(duì)照系的成熟種子(見例如Schulz等,J.Near Infrared Spectrosc.6,(1998),A125-A130；Starr等,J.Agric.Sci.104(2),(1985),317-323)。
序列表<110>PlantTec Biotechnologie GmbH Forschung&EntwicklungMax-Planck-Gesellschaft zur Frderung der Wissenschaften<120>質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性改變的轉(zhuǎn)基因植物<130>C 1540 PCT<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工<400>1cgtgagagat agagagctcg agggtctgat tcaaacc 37<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工<400>2gatacaacag gaatcctgga tgaagc 26<210>3<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工<400>3gaattcctgc agcccggggg atccactagt ctcgagaagt ggctgggggc ctttcc56<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人工<400>4tctagaggcc aaggcggccg cttcaacgga ctgcagtgc39
權(quán)利要求
1．遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中該遺傳修飾是導(dǎo)入外源核酸分子，與來(lái)自野生型植物的相應(yīng)未遺傳修飾植物細(xì)胞相比所述核酸分子的存在或表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中外源核酸分子編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中核酸分子編碼擬南芥的質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其與相應(yīng)未遺傳修飾的植物細(xì)胞相比顯示產(chǎn)量增加。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其與相應(yīng)未遺傳修飾的植物細(xì)胞相比顯示油和/或淀粉含量增加。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5之任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其合成與相應(yīng)未遺傳修飾的植物細(xì)胞相比直鏈淀粉含量增加的淀粉。
7．含有根據(jù)權(quán)利要求1-6之任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物，其是油和/或淀粉貯藏植物。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物，其是玉米、油菜、小麥或馬鈴薯植物。
10．產(chǎn)生與野生型植物相比顯示產(chǎn)量增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中(a)通過(guò)導(dǎo)入外源核酸分子對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，所述外源核酸分子的存在或表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞中質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加；(b)從根據(jù)步驟(a)產(chǎn)生的細(xì)胞再生植物；和(c)可選擇地從根據(jù)步驟(b)產(chǎn)生的植物產(chǎn)生后代植物。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物相比顯示油和/或淀粉含量增加和/或其淀粉與野生型植物的淀粉相比顯示直鏈淀粉含量增加。
12．通過(guò)權(quán)利要求10或11的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物。
13．權(quán)利要求7-9或12之任一項(xiàng)的植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料含有權(quán)利要求1-6之任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
14．編碼質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸分子在產(chǎn)生與野生型植物相比顯示產(chǎn)量增加的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中與野生型植物相比轉(zhuǎn)基因植物顯示油和/或淀粉含量增加和/或合成顯示直鏈淀粉含量增加的淀粉。
16．產(chǎn)生修飾淀粉的方法，包括從根據(jù)權(quán)利要求7-9之任一項(xiàng)或根據(jù)權(quán)利要求12的植物提取淀粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及與野生型細(xì)胞或植物相比顯示產(chǎn)量增加特別是油和/或淀粉含量增加的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物,其優(yōu)選合成修飾的淀粉。所述植物顯示質(zhì)體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的增加或降低。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1306578SQ99807581
公開日2001年8月1日 申請(qǐng)日期1999年5月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月13日
發(fā)明者E·紐豪斯, T·莫爾曼, K－H·格拉夫－坎普芬凱爾, J·特加登 申請(qǐng)人:普蘭泰克生物技術(shù)有限公司