本發(fā)明屬于有機(jī)磷化合物的降解技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種聚合物微球功能化氧化石墨烯的合成方法及其催化降解有機(jī)磷的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

有機(jī)磷酸酯化合物常被廣泛的應(yīng)用于殺蟲(chóng)劑、增塑劑、石油添加劑和化學(xué)戰(zhàn)爭(zhēng)毒劑，尤其是有機(jī)磷酸三酯，如對(duì)氧磷、對(duì)硫磷、馬拉硫磷等，通常作為農(nóng)作物保護(hù)劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。但是這些物質(zhì)具有潛在的毒性，可引起神經(jīng)性休克、麻痹、休克和死亡。在化學(xué)戰(zhàn)爭(zhēng)中用作神經(jīng)毒氣的化合物，如沙林、塔崩和梭曼，也屬于有機(jī)磷酸酯。這些化合物抑制參與神經(jīng)信號(hào)的關(guān)鍵酶——乙酰膽堿酯酶，進(jìn)而引起神經(jīng)性疾病。因此，這些有機(jī)磷酸酯化合物的降解在世界范圍內(nèi)是一個(gè)重要的挑戰(zhàn)，并且許多研究已在努力解決這一重要的問(wèn)題。

目前，研究較為廣泛的降解有機(jī)磷酸酯的方法為酶促水解。盡管天然有機(jī)磷水解酶能高效降解有機(jī)磷，但是其穩(wěn)定性較差，并且不易制備，應(yīng)用受到很大的限制。因此，依據(jù)天然有機(jī)磷水解酶的結(jié)構(gòu)及其降解有機(jī)磷機(jī)理，設(shè)計(jì)合成穩(wěn)定、高效、價(jià)廉的有機(jī)磷水解模擬酶是科研工作者的不懈追求。

天然分離得到的有機(jī)磷水解酶是二聚體，每個(gè)單體C末端有相同的活性位點(diǎn)，每個(gè)活性中心含有2個(gè)Zn²⁺(α和β)，兩個(gè)鋅離子之間的距離為一個(gè)Zn²⁺(α)與兩個(gè)組氨酸及天冬氨酸的殘基配位，另一個(gè)Zn²⁺(β)與兩個(gè)組氨酸的殘基配位，一個(gè)羧化的賴(lài)氨酸和水分子(或氫氧根離子)將兩個(gè)鋅離子橋連在一起，Zn²⁺(α)與OH^-的距離為Zn²⁺(β)與OH^-的距離為

依據(jù)天然有機(jī)磷水解模擬酶的活性中心及水解機(jī)理，發(fā)明人所在的研究小組以1-乙烯基咪唑(1-VI)為功能單體，甲基丙烯酸(MAA)為輔助功能單體，對(duì)氧磷的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物4-硝基芐基(D4NP)為模板分子，通過(guò)分子印跡技術(shù)設(shè)計(jì)合成了具有有機(jī)磷水解模擬酶活性分子印跡聚合物微球。該方法制備的分子印跡聚合物微球的對(duì)氧磷水解酶活性與對(duì)氧磷自發(fā)水解相比，水解效率最大可提高188倍，但該方法制備過(guò)程復(fù)雜，且反應(yīng)完后需要去除模板分子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于提供一種操作簡(jiǎn)單，能夠高效降解有機(jī)磷的聚合物微球功能化氧化石墨烯的合成方法。

本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于為上述方法合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯提供一種新的應(yīng)用。

解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成：

1、氧化石墨烯接枝甲基丙烯酸羥乙酯

將氧化石墨烯酰氯化后超聲分散于無(wú)水N,N-二甲基甲酰胺中，加入甲基丙烯酸羥乙酯，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下滴加無(wú)水三乙胺，回流反應(yīng)12～24小時(shí)，產(chǎn)物經(jīng)甲醇離心洗滌、真空干燥，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯。

2、合成聚合物微球功能化氧化石墨烯

將乙烯基功能化的氧化石墨烯加入到乙腈與甲醇的體積比為9:1的混合液中，室溫超聲分散均勻，加入ZnCl₂、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、二乙烯基苯，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入偶氮二異丁腈，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)、室溫條件下，用波長(zhǎng)為365nm的紫外光照射48～72小時(shí)，并且照射過(guò)程中間歇攪拌；照射完后離心分離，所得固體經(jīng)甲醇洗滌、離心后，用ZnCl₂的甲醇溶液孵育20～40分鐘，所得產(chǎn)物經(jīng)離心分離、真空干燥，得到聚合物微球功能化氧化石墨烯。

上述步驟1中，所述氧化石墨烯與甲基丙烯酸羥乙酯、無(wú)水三乙胺的質(zhì)量比為1:5～10:1.5～3，優(yōu)選氧化石墨烯與甲基丙烯酸羥乙酯、無(wú)水三乙胺的質(zhì)量比為1:8:2。

上述步驟2中，所述乙烯基功能化的氧化石墨烯、ZnCl₂、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、二乙烯基苯、偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為1:0.75～3:0.5～2:4～17:8.5～34:4～16，優(yōu)選乙烯基功能化的氧化石墨烯、ZnCl₂、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、二乙烯基苯、偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為1:1.5:1.0:8.5:17:8。

上述聚合物微球功能化氧化石墨烯在催化降解有機(jī)磷中的應(yīng)用，具體使用方法為：將聚合物微球功能化氧化石墨烯加入到待水解的有機(jī)磷溶液中，室溫振蕩即可催化有機(jī)磷水解，其中聚合物微球功能化氧化石墨烯的加入量根據(jù)有機(jī)磷的含量和水解量調(diào)整。

本發(fā)明以氧化石墨烯作為有機(jī)磷水解模擬酶的基質(zhì)，首先將氧化石墨烯接枝甲基丙烯酸羥乙酯，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯，然后通過(guò)聚合的方法，用交聯(lián)劑二乙烯基苯將1-乙烯基咪唑與乙烯基功能化的氧化石墨烯共同聚合，在聚合過(guò)程中加入ZnCl₂與1-乙烯基咪唑配位，將1-乙烯基咪唑共價(jià)接枝在乙烯基功能化的氧化石墨烯表面，得到新型有機(jī)磷水解模擬酶——聚合物微球功能化氧化石墨烯。

本發(fā)明所采用的氧化石墨烯具有穩(wěn)定的機(jī)械性能、優(yōu)良的親水性、大的比表面積，最重要的是其表面及邊緣含有較多含氧基團(tuán)，如羥基、羧基和環(huán)氧基，可進(jìn)一步功能化，并且由于氧化石墨烯富含含氧官能團(tuán)，具有過(guò)氧化氫水解酶的催化活性，可以共同參與構(gòu)建酶活性中心，協(xié)同1-乙烯基咪唑催化水解對(duì)氧磷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同條件下，本發(fā)明聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基對(duì)氧磷的初速度相對(duì)于空白對(duì)照提高了230倍，其催化乙基對(duì)氧磷水解反應(yīng)的最大初速度V_max為0.014mmol/L·min、米氏常數(shù)K_m為13.4mmol/L，且具有較好的重復(fù)利用率，在重復(fù)使用5次后水解活性?xún)H下降約5.2％。本發(fā)明聚合物微球功能化氧化石墨烯在降解有機(jī)磷毒物和檢測(cè)有機(jī)磷類(lèi)仿生傳感器的構(gòu)建方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1得到的乙烯基功能化的氧化石墨烯的掃描電鏡圖。

圖2是實(shí)施例1得到的聚合物微球功能化氧化石墨烯的掃描電鏡圖。

圖3是對(duì)比例1得到的組氨酸功能化氧化石墨烯的掃描電鏡圖。

圖4是氧化石墨烯(a)、組氨酸功能化氧化石墨烯(b)、乙烯基功能化的氧化石墨烯(c)、聚合物微球功能化氧化石墨烯(d)的紅外光譜圖。

圖5是氧化石墨烯(a)、組氨酸功能化氧化石墨烯(b)、羧基化的氧化石墨烯(c)、乙烯基功能化的氧化石墨烯(d)、聚合物微球功能化氧化石墨烯(e)的拉曼光譜圖。

圖6是實(shí)施例1得到的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基對(duì)氧磷生成的對(duì)硝基苯酚在400nm處的紫外吸收光譜圖。

圖7是實(shí)施例1～3得到的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基對(duì)氧磷的動(dòng)力學(xué)曲線圖。

圖8是空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及對(duì)比組催化降解乙基對(duì)氧磷的動(dòng)力學(xué)曲線圖。

圖9是實(shí)施例1得到的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基對(duì)氧磷的Lineweaver-Burk圖。

圖10是實(shí)施例1得到的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基對(duì)氧磷的重復(fù)使用效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

1、氧化石墨烯接枝甲基丙烯酸羥乙酯

稱(chēng)取200mg氧化石墨烯(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司)加入100mL去離子水中，超聲分散1小時(shí)，再加入12g NaOH，超聲分散30分鐘，然后加入10g氯乙酸，超聲分散2小時(shí)，離心分離，將離心所得固體用甲醇洗滌離心3次后，在55℃下真空干燥12小時(shí)，得到羧基化的氧化石墨烯；將羧基化的氧化石墨烯加入20mL N,N-二甲基甲酰胺中，超聲分散30分鐘，然后加入40mL氯化亞砜，回流反應(yīng)24小時(shí)，所得產(chǎn)物經(jīng)離心分離、無(wú)水四氫呋喃洗滌3次、55℃真空干燥12小時(shí)，得到酰氯化的氧化石墨烯；將酰氯化的氧化石墨烯超聲分散于20mL無(wú)水N,N-二甲基甲酰胺中，加入1.6g甲基丙烯酸羥乙酯，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢滴加0.4g無(wú)水三乙胺，回流反應(yīng)24小時(shí)，產(chǎn)物經(jīng)甲醇離心洗滌、55℃真空干燥12小時(shí)，得到乙烯基功能化的氧化石墨烯(見(jiàn)圖1)。

2、合成聚合物微球功能化氧化石墨烯

將50mg乙烯基功能化的氧化石墨烯加入到40mL乙腈與甲醇的體積比為9:1的混合液中，室溫超聲1小時(shí)，再加入0.075g ZnCl₂、0.050g甲基丙烯酸、0.425g1-乙烯基咪唑、0.850g二乙烯基苯，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入0.400g偶氮二異丁腈，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)、室溫條件下，用波長(zhǎng)為365nm的紫外光照射48小時(shí)，并且照射過(guò)程中間歇攪拌，照射完后離心分離，所得固體經(jīng)甲醇洗滌3次后離心分離，再用8mL 100mmol/L ZnCl₂的甲醇溶液孵育30分鐘，離心分離，45℃真空干燥12小時(shí)，得到聚合物微球功能化氧化石墨烯(見(jiàn)圖2)。

對(duì)比例1

將0.1550g組氨酸溶解在5mL去離子水中，加入0.0225g ZnCl₂，室溫?cái)嚢?0分鐘后加入50mg氧化石墨烯，超聲分散1小時(shí)，加入5mL 200mmol/L NaOH水溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)，離心分離，將離心所得固體用乙醇洗滌至溶液呈中性，然后用100mmol/L ZnCl₂的甲醇溶液孵育30分鐘，離心分離，50℃真空干燥12小時(shí)，得到組氨酸功能化氧化石墨烯(見(jiàn)圖3)。

由圖1～3可見(jiàn)，氧化石墨烯接枝甲基丙烯酸羥乙酯后，光滑、平整的表面呈現(xiàn)出稠密和高度交聯(lián)的形態(tài)，表明甲基丙烯酸羥乙酯有效接枝到了酰氯化的氧化石墨烯表面，進(jìn)一步通過(guò)聚合的方法，用二乙烯基苯將1-乙烯基咪唑與乙烯基功能化的氧化石墨烯共同聚合，在氧化石墨烯表面形成了粒徑為2～3μm的微球，并且微球分布均勻，即得到了聚合物微球功能化氧化石墨烯；而對(duì)比例1中接枝組氨酸的氧化石墨烯只是表面變得粗糙、不平整，并且厚度增加，未形成微球。

由圖4可見(jiàn)，曲線c在1707cm^-1處的吸收峰是由于C＝C的伸縮振動(dòng)引起的，而曲線d在1707cm^-1處沒(méi)有峰，說(shuō)明乙烯基功能化的氧化石墨烯通過(guò)雙鍵共價(jià)接枝了1-乙烯基咪唑。同時(shí)，曲線b和曲線d在1370cm^-1處的弱吸收峰是由于C-N的伸縮振動(dòng)峰。綜上所述，成功合成了組氨酸功能化氧化石墨烯和聚合物微球功能化氧化石墨烯。

由圖5可見(jiàn)，在1348cm^-1和1594cm^-1處明顯有兩個(gè)吸收峰，分別是D峰和G峰，D峰是由無(wú)序的sp³雜化的碳結(jié)構(gòu)引起的，G峰是由sp²雜化的碳產(chǎn)生的有序的結(jié)晶石墨狀結(jié)構(gòu)引起的。氧化石墨烯、組氨酸功能化氧化石墨烯、羧基化的氧化石墨烯、乙烯基功能化的氧化石墨烯和聚合物微球功能化氧化石墨烯的拉曼光譜峰強(qiáng)度比例I_(D)/I_(G)分別為0.593、0.602、0.709、0.925、0.729。一般而言，碳材料的無(wú)序程度即sp³雜化的碳隨I_(D)/I_(G)增加而增加，這進(jìn)一步說(shuō)明了成功合成了乙烯基功能化的氧化石墨烯，而聚合物微球功能化氧化石墨烯的I_(D)/I_(G)反而降低，是由于聚合物均勻接枝在氧化石墨烯表面，遮蓋了碳信號(hào)。

實(shí)施例2

在實(shí)施例1的步驟2中，將乙烯基功能化的氧化石墨烯用量減少至25mg，其他步驟與實(shí)施例1相同，得到聚合物微球功能化氧化石墨烯。

實(shí)施例3

在實(shí)施例1的步驟2中，將乙烯基功能化的氧化石墨烯用量增加至100mg，其他步驟與實(shí)施例1相同，得到聚合物微球功能化氧化石墨烯。

實(shí)施例4

實(shí)施例1～3合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯在催化降解乙基對(duì)氧磷中的應(yīng)用

將2mg聚合物微球功能化氧化石墨烯分散在100μL乙腈中，加入875μL20mmol/L pH＝9.0的Tris-HCl緩沖液，超聲分散30分鐘，然后加入25μL100mmol/L乙基對(duì)氧磷乙腈溶液，在30℃振蕩，分別在不同的時(shí)刻取50μL反應(yīng)液，用450μL去離子水稀釋?zhuān)x心，取上清液450μL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)400nm處對(duì)硝基酚的吸收峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6和7。

由圖6和7可見(jiàn)，實(shí)施例1～3合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解的活性均較高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，乙基對(duì)氧磷的水解量在快速增加，表明本發(fā)明聚合物微球功能化氧化石墨烯能夠有效地催化乙基對(duì)氧磷水解反應(yīng)，其中實(shí)施例1合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯的活性最高。

為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人按照實(shí)施例4的方法，將實(shí)施例1合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯(實(shí)驗(yàn)組)與對(duì)比例1得到的組氨酸功能化氧化石墨烯(對(duì)比組)催化降解乙基對(duì)氧磷的活性進(jìn)行比較，同時(shí)做空白對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖可見(jiàn)，在相同條件下，對(duì)比例1得到的組氨酸功能化氧化石墨烯催化降解乙基對(duì)氧磷的活性很差，與空白對(duì)照組相差不大，而實(shí)施例1合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯催化降解乙基對(duì)氧磷的初速度相對(duì)于空白對(duì)照組提高了230倍。說(shuō)明本發(fā)明合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯能夠高效催化降解有機(jī)磷。

為了研究聚合物微球功能化氧化石墨烯水解乙基對(duì)氧磷的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)明人將2.0mg聚合物微球功能化氧化石墨烯分散到20mmol/L pH＝9.0的Tris-HCl緩沖液中，然后加入不同體積的100mmol/L乙基對(duì)氧磷乙腈溶液，使反應(yīng)體系的總體積為1mL，乙基對(duì)氧磷的最終濃度分別為1.0、1.25、1.65、2.5、5.0和7.5mmol/L，在30℃下振蕩，分別在0.5、2.5、5、7.5、10、15、20、30、40、50、60分鐘時(shí)取50μL混合液，用450μL水將之稀釋?zhuān)x心(10000rpm，1min)，取450μL上清液于比色皿中，然后測(cè)定對(duì)硝基苯酚在400nm處的吸光度。

以Michaelis-Menten酶動(dòng)力學(xué)模型來(lái)評(píng)價(jià)聚合物的催化水解活性。米氏動(dòng)力學(xué)方程式：V₀＝V_max[S]/(K_m+[S])，V₀表示反應(yīng)的初速度，V_max表示反應(yīng)的最大初速度，[S]表示底物濃度，K_m是米氏常數(shù)，表示底物與酶的親和力，K_m值越小，親和力越高，反之，K_m值越大，親和力越低。為了測(cè)定V_max與K_m的值，乙基對(duì)氧磷的濃度范圍被確定為1.0～7.5mmol/L。在pH＝9.0，聚合物微球功能化氧化石墨烯濃度為2.0mg/mL條件下，測(cè)定聚合物微球功能化氧化石墨烯對(duì)不同濃度乙基對(duì)氧磷催化水解的紫外可見(jiàn)吸收光譜，從而可得乙基對(duì)氧磷水解反應(yīng)的初始速度V₀，以反應(yīng)初速度的倒數(shù)1/V₀和底物濃度的倒數(shù)1/[S]作圖，可得Lineweaver-Burk曲線，如圖9。從圖9中曲線的截距和斜率可得V_max為0.014mmol/L·min，K_m為13.4mmol/L。

為了研究聚合物微球功能化氧化石墨烯水解乙基對(duì)氧磷的重復(fù)使用效果，發(fā)明人將2mg聚合物微球功能化氧化石墨烯分散在100μL乙腈中，加入875μL20mmol/LpH＝9.0的Tris-HCl緩沖液，超聲分散30分鐘，然后加入25μL100mmol/L乙基對(duì)氧磷乙腈溶液，在30℃振蕩，反應(yīng)5小時(shí)后取50μL反應(yīng)液，用450μL去離子水稀釋?zhuān)x心，取上清液450μL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)400nm處對(duì)硝基酚的吸收峰。并將離心所得固體用乙腈和乙醇分別洗滌后，在100mmol/L ZnCl₂甲醇溶液中孵育30分鐘，離心分離，45℃真空干燥12小時(shí)，所得固體再重復(fù)使用，共重復(fù)5次。重復(fù)使用效果見(jiàn)圖10。由圖可見(jiàn)，本發(fā)明合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯在重復(fù)使用時(shí)依舊保持較好的降解催化乙基對(duì)氧磷活性，使用第5次后降解催化活性?xún)H下降約5.2％，說(shuō)明本發(fā)明合成的聚合物微球功能化氧化石墨烯可以再生，并且仍保持較好的對(duì)氧磷的降解催化活性。